三聚氰胺的創新免疫原製備方法及自由態三聚氰胺的免疫分析方法開發

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系. 博士論文. 三聚氰胺的創新免疫原製備方法及自由態三聚氰胺的免疫分析方法開發 A novel method for preparation of melamine immunogen and the development of immunoassay for free melamine.. 研究生：林哲雄 Che-Hsiung Lin. 指導教授：王玉麒博士 Dr. Yu-Chie Wang. 中華民國 107 年 7 月.

(2) 摘要本研究主要是探討將分子量小且不具免疫原性的半抗原直接聚合成為免疫原的方法。三聚氰胺是一種半抗原，它無法有效激活動物的體液免疫反應；為了使動物產生對應的抗體，並免除載體蛋白的使用，我們嘗試以戊二醛引發三聚氰胺的交聯聚合反應，並以此複合物對動物進行免疫注射。研究結果顯示，在所設定的實驗條件下，已有 75〜80％的三聚氰胺被聚合，這些聚合的三聚氰胺顆粒分析其重量平均分子量（Mw）為 17842 Da；我們證明聚合的三聚氰胺可以成功地激活小鼠和兔子的免疫反應產生對應抗體，所生產的單株抗體顯示對三聚氰胺具高度專一性，而對類緣物資三聚氰胺二醯胺、三聚氰胺一醯胺與三聚氰酸等，皆僅有相當低的交叉反應性（0.92％，1.31％，0.89％）。藉此開發的競爭性酵素連結免疫吸附分析方法，其適用於檢測三聚氰胺水溶液濃度範圍為 10-1 至 104 ng / mL；另外，我們使用自由態的三聚氰胺作為包被抗原使其直接吸附於親水性的免疫分析盤上，而不需要另將其結合於蛋白質上。我們的研究透露出具有特定官能基（如胺基或羧基）的半抗原可以藉由加入特定的交聯劑而聚合形成大的聚合物，本方法不僅簡化了免疫原製備的程序，而且還可消除使用載體時所附隨的相關問題，因此，它可以說是免疫原製備的全新發展。 I.

(3) 關鍵字：半抗原、免疫原、三聚氰胺、戊二醛、競爭性酵素連結免疫吸附分析. II.

(4) Abstract In this study, we provide methods for directly polymerizing small and non-immunogenic haptens into immunogens. Melamine is a hapten and ineffective in inducing humoral immune response in animals. In order to make melamine hapten immunogen successfully generate specific antibodies, we tried to cross-link melamine via glutaraldehyde mediated polymerization. Our results showed that 75~80% of melamine had been polymerized under the adopted experimental condition. The polymerized melamine analysed that the weight-average molecular weight (Mw) of particle is 17842 dalton. We proved that the polymerized melamine is an effevtive immunogen to elicit antibodies in both mice and rabbits. The elicited monoclonal antibodies exhibited a high specificity with low cross-reactivity (0.92%, 1.31%, 0.89%) toward ammeline, ammelide and cyanurate. The developed competitive enzyme-linked immunosorbent assay (cELISA) method is applicable in the range of 10-1 to 104 ng/mL melamine in buffer solution. In addition, we found the free form of melamine coulded be used as coating antigen directly attaching to hydrophilic ELISA plate and with no conjugated protein. Our study discloses the fact that a hapten with specific functional group (such as amine or carboxyl group) may be polymerized into a big complex by adding a particular cross-linking agent. The method not only simplifies the procedures of immunogen preparation but also eliminate the involvement of carriers and their concomitant problems. Therefore, it can be considered as a new development of immunogen preparation.. III.

(5) Key words : hapten, immunogen, melamine, glutaraldehyde, competitive enzymelinked immunosorbent assay (cELISA). IV.

(6) 目錄中文摘要..................................................................................................... I 英文摘要................................................................................................... III 壹、前言..................................................................................................... 1 一、三聚氰胺簡介 ............................................................................. 2 1. 三聚氰胺基本性質 ......................................................................... 2 2. 三聚氰胺用途 ................................................................................. 2 3. 三聚氰胺毒性 ................................................................................. 3 4. 三聚氰胺的容許量 ......................................................................... 4 5. 人類攝入三聚氰胺的來源 ............................................................. 5 6. 三聚氰胺的儀器分析 ..................................................................... 8 二、免疫分析方法 ........................................................................... 11 1. 半抗原 ........................................................................................... 13 2. 目前將半抗原製備成免疫原的方法 ........................................... 14 3. 半抗原修飾設計與免疫原合成製作之考量因素 ....................... 16 4. 目前已研究發展出的三聚氰胺免疫原與包被抗原製作方法 ... 19 5. 目前已發展之三聚氰胺免疫分析方法及偵測能力 ................... 22.

(7) 三、. 研發新的免疫分析技術 ......................................................... 23. 貳、材料與方法 ...................................................................................... 25 一、儀器設備 ................................................................................... 25 二、化學試藥與常用溶液 ............................................................... 25 1. 化學試藥 ....................................................................................... 25 2. 常用溶液 ....................................................................................... 26 三、方法 ........................................................................................... 27 1. 免疫原製備 ................................................................................... 27 2. 三聚氰胺聚合反應的上清液(supernatant)分析 .......................... 27 3. 三聚氰胺的聚合比例分析 ........................................................... 28 4. 三聚氰胺聚合物的分子量分析 ................................................... 29 5. 動物免疫實驗 ............................................................................... 30 6. 間接性酵素連結免疫吸附分析 ................................................... 32 7. 小鼠抗血清中標的抗體之分型(isotyping)鑑別試驗 ................. 33 8. 細胞融合(cell fusion)與單株抗體純化(purification) .................. 33 9. 競爭性酵素連結免疫吸附分析 ................................................... 37 10.單株抗體的專一性測試 ............................................................... 38.

(8) 11.美耐皿餐具的三聚氰胺熱溶出處理 ........................................... 39 12.熱溶出三聚氰胺樣品之免疫分析與儀器分析 ........................... 40 參、結果................................................................................................... 42 一、三聚氰胺與戊二醛混合反應的水相成分分析 ....................... 42 二、三聚氰胺的交聯聚合比例分析 ............................................... 44 三、三聚氰胺聚合物的分子量分析 ............................................... 48 四、影響三聚氰胺聚合反應的因素探討 ....................................... 50 五、對應三聚氰胺的抗血清生產與 iELISA 分析......................... 53 六、小鼠抗血清中標的抗體的分型檢測 ....................................... 53 七、融合瘤細胞株篩選單株抗體結果 ........................................... 54 八、單株抗體的三聚氰胺分析 ....................................................... 54 九、單株抗體對三聚氰胺類緣物質的反應性比較 ....................... 55 十、三聚氰胺的免疫分析與儀器分析比較 ................................... 56 十一、免疫分析的同日間與異日間變異情形 ................................... 57 肆、討論................................................................................................... 59 一、三聚氰胺與戊二醛的聚合反應情形推測 ............................... 59 二、聚合半抗原成為免疫原方法的擴大延伸與其應用 ............... 60.

(9) 1. 聚合方法可延伸至其他化學物質 ............................................... 60 2. 具有多個相同官能基的分子其抗體生產應用 ........................... 61 三、半抗原聚合方法中交聯劑結構因素的考量 ........................... 62 四、免疫反應中交聯劑抗體的生成 ............................................... 63 五、三聚氰胺聚合物激活動物免疫反應探討 ............................... 63 六、本研究抗體生產成果 ............................................................... 65 七、免疫原製備與分析方法的探討 ............................................... 66 1. 三聚氰胺聚合方法的反應溫度 ................................................... 66 2. 免疫原分子量的重複性測試 ....................................................... 66 3. G10 膠體管柱分析圖之面積計算 ............................................. 67 4. 包被抗原的吸附反應時間 ........................................................... 67 5. cELISA 方法中競爭劑與抗體添加方式 ................................... 68 八、本研究方法之優勢 ................................................................... 68 1. 免疫原的製備技術 ....................................................................... 69 2. 單株抗體的篩選方式 ................................................................... 69 3. 檢測方法的開發 ........................................................................... 70 4. 未來的應用發展潛力 ................................................................... 70.

(10) 伍、參考資料........................................................................................... 72 一、網路 ........................................................................................... 72 二、專利 ........................................................................................... 73 三、期刊 ........................................................................................... 73 陸、圖....................................................................................................... 87 柒、表..................................................................................................... 123 捌、附錄................................................................................................. 138 一、英文與中文名稱對照表 ......................................................... 138 二、英文名稱與縮寫對照表 ......................................................... 144 三、溶液配製表 ............................................................................. 146 四、美國發明專利文件 ................................................................. 147 五、投稿期刊 ................................................................................. 155.

(11) 圖目錄圖 1. 三聚氰胺的化學結構 .................................................................... 87 圖 2. 三聚氰胺-三聚氰酸複合物 ........................................................... 88 圖 3. 可能導致三聚氰胺暴露來源的農藥(a)賽滅淨與清潔劑(b)三氯三聚氰胺的化學結構 .................................................................... 89 圖 4. 將半抗原製成免疫原的傳統方法與動物生成抗體的常見結果 90 圖 5. 戊二醛的交聯反應 ........................................................................ 91 圖 6. 碳二亞胺參與的分子交聯反應 .................................................... 92 圖 7. 經前人研究的三聚氰胺化學修飾方法 ........................................ 94 圖 8. cELISA 的反應原理 ....................................................................... 97 圖 9. 三聚氰胺的側流免疫層析檢片原理 ............................................ 98 圖 10.三聚氰胺與戊二醛混合反應的水相成分分析 .......................... 100 圖 11.以分光光度計分析三聚氰胺的吸光值變化情形 ...................... 102 圖 12.三聚氰胺聚合反應之 G10 膠體管柱分析 ................................. 103 圖 13.三聚氰胺聚合反應之 HPLC 分析 .............................................. 104 圖 14.溫度對三聚氰胺聚合反應的影響 .............................................. 107 圖 15.三聚氰胺聚合期間，反應液的 OD600 吸光值變化情形 ........ 109 圖 16.提昇三聚氰胺聚合反應溫度，反應液的 OD600 吸光值變化情形............................................................................................................. 110.

