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九、 半乳糖凝集素-3 基因剔除小鼠其海馬迴中使代謝乙型類澱粉蛋白的 腦啡肽酶表現量增加
經過確認半乳糖凝集素-3 會與乙型類澱粉蛋白交互作用後，我們想進 一步了解為何半乳糖凝集素-3 會促進乙型類澱粉蛋白的聚集。我們有興趣 的是腦中三個與乙型類澱粉蛋白降解有關的酵素，因此我們分別觀察了野 生型小鼠以及半乳糖凝集素-3 基因剔除小鼠的腦啡肽酶 (neprilysin, NEP)、
胰島素降解酶 (insulin-degrading enzyme, IDE) 以及甲狀腺素結合蛋白 (transthyretin, TTR) 的表現。其中前兩者與乙型類澱粉蛋白的降解有關，
甲狀腺素結合蛋白則是會與乙型類澱粉蛋白的單聚體及低分子量寡聚體結 合，阻止乙型類澱粉蛋白朝向高分子量寡聚體型態堆積，且進一步降解已堆 積的乙型類澱粉蛋白 (Li et al., 2013)。實驗結果如圖 9 所示，兩組的樣本 數皆為 5。圖 9b 中顯示，腦啡肽酶在半乳糖凝集素-3 基因剔除小鼠背側海 馬迴中的表現量約是野生型小鼠的兩倍，但是圖 9c 的胰島素降解酶及圖 9d 的甲狀腺素結合蛋白的表現量則沒有顯著的改變。
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圖 9、半乳糖凝集素-3 基因剔除小鼠其海馬迴中使代謝乙型類澱粉蛋白的 腦啡肽酶表現量增加
針對野生型小鼠及半乳糖凝集素-3 基因剔除小鼠的背側海馬迴分析腦 啡肽酶、胰島素降解酶以及甲狀腺素結合蛋白的表現量是否有差異。(a)為 經西方墨點法分析後結果。(b)為腦啡肽酶表現的量化圖。半乳糖凝集素-3 基因剔除小鼠的腦啡肽酶表現顯著比野生型小鼠還要多 (t1,8 = 8.61,
P
<0.001)。(c)為胰島素降解酶表現的量化圖。兩組間均無顯著差異 (t1,8 = 0.72, ( a )
( d ) ( c )
( b )
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> 0.05)。(d)為甲狀腺素結合蛋白表現的量化圖。兩組間均無顯著差異 (t1,8= 1.325,
P
> 0.05)。數據以 mean±s.e.m.表示，利用 Student’t
-test 統計 分析。#P
< 0.001。‧ 國
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十、 在小鼠海馬迴中半乳糖凝集素-3 的表現位置與 Iba-1 相同
前文討論到乙型類澱粉蛋白會活化免疫細胞誘發先天免疫反應且半乳 糖凝集素-3 也會調控發炎反應，但我們不清楚半乳糖凝集素-3 是否會參與 乙型類澱粉蛋白所引發的免疫反應。因此，我們進一步以免疫螢光染色的方 式觀察半乳糖凝集素-3 及代表微膠細胞的 Iba-1。半乳糖凝集素-3 的訊號為 紅色，綠色則為 Iba-1 的訊號，疊合在一起後呈現黃色代表兩者有 co-localized。結果顯示，11 個月大 APP/PS1 小鼠海馬迴中的半乳糖凝集素-3 及 Iba-1 訊號明顯增加，且兩者有 co-localized 的現象，表示 APP/PS1 小 鼠海馬迴中發炎現象確實較同年齡的野生型小鼠嚴重，且半乳糖凝集素-3 主要表現於微膠細胞。
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圖 10、在小鼠海馬迴中半乳糖凝集素-3 的表現位置與 Iba-1 相同
對野生型小鼠及 APP/PS1 小鼠的海馬迴以免疫螢光染色觀察半乳糖 凝集素-3 及 Iba-1，顯示 APP/PS1 小鼠的海馬迴大量表現半乳糖凝集素-3 及 Iba-1，且兩者有 co-localized 的現象。比例尺為 150μm。
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examination, MMSE) 或是疾病後期由腦部影像檢查發現腦部萎縮而確診。在 2015 年 2 月時，美國食品藥品監督管理局 (FDA) 通過將腦脊隨液 (anti-aggregating compound)，減少乙型類澱粉蛋白的堆積 (Luo et al., 2013)；
第三種是針對乙型類澱粉蛋白導致發炎現象使神經細胞死亡的抗發炎藥品 (Wyss-Coray and Rogers, 2012)；第四種則是抗氧化藥品，由於神經細胞 發炎的過程中會釋放出活性氧化物導致細胞凋亡，而抗氧化藥品則能減少 細胞的損傷及死亡 (Butterfield, 2014)。顯示現今的治療取向已經逐漸從減 輕病情的被動治療趨於針對病因的主動治療方式 (Karran et al., 2011)，因 此提出可預防及治療的藥物策略是目前首重的課題。
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48 小時進行觀察。在轉染 Flag-vactor 及 Flag-Gal-3 質體基因的實驗中，主要採用將質體基因溶於 polyethylenimine (PEI) 中的方式進行，PEI 會將 質體基因包裹起來且表面帶有正電荷，而細胞表面的蛋白質片段多為負電