(12) 圖 17.抗血清的三聚氰胺分析結果 ...................................................... 111 圖 18.小鼠抗血清中，三聚氰胺標的抗體之分型檢測結果 .............. 112 圖 19.以單株抗體對三聚氰胺進行 cELISA 的結果 ........................... 113 圖 20.三聚氰胺及其類緣物質之分子構造圖 ...................................... 115 圖 21.三聚氰胺與戊二醛的聚合反應情形推測 .................................. 116 圖 22.三聚氰胺與檸檬酸的聚合反應 .................................................. 118 圖 23.三聚氰胺與 EDTA 的聚合反應 .................................................. 119 圖 24. EDTA 與 1,4 -丁二醇的聚合反應.............................................. 120 圖 25.檸檬酸三鈉與 1,4 -丁二醇的聚合反應 ...................................... 121 圖 26.檸檬酸與丙三醇的聚合反應 ...................................................... 122.

(13) 表目錄表 1. 人體的三聚氰胺每日耐受量 ...................................................... 123 表 2. 現有三聚氰胺的儀器分析種類與偵測極限 .............................. 124 表 3. 檢驗食品中三聚氰胺含量的前處理萃取(a)與淨化(b)步驟 ..... 126 表 4. Yin et al. (2010)研究三聚氰胺半抗原修飾(a)與免疫原合成(b)之步驟與時間 .................................................................................. 128 表 5. 目前已發展之三聚氰胺免疫分析方法及偵測能力 .................. 130 表 6. 以 GPC 分析三聚氰胺聚合物的分子大小與分佈 .................... 131 表 7. 不同反應條件下，三聚氰胺與戊二醛聚合反應液的觀察比較 ....................................................................................................... 132 表 8. 單株抗體對三聚氰胺及其類緣物質的反應分析結果 .............. 133 表 9. 三聚氰胺檢體的免疫分析與儀器分析結果比較 ...................... 134 表 10.以 cELISA 檢測三聚氰胺之同日間與異日間分析變異情形 ... 135 表 11.本研究與前人研究在免疫原與包被抗原製備及分析方法的比較 ....................................................................................................... 136 表 12. T 細胞依賴 (T cell-dependent)與 T 細胞非依賴 (T cellindependent)途徑差異 ................................................................. 137.

(14) 壹、前言化學物質的儀器分析方法常需先將檢體經過萃取與純化的前處理後，才使用精密儀器進行分析 (Nakamura et al., 2011; Scheidweiler et al., 2012; Hu et al., 2017)，這些樣品前處理的過程往往複雜、耗時，且分析儀器的價格大多昂貴，再者整個分析流程還需由受過高度專業訓練的人員來操作，故較難被普遍推廣，常僅適用於在特定的實驗室內進行檢測。為了克服上述儀器分析之缺點，利用抗原 (antigen)與抗體(antibody)間具有高親和力(affinity)與高專一性 (specificity)之免疫化學分析技術已被開發應用於化學物質的檢測 (Darwish, 2006; Ricci et al., 2007; Tian et al., 2012)，一旦生成可專一辨識特定化學物質之標的抗體，即可用來發展簡易且靈敏度高的免疫吸附檢測方法 (García-Nieto et al., 2010; Huang et al., 2010)或製備側流免疫層析試紙 (lateral-flow immunochromatographic strip)的快篩套組 (Ching et al., 2012; Wang et al., 2014)，以便用於現場檢測與即時結果的判讀。此外，由於免疫化學技術尚具有節省時間、經費與方便操作及可同時大量檢測樣品之優點，故已在醫學、食品與環境等檢測分析上被廣泛應用 (Graham and Christopher, 2004; Ahn et al., 2011; Lu et al., 2013)。可惜的是，在各種化學物質中，小分子的成分很難用以生產抗 1.

(15) 體；此外，即便有了目標抗體之後，免疫分析方法的開發也有諸多困難，本研究的重點即在以三聚氰胺為範例，探討如何有效生產對應小分子的抗體及開發其免疫分析技術。一、. 三聚氰胺簡介. 1. 三聚氰胺基本性質三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環有機化合物，分子式為 C3H6N6，分子量 126.12 道爾頓(dalton, Da)，俗稱密胺、氰尿醯胺、三聚醯胺或蛋白精，國際純化學和應用化學聯合會 (International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC)將其命名為 1,3,5-triazine-2,4,6-triamine (圖 1)。三聚氰胺是白色單斜晶體，幾乎無味，密度為 1.574 g/cm3，熔點為 250 °C，可微溶於水（20°C 時的溶解度為 3.1g/L），可溶於甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油和吡啶等，但不溶於丙酮和醚類 (Hau et al., 2009)。 2. 三聚氰胺用途三聚氰胺主要的工業用途是作為生產熱固性三聚氰胺甲醛樹脂（melamine formaldehyde resin）的原料，該原料常被用於美耐皿餐具的製作。再者，由於該樹脂的硬度比尿素甲醛樹脂（urea formaldehyde resin）的高，不易燃，且耐水、耐熱、耐老化、耐電弧及耐化學腐蝕，有良好的絕緣性、光澤度和機械強度，故亦 2.

(16) 運用於木材、塑膠、塗料、造紙、紡織、皮革、電氣及醫藥等領域 (Tyan et al., 2009)；此外，三聚氰胺也是塑膠著色用「黃色 150（yellow 150）」染料的主要成分 (Hau et al., 2009)。 3. 三聚氰胺毒性對人體而言，三聚氰胺屬於低毒性物質，雖然一般成年人能排出大部分攝入的三聚氰胺，但若長期攝入三聚氰胺仍可能造成生殖能力損害、膀胱或腎結石及膀胱癌等問題(Skinner et al., 2010)。依據行政院環境保護署(環保署)公告之安全資料表(環保署列管編號：185-01)中的毒性資料顯示，三聚氰胺的暴露途徑主要包括皮膚接觸、吸入、食入與眼睛接觸等方面。在動物急毒性的研究上，半致死劑量[Lethal Dose, 50%, (LD50)]的數據顯示 LD50(測試動物、吸收途徑) 為 3161 mg/kg (大鼠、吞食)與 > 1000 mg/kg (兔子、皮膚)；在動物慢毒性的研究上，狗在連續 60 至 90 天期間每天餵食 30 mg/kg 後，可持續 1 年內在其尿中發現有結晶物質之現象。另外，亦有相關慢毒性的研究顯示，將大鼠每天餵食高劑量 4.5 mg/kg 並持續 103 週後，會造成其膀胱結石，並增加其膀胱、尿道出現惡性腫瘤的風險 (Melnick et al., 1984; Ogasawara et al., 1995; Wen et al., 2016)。 Dobson et al. (2008)發現寵物如食用受到三聚氰胺污染的飼 3.

(17) 料，其腎臟內會形成三聚氰胺-三聚氰酸(melamine cyanurate)的結晶並沉積於腎小管。因此，有學者提出三聚氰胺進入人體後，可能在胃的強酸性環境中會有部分水解成三聚氰酸，三聚氰胺與三聚氰酸兩者藉由小腸吸收進入血液循環系統，再進入腎臟，並在腎細胞中兩者再次結合形成三聚氰胺-三聚氰酸的大分子複合物(圖 2) (Skinner et al., 2010)，經持續沉積而形成腎結石，造成腎小管堵塞，最終導致腎衰竭 (Bhalla et al., 2009; Hau et al., 2009)。由於三聚氰胺微溶於水，在經常飲水的成年人體內較不易形成三聚氰胺結石，但對於飲水較少且腎臟較小的哺乳期嬰兒體內，則較易形成結石而發生病變。 4. 三聚氰胺的容許量為因應 2007 年寵物飼料摻含三聚氰胺的事件，美國食品藥物管理局（Food and Drug Administration, FDA）於 2007 年發布風險評估報告，指出人體的三聚氰胺每日耐受量(tolerable daily intake, TDI）為 0.63 毫克／每公斤體重／天（mg/kg bw/day）。此數值是根據持續 13 週的大鼠實驗中，沒有可觀察到的不良影響值（no observed adverse effect level, NOAEL）為 63 mg/kg bw/day，再考量物種間的差異，除以 100 的安全系數（safety margin）算得。2008 年時，FDA 進一步把 TDI 數值 0.63 mg/kg 4.

(18) bw/day 再除以安全係數 10，下修得到應對健康無害的三聚氰胺攝取量為 0.063 mg/kg bw/day；在此標準下，體重 60 公斤的成年人即使每天進食 1.5 公斤遭三聚氰胺污染的食物，只要該污染食物中的三聚氰胺濃度低於 2.5 ppm，應不致造成立即的健康風險；至於歐洲食品安全局（European Food Safety Authority, EFSA）則將 TDI 訂為 0.5 mg/kg/day，而世界衛生組織(World Health Organization, WHO) 則是將 TDI 訂為 0.2 mg/kg/day (Skinner et al., 2010)，上述資料的綜合整理如表 1。 5. 人類攝入三聚氰胺的來源依據國內的研究報告顯示(國家環境毒物研究中心, 2014)，人類攝入三聚氰胺的來源包含以下四大類： Ⅰ. 蓄意添加於食品：部分民眾有錯誤迷思，認為食品中的蛋白質含量越高，其營養價值亦越高，導致有不肖廠商為誤導販售產品的蛋白質含量高，而違法添加三聚氰胺於食品原料中。何以添加三聚氰胺可誤導產品中的蛋白質含量呢？這是由於檢測機構常利用凱氏氮定量法(Kjeldahl nitrogen method) (Finete Vde et al., 2013)，來分析乳製品或飼料中的蛋白質含量，該方法假定食品中的蛋白質為唯一的氮素來源，故把氮含量的檢測值乘上 5.

(19) 6.25（1 g 的蛋白質含有約 0.16 g 的氮）即為推定的蛋白質含量。由於三聚氰胺的含氮比例高[66％ (w/w)]，因此如在 1 公升牛奶中加入 1 公克的三聚氰胺，即可誤導增加 0.4％以上的蛋白質含量 (Hau et al., 2009; Wei et al., 2010)。上述違法添加三聚氰胺於食品原料的事件中，較重大的案例為 2007 年時，美國 FDA 調查發現，從中國大陸進口的小麥蛋白粉和大米蛋白粉中，部分檢出三聚氰胺，由於這些植物蛋白是被用來加工成為寵物食品的原料之一，致使寵物食品內含有三聚氰胺，當貓、狗長期攝入這些寵物食品時，有可能會引發腎衰竭而死亡 (FDA , 2008; Skinner et al., 2010)。再者，中國大陸於 2008 年時發生奶粉添加三聚氰胺事件，估計有 29 萬 4,000 名嬰兒受害者，結果其中有 5 萬 2,000 名住院，6 名死於腎結石和其他腎損害 (Skinner et al., 2010; Wen et al., 2016)。 Ⅱ. 美耐皿餐具的熱溶出：美耐皿餐具遇熱與遇酸後會釋出三聚氰胺，且反應溫度愈高，釋出量愈多 (Chien et al., 2011)。國內衛生福利部食品藥物管理署(食藥署)，曾對市售美耐皿餐具的三聚氰胺溶出情形進行探討，實驗以 4%醋酸溶液加入餐具樣品內，再將餐 6.

(20) 具樣品置於 95℃的水浴槽加熱 30 分鐘，結果顯示 52 件美耐皿餐具樣品的三聚氰胺溶出量平均值為 0.45 ppm，其中僅有 1 件未檢出三聚氰胺 (張美華等人，2010)。因此，為加強對美耐皿容器、器具之管理，保障民眾飲食衛生安全，食藥署已於 2012 年 1 月 18 日增列「以甲醛-三聚氰胺為合成原料之塑膠」為管制項目，並於 2013 年訂定其三聚氰胺溶出限量標準為 2.5 ppm 以下(食藥署，2013)，而歐盟（European Union, EU）則訂定美耐皿餐具的三聚氰胺溶出限量在 30 ppm 以下 (EU, 2002)。另外，Chien et al. (2011)等人的研究顯示，5 組不同的美耐皿餐於加入 50~60℃的蒸餾水後，再置於 50~60℃的水浴槽加熱 30 分鐘，可測知其釋出之三聚氰胺濃度界於 0.05~0.57 μg/mL 範圍，平均值則為 0.197 μg/mL；根據此數據我們可以推估，食用一碗以美耐皿餐具盛裝的 700 mL 熱湯，三聚氰胺溶出量約 0.1379 mg (0.197 μg/mL × 700 mL = 137.9 μg)。依照美國 FDA 所訂定的 TDI 值 0.063 mg/kg bw/day，則一位 60 公斤體重的成年人每天要攝取達 3.78 mg 才可能有健康危害風險；因此，每位成年人若每天僅食用一碗由美耐皿餐具所盛裝的熱湯，則應未逹健康危害風險；然而，對於國內七成 7.

(21) 以上的外食族而言，長時間三餐外食所造成的三聚氰胺暴露風險仍是值得注意。 Ⅲ. 農藥與動物飼料的轉移：殺蟲劑賽滅淨(cyromazine) (圖 3a)是三聚氰胺的環丙基衍生物，在動植物體內可能有少部份會代謝成三聚氰胺 (Yu et al., 2010; Ge et al., 2016)。另外，若以含三聚氰胺的飼料餵飼禽畜，亦可能會在動物體內殘留，再經由食物鏈而進入人體 (國家環境毒物研究中心, 2014)。 Ⅳ. 食品製程中的殘留：三氯三聚氰胺（trichloromelamine）(圖 3b)為清潔劑，應用時常會分解成為三聚氰胺，若有殘留則可能污染食物 (WHO, 2009)。另外，食品罐頭的包裝塗料成份中如含有三聚氰胺，亦可能造成污染而進入人體 (國家環境毒物研究中心, 2014)。 6. 三聚氰胺的儀器分析目前常用於檢測三聚氰胺的儀器主要包括有：高效液相層析儀（high performance liquid chromatography, HPLC） (Tang et al., 2009; Wei et al., 2009; Filazi et al., 2012; Finete Vde., 2014; Tsartsali and Samanidou, 2015; Sarafraz Yazdi et al., 2015)、液相層析質譜儀 8.

(22) （liquid chromatograph mass spectrometer, LC/MS） (Varelis and Jeskelis, 2008)、液相層析串聯質譜儀（liquid chromatograph tandem mass spectrometer, LC/MS/MS） (Jia et al., 2009; Braekevelt et al., 2011; Panuwet et al., 2012; Wang et al., 2012; Yun et al., 2013)、氣相層析質譜儀（gas chromatograph mass spectrometer , GC/MS） (Li et al., 2009; Xu et al., 2009; Zhu et al., 2009; Zeng et al., 2013)及氣相層析串聯質譜儀（gas chromatograph tandem mass spectrometer, GC/MS/MS） (Miao et al., 2010; Tzing and Ding, 2010)等(表 2)。檢測的樣品範圍亦相當廣泛，包括有尿液、動物組織、牛奶、乳製品、飼料、蛋、嬰兒食品、土壤等。 LC/MS/MS 因為偵測靈敏度高，是目前最普遍被用來檢測三聚氰胺之儀器，其標準品檢量線的最低偵測濃度常可低至 0.0001 mg/kg (Braekevelt et al., 2011)。HPLC 儀器的偵測靈敏度相對較低，目前多應用於高三聚氰胺樣品的分析；食藥署於 2013 年 11 月 13 日公告的「食品器具、容器、包裝檢驗方法－以甲醛-三聚氰胺為合成原料之塑膠類之檢驗」，其檢驗方法即是採用 HPLC 搭配光二極體陣列(photodiode array, PDA)檢出器的檢測，三聚氰胺的定量極限為 0.5 ppm。 9.

(23) 雖然儀器分析三聚氰胺有極佳之敏感度與準確度，但是亦有許多缺點亟需改善，包括： Ⅰ. 樣品前處理的步驟繁瑣：以美國 FDA 於 2007 年所公布之三聚氰胺檢驗方法 (FDA, 2007, LIB No. 4396)為例，該方法的三聚氰胺樣品前處理即包括 16 個萃取步驟與 11 個淨化步驟(表 3)，處理流程至少需要 1 天的時間，相當耗費時間、人力與經費。 Ⅱ. 分析儀器價格昂貴： HPLC 的價格須花費新臺幣數百萬元，而 LC/MS/MS 更須千萬元以上，購入後另須編列儀器之保養與維修費用，造成相當可觀之經費負擔，故目前無法普遍使用於中、小型之檢測機構。 Ⅲ. 儀器需由受過專業訓練的人員操作：由於上述三聚氰胺的分析儀器皆屬於高度精密設備，故在操作上較為複雜，且須依分析物質的特性選擇適當之層析管柱；此外，針對分析結果，包括層析圖譜、光譜圖或是質譜圖的判定，吸收波峰面積與定量離子之濃度換算，以及儀器故障排除等項目，實驗室的操作人員需要接受相當時間的專業訓練後方能勝任。 10.

(24) Ⅳ. 常僅適用於特定實驗室內：囿於精密的檢測儀器常有場所保存條件(溫度、濕度…等) 之限制，例如質譜儀之置放埸所常需設定溫度於 18 ~ 22℃之恆溫條件，故三聚氰胺的儀器分析設備，並不適合裝置於一般實驗室。 V. 無法進行高通量(high-throughput)的樣品分析：層析儀器的分析每次僅能注射 1 個樣品，此外還要建立標準品之檢量線，故常於 1 天時間內僅能分析不到 20 個實際樣品，若遭逢大量樣品情況，則常無法即時完成檢測。 VI. 無法進行現場檢測：除了儀器本身體積龐大不方便移動外，採樣現場亦常無法有效完成樣品的前處理步驟，是以三聚氰胺的樣品需送回特定實驗室，而不能在現場迅速完成分析與結果判讀。基於儀器分析三聚氰胺常有上述之缺點與限制，目前已陸續開發出相關的免疫分析技術，可提供檢測人員依其需求選擇因應，以下僅將目前三聚氰胺的免疫分析方法進行說明。二、. 免疫分析方法免疫分析(immunoassay)是利用抗原與抗體間具高親和力. (affinity)與專一性(specificity)的特性所發展出來的檢測技術。由 11.

(25) 於具有操作簡單、高專一性、快速、靈敏、檢驗成本低及可同時進行大量樣本檢測等優點，目前已被廣泛應用；包括在臨床領域中它們適用於從蛋白質到小分子的物質分析，在食品與環境檢驗領域上，免疫分析亦常應用於樣品中化學殘留物質分析，以及細菌和病毒的鑑定(Hsieh, 2010)。以目前被普遍應用的 ELISA 免疫分析方法為例，操作過程大多為試劑添加與清洗之簡易步驟，於一般實驗室即可容易進行，又因 1 個免疫分析盤每次可分析數十件樣品，故相當適用於高通量樣品的情況；而分析所使用的酵素免疫分析測讀儀，價格僅需十幾萬元，為多數實驗室能夠負擔。另外，以側流免疫層析試紙為例，目前市面上販售之驗孕片滴入尿液即可檢測人類絨毛膜性腺激素(human chorionic gonadotropin, β-hCG)，一般人即可操作執行，無須在特定環境條件要求之實驗室，也無須使用儀器協助分析，並於數分鐘內即可以肉眼判讀結果。免疫分析方法雖然簡易，但在方法開發成功前，首要的關鍵在於抗體的生產製作；一般來說，蛋白質抗原通常可被直接用於注射動物以激活其免疫系統反應，並產生專一抗體；但是，對於小分子的化學物質來說，目前已開發出能夠對應小分子的抗體研究中，通常都不是直接將小分子化學物質注射於動物體內來產生 12.

(26) 相對應的抗體，而是先修飾小分子其本身部分的官能基，再聯結於蛋白質，才能注射動物並激活其免疫反應。三聚氰胺的抗體也是以此製作方式進行生產(Lei et al., 2010; Yin et al., 2010; Zhou et al., 2012; Cao et al., 2013)，這是什麼原因呢？我們特別闡釋說明如下： 1. 半抗原半抗原(hapten)是指低分子量、能與抗體結合，但無法獨自用以激活動物免疫反應的物質；由於半抗原具有與抗體結合的抗原性(antigenicity)，但不具有可獨自激活動物免疫系統的免疫原性(immunogenicity)，因此又被稱為不完全抗原(incomplete antigen) ( Fuentes et al., 2005; Fodey et al., 2009; Erkes and Selvan, 2014; Al Qaraghuli et al., 2015)。三聚氰胺是分子量 126 Da 的小分子，為典型的半抗原，它不是免疫原(immunogen)，故無法直接激活動物免疫反應產生對應三聚氰胺的抗體。目前在環境、食品與醫學的許多檢測標的皆屬於半抗原，例如四氯雙苯環戴奧辛 (Tian et al., 2012)的分子量為 321.97 Da、殺蟲劑巴拉松(parathion) (Liu et al., 2014)的分子量為 321.97 Da、抗生素磺胺二甲氧密啶（Sulfadimethoxine） (Zhou et al., 2014)的分子量為 310.33 Da、毒品甲基安非他命（methamphetamine） 13.

(27) (Danger et al., 2006)的分子量為 310.33 Da、藥物毛地黃素（Digoxin） (Kashanian et al., 2002)的分子量為 780.938 Da、色素蘇丹紅 1 號(Sudan red I) (Xu et al., 2010)的分子量為 248.28 Da 與荷爾蒙黃體素（Progesterone） (O'Rorke et al., 1994)的分子量為 314.46 Da 等，這些成分皆未達到成為免疫原需要分子量至少為 3000~5000 Da 之條件 (Graham and Christopher, 2004)，故需採用其他方式處理以激活動物的免疫反應，產生對應該小分子化學物質之標的抗體。 2. 目前將半抗原製備成免疫原的方法目前將小分子化學物質製備成免疫原的方法，常以原本小分子化學物質或選擇其類緣物質(analogue compound)為半抗原，保留此半抗原的分子結構特徵，再以化學方法修飾半抗原使其帶有特定的官能基(functional group)，方便與交聯劑進行聯結；然後將此修飾後之半抗原利用交聯劑與具有免疫原性的大分子載體蛋白(carrier protein)聯結，形成半抗原-載體複合物(hapten-carrier complex) (如圖 4a)。當以此複合物對動物進行注射時，可藉由載體蛋白的免疫原性，激活動物的免疫系統，同時也合併產生對應半抗原的抗體 (Singh et al., 2004; Chipinda et al., 2011)。不過在上述方法中，因為用以注射動物之複合物其主要結構 14.

(28) 並不是半抗原化學物質，而是大分子的載體蛋白，故當動物進行免疫反應時，可能主要產生對應載體蛋白的抗體，而複合物中的半抗原可能被載體蛋白的三維結構所掩蓋，導致產生對應半抗原抗體的效果較差(如圖 4b)，故在製備半抗原-載體蛋白複合物時，需有特殊考量對策，以提昇產生對應半抗原的標的抗體機率。目前常使用的大分子載體蛋白包括：牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA） (Chan and Ho, 2002; Huang et al., 2010; Lei et al., 2010; Zhou et al., 2012; Cao et al., 2013)、雞卵清蛋白（ovalbumin, OVA）(Erkes and Selvan, 2014)、鑰孔血藍蛋白（keyhole limpet hemocyanin）(Swaminathan et al., 2014)、甲狀腺球蛋白(thyroglobulin, TG) (Yin et al., 2010)、多聚賴氨酸（poly-llysine）(Green et al., 1966)等；而用以聯結半抗原與載體蛋白的交聯劑主要包括：戊二醛(glutardldehyde) (Chan and Ho, 2002; Mera et al., 2008; Zhou et al., 2012)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基) 碳醯二亞胺[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride , EDC] (Chan and Ho, 2002; Huang et al., 2010; Lei et al., 2010; Yin et al., 2010)、二環已基碳二亞胺 (dicyclohexylcarbodiimide, DCC) (Cao et al., 2013)等。其中，戊二 15.

(29) 醛為兩側具有醛基的分子，可利用醛胺縮合(aldehyde amine condensation)反應將 2 個帶有胺基的分子相互交聯(圖 5)。EDC 與 DCC 本身皆具有碳二亞胺（carbodiimide, N=C=N）官能基團，可將帶有羧基的分子與帶有胺基的分子相互交聯(圖 6a, b)； EDC 或 DCC 常會合併使用 N-羥基琥珀醯亞胺(Nhydroxysuccinimide, NHS)或 N-羥基硫代琥珀醯亞胺(Nhydroxysulfosuccinimde, sulfo-NHS)，主要是 NHS 與帶有胺基的分子在聯結反應上比單純使用 EDC 與 DCC 更有效率；由於 EDC 或 DCC 可先和帶有 COOH 基的分子反應，然後再由 NHS 和此中間產物反應，形成 R1-C=O -NHS 的反應基團，接下來就可以和帶有 R2-NH2 的基團反應，形成穩定的 R1-C=O -NH -R2 鍵結(圖 6c) (Thermo Fisher Scientific, 2017)。此外，為了獲得更好的免疫效果，在對動物注射半抗原-載體蛋白的複合物時，也常合併使用免疫佐劑 (adjuvant)。 3. 半抗原修飾設計與免疫原合成製作之考量因素小分子半抗原並非只要將其聯結至大分子載體蛋白即可成為良好的免疫原，其過程中還有許多需要考量之處，Guomin et al. (2002)曾對半抗原修飾設計與免疫原合成製作提供意見與建議如下： 16.

(30) Ⅰ. 修飾後的半抗原應在分子結構(molecular structure)、立體化學 (stereochemistry)和電子分佈(electron distribution)上與半抗原在修飾前的分子特性儘可能相似 (Xu et al., 2004)。 Ⅱ. 修飾後半抗原的連接臂長度與位置：為能突顯半抗原的分子特徵結構，半抗原和載體蛋白之間常須引入一段連接分子，即所謂的「連接臂 (spacer arm)」。此連接臂最好使用適當長度的碳鏈，如使用較短的連接臂或不使用連接臂，還有連接臂位置不當時，常不能誘發動物免疫反應產生對應半抗原的抗體，這是因為連接臂較短或沒有連接臂時，半抗原有可能被載體蛋白的三維結構所掩蓋，而無法被動物的免疫系統辨識到半抗原的大部分結構特徵。通常連接臂的最適長度在 3 至 6 個直鏈碳原子之間，此時半抗原能夠暴露於載體蛋白的表面，便於動物免疫反應中的抗原呈現細胞（antigen presenting cell, APC）對其識別 (Zhang et al., 2007)；但如連接臂太長又會因為疏水作用而造成長鏈折疊，導致半抗原分子仍然被載體蛋白所掩蓋，不利於 APC 的識別。Zhang et al. (2007)利用殺蟲劑芬殺松(fenthion)，從其分子結構上 5 個不同位置分別聯結上連接臂，製作出 5 種不同的連接臂半抗原 (hapten A~E)進行免疫分析研究，其中 hapten A 的連接臂位 17.

(31) 置，會使芬殺松分子的硫代磷酸酯官能基過於貼近載體蛋白而被掩蓋，故相較其他能夠突顯於載體蛋白上的 hapten B~E，在分別製成免疫原注射動物產生對應抗體後，hapten A 組別在血清抗體效價、ELISA 方法的檢測靈敏度與抗體的專一性上皆較 hapten B~E 低。 III. 半抗原經修飾後所帶的活性官能基團應對半抗原的電子分佈應沒有影響。比較常見的方法是直接修飾半抗原使其帶有(CH2)nCOOH 或是-(CH2)nNH2 等結構的衍生物，這種方法有利於保護半抗原的特徵結構和分子的電子分佈不受影響，但常需要許多步驟反應才能合成 (Fuentes et al., 2005)。例如 Lei et al. (2010)即把三聚氰胺中一端帶有胺基的分子修飾成帶有(CH2)5COOH 的 Hapten 1 或是(CH2)2COOH 的 Hapten 2 (圖 5a)。 IV. 分子量較小的半抗原：根據 Chappey et al. (1994)對抗體親和係數的研究指出，分子量為 334~374 Da 的半抗原誘導產生的抗體，尚具有較高的親和係數，但對於分子量低於 300 Da 的半抗原，獲得高親和力抗體的可能性將顯著下降，導致如果使用酵素連結免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA )時，其方法檢測靈敏度下降。 18.

(32) 4. 目前已研究發展出的三聚氰胺免疫原與包被抗原製作方法目前已發展出的三聚氰胺免疫原與包被抗原(coating antigen) 製作方法(如圖 7)，主要有 4 篇研究。首先在免疫原製作上，Lei et al. (2010)的方法是先將三聚氰胺的類緣物質 2-Chloro-4,6diamino-1,3,5-triazine (CAAT)與 6-氨基己酸(6-Aminocaproic acid) 反應結合，形成圖 7a 所示的 Haptne 1。然後將此修飾後的半抗原以 DCC 與 NHS 交聯劑聯結至 BSA 形成免疫原，據以注射兔子生產對應三聚氰胺的抗血清。 Yin et al. (2010)的方法是先將三聚氰胺與溴乙酸第三丁酯（tert-Butyl bromoacetate）聯結反應成為中間產物，再藉由三氟乙酸（Trifluoroacetic acid, TFA）與石油醚（Petroleum ether）等溶劑作用，將三聚氰胺分子修飾成為其中 1 端胺基連接CH2COOH 基團的半抗原(圖 7b)。然後將此修飾後的半抗原以 EDC 與 NHS 交聯劑聯結至 TG 形成免疫原，據以注射小鼠生產製作對應三聚氰胺的單株抗體。 Zhou et al. (2012)的方法是先將三聚氰胺與戊二醛以醛胺縮合反應聯結成為半抗原(圖 7c)，此半抗原的一側還有 1 個醛基，可與 BSA 上的胺基進行聯結形成免疫原，據以注射小鼠生產製作對應三聚氰胺的單株抗體。 19.

(33) Cao et al. (2013)則是製作 3 種不同連接臂長度的半抗原(圖 7d)，第 1 種半抗原是先將 CAAT 與對胺基苯甲酸(4aminobenzoic acid)反應結合，形成圖 7d 所示的 derivative I。第 2 種半抗原是將 CAAT 與對 3-硫醇丙酸（3-Mercaptopropionic acid）反應結合，形成圖 7d 所示的 derivative II。第 3 種半抗原則是將三聚氰胺與丁二酸酐(succinic anhydrid）反應結合，形成圖 7d 所示的 derivative III。然後將上述 3 種修飾後的半抗原各分別皆以 DCC 與 NHS 交聯劑聯結至 BSA 形成 3 種免疫原，據以注射小鼠生產製作對應三聚氰胺的單株抗體。在包被抗原的製作上，由於三聚氰胺為親水性分子，較無法直接吸附於 96 孔分析盤底部疏水性的聚苯乙烯(polystyrene)塗層，故在篩選單株抗體或進行 cELISA 分析時，必須製作三聚氰胺-載體蛋白複合物作為包被抗原，利用載體蛋白結構上的疏水基團與聚苯乙烯間的吸附作用，使包被抗原能夠結合於 96 孔分析盤底部再進行分析。另外，三聚氰胺包被抗原的製作亦如同前述三聚氰胺免疫原的製作方法般，亦有類似的考量與限制 (Guomin et al., 2002)，除了必須先化學修飾三聚氰胺的結構外，並需與與第二種載體蛋白聯結，以避免在單株抗體的篩選過程中，會誤篩到辨識免疫原所聯結的第一種載體蛋白抗體，且會影 20.

(34) 響後續免疫分析時對第一種載體蛋白產生交叉反應性。Lei et al. (2010)製作 2 種三聚氰胺包被抗原，第 1 種包被抗原與其設計的免疫原方法相同，不過載體蛋白改為 OVA。第 2 種包被抗原製作方法與上述 Cao et al. (2013)製作的第 2 種免疫原方法相同，不過載體蛋白改為 OVA。Yin et al. (2010)製作包被抗原與其設計的免疫原方法相同，不過載體蛋白改為 BSA。Zhou et al. (2012) 製作包被抗原與其設計的免疫原方法相同，不過載體蛋白改為 OVA。另外，Cao et al. (2013)製作的 3 種包被抗原亦皆與其設計的免疫原方法相同，不過載體蛋白改為 OVA。綜上所述，目前已研發三聚氰胺的免疫原與包被抗原，其製作過程皆相當繁瑣耗時。以 Yin et al. (2010)的研究為例，三聚氰胺進行官能基團化學修飾，使其帶有連接臂與-COOH 基團的半抗原反應步驟需約 3 天時間，再將修飾後的半抗原聯結至載體蛋白 TG 上，使其複合成為免疫原的反應步驟另需 5 天時間(表 4)；而包被抗原的製作過程與免疫原的步驟相同，僅載體蛋白改為 BSA；故僅上述免疫原及包被抗原製備的二個過程，即需耗時約 16 天。另外，Lei et al. (2010)與 Zhou et al. (2012) 修飾三聚氰胺半抗原的反應步驟需約 3 天，再將其聯結至載體蛋白反應步驟另需 3 天時間，故免疫原及包被抗原製備的二個過程，即需耗 21.

(35) 時約 12 天。至於 Cao et al. (2013) 修飾三聚氰胺半抗原 (derivative I~III)的反應步驟需約 2~3 天，再將其聯結至載體蛋白反應步驟另需 7 天時間，故免疫原及包被抗原製備的二個過程，即需耗時至少 18 天時間。由於操作過程需耗費大量試劑、人力，且常需由熟稔化學反應之專業人員方能完成，諸多限制與不利，亟待新技術的發展加以克服。 5. 目前已發展之三聚氰胺免疫分析方法及偵測能力目前已有多個利用 cELISA 及側流免疫層析試紙來檢測三聚氰胺的報告(表 5)。cELISA 的過程常是先讓具有專一性的抗體吸附於免疫分析盤底部，然後加入待測檢體，使檢體中的待測抗原與免疫分析盤底部的抗體進行專一性結合，再加入帶有酵素的抗原，此抗原亦可與免疫分析盤底部的抗體進行專一性結合，由於免疫分析盤底部己吸附的抗體數量有限，因此當檢體中抗原的量越多，則帶有酵素的抗原可結合於分析盤底部的抗體就越少，亦即兩種抗原皆與免疫分析盤底部的抗體相互競爭結合位置，此時洗去檢體與帶有酵素的抗原後，加入可被酵素催化呈色之呈色液，當檢體中抗原量越多，代表免疫分析盤內留下之帶有酵素的抗原越少，顯色就會越淺(圖 8) (Gan and Patel, 2013)。側流免疫層析是藉由抗原與抗體間的專一性結合做為檢測依 22.

(36) 據，並常以膠體金 (Colloidal gold)作為顯色劑。方法是將已結合膠體金的抗體先固定於硝化纖維膜(nitrocellulose membrane)的一側，當硝化纖維膜的另一端滴入樣品後，由於毛細管作用原理，樣品將沿著該膜向前移動，移動至固定有抗體的區域時，樣品中相應的抗原即與該抗體發生特異性結合，利用抗體上的膠體金可使測試線區域顯色，從而進行結果判讀(圖 9) (Wang et al., 2014)。針對三聚氰胺的免疫分析方法的偵測能力而言(表 7)，目前的 cELISA 方法的最低偵測濃度為 0.01 ng/mL，可檢測的濃度範圍為 0.03~9 ng/mL (Zhou et al., 2012)；而多數側流免疫層析法的最低偵測濃度為 50 ng/mL (Li et al., 2011; Gong et al., 2012; Wang et al., 2014)，其中 Le et al. (2013)研發的快篩套組最低偵測濃度可至 0.26 ng/mL。不過，上述免疫分析方法大多應用在食品(牛奶、乳製品)、動物組織、飼料之檢測上，對於有極大暴露來源的美耐皿餐具熱溶出三聚氰胺的檢測，並未有相關免疫分析方法研究。三、. 研發新的免疫分析技術為能克服不易將半抗原轉生成免疫原的困難，改進傳統的免. 疫原製備方式有其必要，我們已開發出將半抗原直接聚合轉變為 23.

(37) 免疫原的新技術，並獲得美國 (Lin and Wang, 2014)、中國大陸 (林哲雄、王玉麒，2017)、臺灣 (林哲雄、王玉麒，2017)的發明專利。藉此技術，三聚氰胺可透過與戊二醛的交互作用，進而彼此聯結聚合形成大分子的免疫原。且此技術並不僅限用於三聚氰胺，亦可擴展至其他具有多胺基或多羧酸基…等化學物質；若標的半抗原不具有胺基或羧酸基等官能基團，亦可設法透過化學修飾使其達到具備適當官能基的條件。本研究除了以三聚氰胺為示例，說明如何將半抗原製備成免疫原之外，更針對其對應單株抗體的篩選與檢測方法的開發進行步驟簡化，直接分析三聚氰胺於親水性免疫分析盤中，省卻過去製作包被抗原的步驟，不僅方法簡易有效，並有極佳之偵測能力與可偵測之濃度範圍。另外，本免疫原製備的新技術不僅可應用於抗體生產，也深具疫苗開發潛力，例如將與疾病相關的胜肽鏈、醣鏈或其他小分子成分，在不透過載體參與的前提下，藉由彼此交聯而成為具有免疫原性的聚合分子，用以激發動物的免疫記憶而有利於疾病的預防。. 24.

(38) 貳、材料與方法一、. 儀器設備本研究主要使用的儀器型號與規格有 HPLC (Agilent 1100. Series, Agilent Technologies, Inc., Germany)，LC/MS/MS (Bruker amazon SL , Bruker Daltonic, Inc., Germany)，凝膠滲透層析儀(gel permeation chromatography，GPC) (PN-1000, Postnova Analytics, Eresing, Germany)，LC/MS (API 3000, International Equipment Trading Ltd., USA)，酵素免疫分析測讀儀(uQuant, Bio-Tek Instrument Inc, USA)，紫外光/可見光分光光度計 1 (Novasper 2, Amersham Pharmacia Biotech, Inc., UK)及紫外光/可見光分光光度計 2 (V-770, Jasco Model, Inc., Japan)。另外，G10 膠體管柱(管徑 0.8 cm × 管長 25 cm)是以 Sephadex® G-10 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)填滿，而 96 孔免疫分析盤則是 Nunc 公司的產品(Nunc-Immuno Plate Maxisorp)。二、. 化學試藥與常用溶液. 1. 化學試藥三聚氰胺(melamine)、戊二醛(glutaraldehyde)、二甲基甲醯胺 (N,N-dimethylformamide, DMF)、聚山梨醇酯 20(Polysorbate 20, Tween 20)、甘胺酸(glycine)、三羥甲基氨基甲烷 25.

(39) [tris(hydroxymethyl)aminomethane, Tris]、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)、弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvants, FCA )、弗氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvants, FIA )、兔子抗老鼠抗體-鹼性磷酸酶(rabbit anti-mouse IgG-alkaline phosphatase , RAM-AP)、山羊抗兔子抗體-鹼性磷酸酶(goat antirabbit IgG-alkaline phosphatase , GAR-AP)、對硝基苯磷酸(pnitrophenyl phosphate, pNPP)，次黃嘌呤、氨基蝶呤與胸腺嘧啶 (hypoxanthine, aminopterin and thymidine , HAT)與疊氮化鈉 (sodium azide, NaN3)皆購自 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)。 IMDM 細胞培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium, IMDM) 購自 Gibco (Grand Island, NY)。聚乙二醇 1500 (Polyethylene Glycol 1500, PEG 1500)來自 Boehringer Mannheim (783641)，老鼠抗體分型套組購自 Southern Biotechnology Associates (5070-04)，胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）則是 Hyclone 的產品 (SH30071.03）。 2. 常用溶液 Ⅰ. 磷酸鹽緩衝液(Phosphate buffered saline, PBS)： 140 mM NaCl, 10 mM sodium phosphate, pH 7.4 Ⅱ. ELISA blocking solution： 26.

(40) PBS, 1% (w/v) BSA , 0.02% (w/v) NaN3 III. ELISA washing buffer： 10 mM Tris-Cl , 0.05% (v/v) Tween 20, pH 8.0 IV. ELISA diluent buffer： PBS, 1% (w/v) BSA , 0.05% (v/v) Tween 20, 0.02% (w/v) NaN3 V.. Alkaline phosphatase (AP) substrate solution： 9.6% (v/v) diethanolamine, 0.5 mM MgCl2‧6H2O, pH 9.6. VI. Borate saline buffer： 15 mM boric acid, 150 mM NaCl, pH 8.5 三、. 方法. 1. 免疫原製備取 900 μL 的 20 mM 三聚氰胺水溶液與 100 μL 的 2.5 M 戊二醛混合，再於 37℃中反應 3 天，之後將反應液離心 (10000 g, 10 min)並去除上清液，保留的底層沉澱物即是用作為免疫原的三聚氰胺聚合物，經加水振盪清洗、離心(10000 g, 10 min) 與去除上清液等步驟重複 2 次後，再加入 1 mL 經滅菌處理的二次水與沉澱物混合，並置於-20℃中冷凍保存備用。 2. 三聚氰胺聚合反應的上清液(supernatant)分析取 900 μL 的 20 mM 三聚氰胺水溶液與 100 μL 的 2.5 M 戊. 27.

(41) 二醛混合，再於 37℃中反應 3 天，之後將反應液離心 (10000 g, 10 min)，隨後將上清液樣品取出後委託台灣布魯克生命科學股份有限公司以 LC/MS 進行分析，儀器的設定條件為：全掃瞄正離子模式，scan rate 為 32000 u/sec，樣品流速為 3 μL/min，mass range 為 100 to 1000 m/z。 3. 三聚氰胺的聚合比例分析 Ⅰ. G10 膠體管柱分析：取 900 μL 的 20 mM 三聚氰胺水溶液與 100 μL 的 2.5 M 戊二醛混合，於 37℃中反應 3 天後，將混匀的反應液取 20 μL 加入至 G10 膠體管柱中，再以二次水為移動相，流速設定為 1 mL/2.5 min，每 2.5 分鐘收集 1 管沖提液，並分別測其於 214 nm 的吸光值(absorbance value)。此外，也在不同次的獨立實驗中，分別取 20 μL 的 18 mM 三聚氰胺水溶液或 250 mM 戊二醛水溶液，加入至 G10 膠體管柱中，並以與上述相同的方式進行管柱沖提、收集與 214 nm 吸光值測定，最後將聚合反應原料及聚合反應樣品的 214 nm 吸光圖譜進行比較。 Ⅱ. HPLC 儀器分析：首先配製 7 種濃度(10, 30, 50, 100, 200, 300 與 500 ppm) 28.

(42) 的三聚氰胺標準曲線樣品；接著，我們配製各水溶液樣品包括：(a) 18 mM 三聚氰胺水溶液，(b) 250 mM 戊二醛水溶液， (c) 18 mM 三聚氰胺與 250 mM 戊二醛混合液，(d) 18 mM 三聚氰胺與 25 mM 戊二醛混合液，(e) 18 mM 三聚氰胺與 2.5 mM 戊二醛混合液。為能落入標準品檢量線的可比較範圍，所有樣品於 37℃反應 3 天後皆先以二次水稀釋 10 倍，再以 0.22 μm 孔徑濾膜過濾，隨後將濾液利用高效液相層析儀進行分析。儀器偵測之條件與方法如下：層析管柱為 Atlantis HILIC silica column (粒徑 5 μm，內徑 4.6 mm × 長度 250 mm)；配製溶液 A (將 100 mL 的 10 mM ammonia acetate 加入至 1900 mL 的 acetonitrile 中)與溶液 B (將 100 mL 的 200 mM ammonia acetate 加入至 1900 mL 的 50% acetonitrile 中)，將溶液 A 與溶液 B 以 1 : 4 (v/v)之比例混勻後，供作移動相(mobile phase)溶液；移動相溶液以等度沖提（isocratic elution）方式，流速為 1 mL/min；PDA 偵測波長為 240 nm，樣品注入體積設定為 20 μL。 4. 三聚氰胺聚合物的分子量分析將方法 1 製備之免疫原樣品解凍後，進行離心(10000 g, 10 min)並去除上清液，再加入 0.5 mL DMF 回溶底層的三聚氰胺聚 29.

(43) 合物顆粒以為檢液，隨後委託財團法人塑膠工業技術發展中心以凝膠滲透層析儀(gel permeation chromatography，GPC)進行分子量分析。使用的層析管柱為 Jordi gel polydivinylbenzene (PDVB) column，沖提液為 0.3% (w/v)溴化鋰溶於 DMF 中，流速為 1 mL/min，樣品注入體積為 100 μL。 5. 動物免疫實驗 Ⅰ. 實驗動物：約 6 週齡的雌性 BALB/c 小鼠 3 隻與 8 週齡的雌性 New Zealand White 兔子 1 隻，分別飼養在國立臺灣師範大學的動物房中，所有實驗動物的飼養、照護與操作均遵循國立臺灣師範大學實驗動物申請辦法中的相關規定(審核同意書核准編號 99004)。 Ⅱ. 動物免疫方法：主要包括 3 個階段的免疫注射。第 1 次免疫注射：取出上述方法 1 步驟完成之免疫原樣品，解凍後混合均匀，依不同動物取用不等量免疫原，小鼠的劑量為 0.143 mL 的免疫原/隻。在對 3 隻小鼠進行第 1 次免疫注射前，先取 0.429 mL (0.143 mL × 3)免疫原加入無菌二次水 0.321 mL 使體積成為 0.75 mL，隨後加入 0.75 mL 弗氏完全佐劑，經 30.

(44) 充分乳糜化後，對每隻小鼠採用皮下注射 6 針(每針 50 μL) 及腹腔注射 2 針(每針 100 μL)的方式進行免疫注射。另外，兔子的免疫原注射劑量為 0.43 mL 的免疫原/隻。我們在對兔子進行第 1 次免疫注射前，先取 0. 43 mL 免疫原，加入無菌二次水 0.57 mL 使體積成為 1 mL，隨後加入 1 mL 弗氏完全佐劑，經充分乳糜化後，對兔子採取皮下注射 6 針(每針 200 μL)及肌肉注射 2 針(每針 400 μL)的方式進行免疫注射。第 2 次免疫注射：於第 1 次免疫注射過後第 28 天，執行第 2 次免疫注射，除了以弗氏不完全佐劑取代弗氏完全佐劑之外，其餘步驟與第 1 次免疫注射相同第 3 次免疫注射：第 2 次免疫注射過後第 14 天，執行第 3 次免疫注射，除了是以無菌二次水代替弗氏完全佐劑外，其餘步驟與第 1 次免疫注射相同。 III. 動物採血：於第 3 次免疫注射過後的第 3 天，我們對實驗動物進行採血，小鼠以心臟刺穿方式進行，兔子則從耳動脈採血。收 31.

(45) 集到的血液待凝集及低溫(4℃)收縮處理後，離心分離出血清，在加入 NaN3 至最終濃度為 0.02% (w/v)後，置於-20℃ 中冷凍保存備用。 6. 間接性酵素連結免疫吸附分析(iELISA) Ⅰ. 首先配製一系列濃度(10-2 至 106 ng/mL)三聚氰胺水溶液以作為包被抗原，再以 200 μL/well 方式加入免疫分析盤中。於室溫下靜置 2 小時後，以 ELISA washing buffer 清洗 3 次。 Ⅱ. 以 200 μL/well 方式加入 ELISA blocking solution 於免疫分析盤中，於室溫下靜置 2 小時後，以 ELISA washing buffer 清洗 3 次。 III. 以 200 μL/well 方式加入小鼠或兔子的稀釋抗血清為一級抗體，稀釋方式是以 ELISA diluent buffer 將抗血清稀釋 200 倍；於室溫下反應 2 小時後，以 washing buffer 清洗 3 次。 IV. 依據步驟(III)所添加不同一級抗體，以 50 μL/well 方式分別加入不同的二級抗體(一級抗體為小鼠抗血清時，以 RAMAP 為二級抗體；一級抗體為兔子抗血清時，以 GAR-AP 為二級抗體)。於室溫下反應 2 小時後，以 ELISA washing buffer 清洗 3 次。 V.. 以 50 μL/well 的方式加入 AP 受質 (pNPP 0.6 mg/mL in AP 32.

(46) substrate solution)，於室溫下反應 2 小時後，以酵素免疫分析測讀儀進行反應結果 (Abs 405-490 nm)判讀。 7. 小鼠抗血清中標的抗體之分型(isotyping)鑑別試驗 Ⅰ. 將方法 1.的免疫原解凍、混合均匀後，取 50 μL 置入 1.5 mL 的微量離心管中，再加入 1mL PBS。 Ⅱ. 於上述的微量離心管中加入 5 μL 方法 5-(III)收集的小鼠抗血清，對照組則為加入未曾經過免疫注射的小鼠血清；於室溫下緩慢轉動混匀 1 小時後，將反應液離心(10000 g, 10 min)，去除上層液，再重複以 1 mL 的 PBS 清洗、離心 (10000 g, 10 min) 與去除上清液等步驟共 2 次。 III. 針對離心管中的沉澱物，加入 50 μL 0.1 M glycine-Cl ( pH 2.5)，使結合於三聚氰胺聚合物上的抗體分離，隨後再進行離心(10000 g, 30 s)，並取出上層液加入於新的微量離心管中，隨即加入 20 μL 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5)以中和溶液之 pH 值，最後再加入 0.5 mL Borate saline buffer，即完成抗血清中可辨識三聚氰胺聚合物的抗體分離。 IV. 針對上述分離獲得之抗體樣品，依廠商提供操作說明，進行 ELISA 方式的抗體分型鑑定。 8. 細胞融合(cell fusion)與單株抗體純化(purification) 33.

(47) Ⅰ. 細胞融合：將方法 5.完成免疫注射之小鼠以頸椎脫臼法(cervical dislocation)犧牲，再以 70%酒精將其體表充份浸潤，並移入無菌操作台中。取出小鼠的脾臟並以 IMDM 沖洗出內部細胞，隨後與骨髓癌細胞（myeloma cell）充分混合(spleen cell：myeloma cell = 10：1 的比例)，再加入 50%之 PEG1500 使兩種細胞發生融合。隨後將細胞懸浮於 50 mL IMDM + 20%胎牛血清 + 10% HAT 的培養液中，再滴入於 96 孔培養盤中，並於培養箱中以 37℃及 5%二氧化碳濃度的條件培養 10 天。 Ⅱ. 融合瘤細胞的篩選(screening of hybridoma)：依照方法 6.的 iELISA 進行目標融合瘤細胞的篩選，部分方法內容變更如下：將方法 6-(I)配製的三聚氰胺濃度改為 1 mg/mL，以 200 μL/well 加入免疫分析盤中，於室溫下靜置 2 小時後，以 ELISA washing buffer 清洗 3 次；方法 6-(III)加入的一級抗血清改為融合瘤細胞的培養液 50 μL。保留反應讀值(Abs 405-490 nm)高於 0.1 的融合瘤細胞株繼續培養。 III. 融合瘤細胞的選殖(cloning of hybridoma)：經方法 8-(II)篩選出之細胞株培養至長滿個別培養孔 34.

(48) 時，以無菌吸管將細胞與培養液輕緩混合均勻，吸取少量混合液並以血球計數器計算其細胞濃度。隨後取含約 80 個細胞的混合液加入 6.5 mL 的 IMDM + 20%胎牛血清 + 10% HT 培養液中，再分別滴入於 96 孔培養盤中，經於 5%二氧化碳濃度與 37℃培養箱中培養約 10 天後，於顯微鏡下觀察培養盤中各個培養孔，培養孔底部如僅有 1 簇緊密生長之細胞團落，即於該培養孔中吸取培養液以方法 8-(II)的 iELISA 方式進行篩選，最後保留反應吸光值高於 1 以上的細胞株。這些細胞株經大量培養後，收取其含有單株抗體之培養液，以 500 g 離心 5 分鐘，保留上層液，加入 NaN3 至 0.02% (w/v)，再置於 4℃中低溫保存，以供後續的純化與分析。 IV. 單株抗體的純化：首先測量方法 8-(III)所收集的單株抗體培養液的體積，並緩慢加入硫酸銨至 50%飽和度，於 4℃下攪拌 30 分鐘後，以 15000 g 離心 30 分鐘，再以 1/20 原培養液體積的 PBS 回溶沉澱物，經再次以 15000 g 離心 15 分鐘後，收取其上層液以進行 protein A/G（Pierce 20422）的吸附純化工作。在進行吸附純化前，先以 10 倍 protein A/G 膠體體積之 35.

(49) PBS 清洗管柱，之後以 2 倍膠體體積的 0.1M glycine-Cl (pH 2.5)溶液進行假沖提(fake elution)，再以 20 倍膠體體積之 PBS 清洗管柱。隨後將上述經硫酸銨沉澱濃縮之單株抗體樣品加入於 protein A/G 管柱中，並保留流出液，隨後以 20 倍體積之 PBS 洗管柱，清除未與 protein A/G 結合之成分。接著加入 2 倍膠體體積之 0.1M glycine-Cl (pH 2.5)以沖提出與 protein A/G 結合之抗體，將流出沖提液以每 1 mL/管的方或收集（每個收集管預先加入 0.2 mL 之 pH 8.5 的 Tris-Cl 溶液），待 glycine-Cl 溶液流完則加入 PBS 繼續收集，約收集 10 管後再以 20 倍膠體體積之 PBS 清洗管柱，隨後測量每管收集液的 OD280 吸光值，並收集吸光值超過 0.036 之流出沖提液。將已通過管柱之濃縮培養液重複進行上述流過 protein A/G 管柱、PBS 清洗、glycine-Cl 流洗、PBS 清洗的過程，直到收集液的最高吸光值低於 0.10。將所有收集的流出沖提液集中後，進行 50%硫酸銨沉澱，並以小體積的 PBS 回溶，再進行 15000 g 的離心澄清，最後取出 80 μL 以 PBS 進行 10 倍稀釋，測其 OD280 值，再以下列公式換算出抗體的濃度： 36.

(50) C = A /(ε× b) C：抗體濃度(mg/mL) A：280 nm 吸光值 ε：抗體消光系數 1.36 (cm-1mg-1mL) b：光徑長 1 (cm) 9. 競爭性酵素連結免疫吸附分析(cELISA) Ⅰ. 配製 1 mg/mL 的三聚氰胺水溶液為包被抗原，以 200 μL/well 方式加入免疫分析盤中，於 4℃中隔夜靜置後，以 ELISA washing buffer 清洗 3 次。 Ⅱ. 以 200 μL/well 方式，加入 ELISA blocking solution，於室溫中靜置 2 小時後，以 ELISA washing buffer 清洗 3 次。 III. 配製一系列濃度(10-2 至 106 ng/mL)的競爭劑(competitor)三聚氰胺水溶液，分別取 75 μL 加入於微量離心管中，對照組則是加入 75 μL 的二次水。隨後各管再加入 25 μL 濃度為 4 μg/mL 之單株抗體，並振盪反應 2 小時。 IV. 將步驟(III)之反應液加入步驟(II)之免疫分析盤內，作用 2 小時後，以 ELISA washing buffer 清洗 3 次。 V.. 以 50 μL/well 方式，加入以 ELISA diluent buffer 稀釋 10000 倍之二級抗體(RAM-AP)。反應 2 小時後，以 ELISA 37.

(51) washing buffer 清洗 3 次。 VI. 以 50 μL/well 的方式加入 AP 受質 (pNPP 0.6 mg/mL in AP substrate solution)，於室溫下反應 2 小時後，以酵素免疫分析測讀儀進行反應結果 (Abs 405-490 nm)判讀。 VII. cELISA 的抑制率計算方式如下: 抑制率(%) = (B/B0) × 100% B：實驗組(含競爭劑三聚氰胺)所測出之吸光值 B0：對照組(不含競爭劑三聚氰胺的水)所測出之吸光值半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)是指當 B 值為 1/2 B0 值時，所用的競爭劑三聚氰胺濃度。 10.單株抗體的專一性測試三聚氰胺單株抗體的專一性乃藉其與類緣物質(analog compound)之交叉反應性進行分析。我們選用的三聚氰胺類緣物質為三聚氰胺的水解主要產物，包括三聚氰胺二醯胺 (ammeline)、三聚氰胺一醯胺(ammelide)與三聚氰酸(cyanuric acid or cyanurate)，分析方法如方法 4.的 cELISA，交叉反應率(crossreactivity ratio, CR%)的計算公式如下： CR% = (IC50 for melamine/IC50 for analog compound) × 100% 38.

(52) IC50 for melamine 即為方法 9-(VII)的 IC50 值；而 IC50 for analog compound 是指當 B1 值為 1/2 的 B0 值時，所用的競爭劑三聚氰胺類緣物質濃度；其中 B0 為對照組(不含競爭劑三聚氰胺的水)所測出之吸光值，B1 為實驗組(含競爭劑三聚氰胺類緣物質)所測出之吸光值。 11.美耐皿餐具的三聚氰胺熱溶出處理購買市售美耐皿餐具碗共 6 組，有 4 組(編號 1~4 號)的製造商為中國的廣展公司(品牌號碼分別為 QQD-004、QQD-004、 D147、AHK1)，1 組(編號 5 號)之製造商為 Ta Sheng，另 1 組(編號 6 號)之代理商為臺灣的庭萱百貨行。其中編號 1~2 號為相同製造商的同款式樣品，主要用以比較相同樣品在三聚氰胺溶出結果上的差異。編號 1~6 號的碗口半徑分別為：8、8、7.25、5.5、 4.25 與 6.3 公分，我們將 6 組餐具先以二次水洗淨乾燥，再分別加入已預熱至 95℃之二次水，加入的體積分別為 450、450、 320、180、110 與 290 mL，隨後以錶玻璃蓋住碗口，再放入 95℃ 水浴槽中 60 分鐘。之後，分別取出碗內的溶出液，冷卻後以 0.22 μm 濾膜(Nylon 材質)過濾，並儲放於-20℃以供後續分析使用。. 39.

(53) 12.熱溶出三聚氰胺樣品之免疫分析與儀器分析將方法 11 之三聚氰胺溶出液解凍後，以方法 9 的 cELISA 進行測試，其中方法 9-(III)的競爭劑溶液改為各餐具樣品檢液。另外，也以 HPLC 與 LC/MS/MS 進行三聚氰胺溶出液的分析。儀器偵測之條件與方法如下： Ⅰ. HPLC：層析管柱為 Polaris C8 column (粒徑 5 μm，內徑 4.6 mm × 長度 150 mm)；配製溶液 A (acetonitrile)與溶液 B (稱取檸檬酸 1.92 g 及辛烷磺酸鈉 2.16 g，加二次水 900 mL 溶解，以 1N 氫氧化鈉溶液調整 pH 值至 3.0，以二次水定容至 1 L)，將溶液 A 與溶液 B 以 1 : 9 (v/v)之比例混勻後，供作移動相溶液；移動相溶液以等度沖提方式，流速為 1 mL/min； PDA 偵測波長為 236 nm；樣品注入體積設定為 20 μL。 Ⅱ. LC/MS/MS：層析管柱為 XbridgeTM HILIC column (粒徑 3.5 μm，內徑 2.1 mm × 長度 100 mm )；配製溶液 A (1 g of ammonium acetate in 1 L of water)與溶液 B ( 1 g of ammonium acetate in 1 L of acetonitrile)，將溶液 A 與溶液 B 以 1 : 9 (v/v)之比例混勻後，供作移動相溶液；移動相溶液以等度沖提方式，流速為 40.

(54) 0.5 mL/min；樣品注入體積設定為 10 μL；離子噴灑電壓(ion spray voltage)為 3.2 kV；溶媒揮散溫度(desolvation temperature)為 450℃。多重反應偵測(multiple reaction monitoring，MRM)的設定模式則是前驅離子(m/z)為 127>84.8，產物離子(m/z)為 127>68，碰撞能量(eV)為 26 與 42，定量離子對 (m/z)為 127>84.8。. 41.

(55) 參、結果一、. 三聚氰胺與戊二醛混合反應的水相成分分析為了驗證戊二醛交聯劑方法確實可聯結三聚氰胺，我們將. 已於 37℃反應 3 天的 18 mM 三聚氰胺與 250 mM 戊二醛混合反應液，經離心後取上清液以 LC/MS 進行反應液水相的成分分析。三聚氰胺以 M 符號表示，戊二醛以 G 符號表示，如圖 10 所示，水相中有許多由少量 M 和 G 聚合而成的分子出現，在質譜圖中，橫坐標為分子量與電荷的比例[質荷比，mass to charge ratio, (m/z)]，由於質譜圖中的分子碎片其電荷皆以+1 (z = 1)計，所以質荷比的數值，就是偵測出的分子量；縱坐標則表示偵測出的分子訊號強度。圖 10(a) m/z 範圍 100~300 時，未結合自由態的三聚氰胺(1M)其分子量波峰出現於 127.0，因為戊二醛與水的分子量分別為 100 與 18(圖中未顯示)，故 1 分子三聚氰胺與 1 分子戊二醛以醛胺縮合反應去掉 1 分子水(1M+1G-H2O)時，其分子量波峰出現於 209.0 (127+100-18 = 209)。而 1 分子三聚氰胺與 2 分子戊二醛以醛胺縮合反應去掉 2 分子水(1M+2G-2H2O)時，其分子量波峰出現於 291.1 (127+200-36 = 291)，此聯結模式為 GMG；但還有另一種可能的聯結模式則是 1 分子三聚氰胺先與戊二醛以醛胺縮合反應去掉 1 分子水聯結，而此聯結三聚氰胺 42.

(56) 的戊二醛則再與另一戊二醛以醛醇縮合反應去掉 1 分子水聯結，即 MGG 之聯結模式。依上述 2 種縮合反應與聯結模式推斷，在圖 10(b) m/z 範圍 300~500 中，2M+1G-2H2O 其分子量波峰出現於 317.1，即 MGM 之聯結模式。1M+3G-3H2O 其分子量波峰出現於 373.2，可能的聯結模式則包括 MGGG 與 GMGG。2M+2G-3H2O 其分子量波峰出現於 399.2，可能的聯結模式則包括 MGMG 與 MGGM。2M+3G-4H2O 其分子量波峰則出現於 481.2，可能的聯結則包括 MGMGG、GMGMG 與 GMGGM 等模式。另外，在圖 10(c) m/z 範圍 500~700 中，2M+4G-5H2O 其分子量波峰出現於 563.3，可能的聯結包括 MGMGGG、MGGMGG、MGGGMG、 MGGGGM、GMGMGG 與 GMGGMG 等模式。至於 3M+3G5H2O 其分子量波峰出現於 589.3，可能的聯結模式則包括 MGMGMG 與 MGMGGM。綜合上述的結果說明，在我們所設定的三聚氰胺與戊二醛聚合反應條件中，利用 LC/MS 分析反應液的水相成分，可看到戊二醛確實可以交聯三聚氰胺與其他戊二醛分子，逐步地聯結形成大分子；至於此聚合反應所產生的沉澱顆粒我們將另行分析。 43.

(57) 二、. 三聚氰胺的交聯聚合比例分析為瞭解三聚氰胺被戊二醛交聯劑聚合之比例，我們將已於 37℃反應 3 天的 18 mM 三聚氰胺與 250 mM 戊二醛混合反應液，利用 G10 膠體管柱與 HPLC 儀器 2 種方式進行分析。G10 膠體管柱主要是利用溶液中的物質會依照分子大小在不同時間點流出管柱的原理，由於小分子物質在管柱中會流經填充 Sephadex® G-10 膠球的中間孔徑，造成滯留於膠球中時間較久，因此會較慢流出管柱，大分子則因無法通過膠球中間孔徑，會從膠球旁直接流過，所以較快流出管柱，利用這種原理即可將樣品液中的分子依照分子大小進行分離。在進行實驗前，我們首先檢視自由態(free form)三聚氰胺的吸光值，結果如圖 11，在紫外光波長範圍中(190~320 nm)，三聚氰胺於波長 214 nm 有最高吸收值。然後，我們取 20 μL 的 18 mM 三聚氰胺水溶液加入至 G10 膠體管柱，以方法 3-(1)進行管柱沖提、收集與 214 nm 吸光值測定。分析結果如圖 12，檢測各管沖提液於 214 nm 的吸光值 (黑色實心圓點)，發現在沖提時間 32.5~65 分鐘時，即收集的沖提液於第 13~26 管時，可測出較高吸光值(大於 0.018)，表示絕大部分的自由態三聚氰胺可於此時間範圍內被沖提出 G10 膠體 44.

(58) 管柱外，尤其是在沖提時間 45 分鐘時，流出管柱的自由態三聚氰胺含量最多(吸光值 1.3601)；我們將沖提時間 32.5~65 分鐘測得吸光值(黑色實心圓點)所形成之波峰面積設定為 A。接著我們將已於 37℃反應 3 天的 18 mM 三聚氰胺與 250 mM 戊二醛混合反應液，混匀後取 20 μL 加入至 G10 膠體管柱，同樣以方法 3-(1)進行管柱沖提、收集與 214 nm 吸光值測定。各管沖提液於 214 nm 的吸光值(黑色正方形空心點)分析結果如圖 12 所示，此反應液中的分子，依上述膠體管柱說明之原理，未被戊二醛所聯結之自由態三聚氰胺小分子，亦會於沖提時間 32.5~65 分鐘時被沖提流出管柱，而已被戊二醛所聯結聚合的三聚氰胺大分子，則會於 5~32.5 分鐘時較快被沖提流出管柱。我們將沖提時間 32.5~65 分鐘(沖提液第 13~26 管)測得吸光值(黑色正方形空心點)所形成之圖形面積設定為 B。利用公式：(B/A)×100% = 未與戊二醛聯結的自由態三聚氰胺比例，推算得知為 25.2%；換言之，當 18 mM 三聚氰胺與 250 mM 戊二醛混合反應液於 37℃反應 3 天後，估計有 74.8%的三聚氰胺被戊二醛聯結形成聚合物。至於對照組 250 mM 戊二醛的實驗中，由於沖提時間 0~95 分鐘所收集的各管沖提液，檢測 214 nm 的吸光值(黑色三角形 45.

(59) 空心點)皆相當小(小於 0.0048)，故無明顯的波峰形成，此結果亦說明戊二醛聯結三聚氰胺形成聚合物時，並不會影響其所聯結的三聚氰胺於 214 nm 的吸光值。在進行 HPLC 儀器分析時，我們首先配製 7 種濃度(10, 30, 50, 100, 200, 300 與 500 ppm)的三聚氰胺標準品，經分析三聚氰胺的吸收波峰面積與濃度之關係，得到良好的檢量線方程式為 y = 4.2934x + 6.2542（R2 = 1），由於 18 mM 的三聚氰胺溶液為 2268 ppm，超出檢量線的濃度範圍，所以我們在分析方法 3(Ⅱ)所配製的 5 種不同溶液樣品前皆有先以二次水稀釋 10 倍，確保分析的樣品能落於檢量線的設定濃度範圍內。 HPLC 儀器分析結果如圖 13。圖 13(a)為 18 mM 三聚氰胺溶液的層析圖，自由態的三聚氰胺於滯留時間 2.802 分鐘時出現明顯的波峰，此波峰面積數值為 1139。圖 13(b)為 250 mM 戊二醛溶液的層析圖，其波峰值於 2.209 分鐘時出現。而已於 37℃反應 3 天的 18 mM 三聚氰胺與 250 mM 戊二醛混合反應液，經由過濾去除聚合顆粒後，水相溶液經由層析的分析結果如圖 13(c)，有 3 個波峰滯留時間點 2.221、2.555 與 2.802 分鐘出現；其中滯留時間 2.221 分鐘出現的波峰，我們評估可能為游離態的戊二醛，以及少量的戊二醛彼此以醛醇縮合反應形成 46.

(60) 的小分子聚合物；而滯留時間 2.555 分鐘出現的波峰可能為戊二醛與三聚氰胺聯結所成的小分子聚合物。另外，滯留時間 2.802 分鐘出現的波峰則與圖 13(a)相同，為未與戊二醛聯結的自由態三聚氰胺，此波峰面積數值為 228.7。我們將圖 13(c) 於 2.802 分鐘出現的波峰面積數值除以圖 13(a)於 2.802 分鐘出現的波峰面積數值，再乘上 100%後 [(228.7/1139) × 100%]，計算得知為 20.1%，此為未與戊二醛聯結的自由態三聚氰胺比例；換言之，當 18 mM 三聚氰胺與 250 mM 戊二醛混合反應液於 37℃反應 3 天後，估計有 79.9%的三聚氰胺被戊二醛聯結形成聚合物。綜合圖 12 與圖 13 的分析結果，我們評估所設計的三聚氰胺與戊二醛之反應聯結條件，即 18 mM 三聚氰胺與 250 mM 戊二醛混合液於 37℃反應 3 天情況下，約有 75~80%的三聚氰胺可與戊二醛聚合形成三聚氰胺聚合物。另外，我們也在固定三聚氰胺濃度為 18 mM 的情況下，測試減少戊二醛濃度對三聚氰胺聚合反應的影響。在戊二醛濃度降低為 25 mM 的樣品中，自由態三聚氰胺的波峰出現在滯留時間 2.803 分鐘[圖 13(d)]，此波峰面積數值為 1085.7。我們將圖 13(d) 於 2.803 分鐘出現的波峰面積數值除以圖 13(a)於 2.802 分 47.