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(NMDA receptor) 或是細胞普恩蛋白 (cellular prion protein)，這兩者皆會 導 致 細 胞 內 的 鈣 離 子 濃 度 異 常 而 影 響 長 期 增 益 現 象 (long-term potentiation, LTP) (Lashuel et al., 2002)；或是結合到捲曲受體 (Frizzled receptor) 導致 Wnt 訊息傳遞路徑受阻，導致肝醣合成酶激酶-3β (GSK-3‧
發炎因子 (proinflammatory mediator) 的表現，例如 nitric oxide synthase (iNOS)、interleukin 1 beta (IL-1β) 以及 Interleukin-12 (IL-12) (Boza-Serrano et al., 2014)。多發性硬化症與半乳糖凝集素-3 討論也相當少，在 過去研究中則是指出半乳糖凝集素-3 會促使微膠細胞活化進而侵蝕正常神 經細胞的髓鞘，過度表現半乳糖凝集素-3 在由 cuprizone 誘發多發性硬化‧
一致的 (Diaz-Alvarez and Ortega, 2017)。而微膠細胞在腦中目前已知主要 負責中樞神經系統的免疫反應。如果病毒入侵腦部，導致發生病毒性腦炎， 細胞的髓鞘所導致(Calabresi, 2004)，不過在物理性腦損傷中，免疫細胞對‧
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-3 基因剔除小鼠的腦啡肽酶的表現約是野生型小鼠的兩倍，而胰島素降解 酶及甲狀腺素結合蛋白的表現量則沒有明顯的不同。腦啡肽酶在全腦中的 表現情形以海馬迴為最多，大腦皮質次之，主要分布在神經突觸前或突觸後 的細胞膜表面，結構為一種鋅離子金屬肽酶的穿膜蛋白，在腦中的功能主要 為代謝突觸間隙的神經胜肽包含了乙型類澱粉蛋白 (Nalivaeva et al., 2012)，而腦啡肽酶可以藉由代謝乙型類澱粉蛋白而對於長期增益現象、突 觸可塑性有正向的效果 (Ma and Klann, 2012)，因此可以推論減少半乳糖 凝集素-3 的表現可以使腦啡肽酶的表現量增多，增加其對乙型類澱粉蛋白 的代謝進而減少寡聚體作用，但我們的實驗結果並不排除其他的可能機制。
我們目前正進一步分析半乳糖凝集素-3 基因剔除小鼠與野生型小鼠海馬迴 中的β-分泌酶活性是否也有差異。我們也將進一步探討帶有單股半乳糖凝 集素-3 剔除基因型的 APP/PS1 小鼠其老年斑塊的生成是否比 APP/PS1 小 鼠少以及其認知功能的缺陷是否比 APP/PS1 小鼠輕微。我們同時也有興趣 知道乙型類澱粉蛋白是否影響半乳糖凝集素-3 以外的發炎因子的表現，進 而影響乙型類澱粉蛋白的寡聚合作用及其毒性。
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結論
本論文中發現半乳糖凝集素-3 會促進小鼠背側海馬迴中乙型類澱粉蛋 白的寡聚合作用。乙型類澱粉蛋白則又會促使半乳糖凝集素-3 的表現量增 加。而 APP/PS1 基因轉殖小鼠隨著年齡增長，乙型類澱粉蛋白的表現量也 增加且寡聚合作用也趨於嚴重，而半乳糖凝集素-3 的表現量也同時增加，
顯示半乳糖凝集素-3 是阿茲海默症病理機制中的重要因子。半乳糖凝集素-3 在 APP/PS1 小鼠腦中主要表現於微膠細胞，而被認為可以抑制發炎的 PIAS1 則是隨著 APP/PS1 小鼠的老化而表現量逐漸減少。但半乳糖凝集素 -3 與 PIAS1 的表現量在野生型小鼠中並不受老化所影響。這些結果顯示在 APP/PS1 小鼠中的半乳糖凝集素-3 的表現造成了發炎反應，而此發炎反應 又進一步促進了乙型類澱粉蛋白的寡聚合作用及阿茲海默症病程的惡化。
此外，在半乳糖凝集素-3 基因剔除小鼠的海馬迴中觀察到腦啡肽酶表現量 的增加，顯示半乳糖凝集素-3 可能經由減少乙型類澱粉蛋白的代謝而增加 其寡聚合作用。此外，在三個月大APP/PS1 小鼠的半乳糖凝集素-3 表現量 即比同齡野生型小鼠增加許多，顯示在阿茲海默症病情尚未嚴重發展前即 可偵測到半乳糖凝集素-3 的表現異常，這或許可以做為未來對於初期阿茲 海默症診斷的一個指標。
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Abdallah B, Hassan A, Benoist C, Goula D, Behr JP, Demeneix BA (1996) A powerful nonviral vector for in vivo gene transfer into the adult mammalian brain: polyethylenimine. Human gene therapy 7:1947-1954.
Almeida CG, Takahashi RH, Gouras GK (2006) Beta-amyloid accumulation impairs multivesicular body sorting by inhibiting the ubiquitin-proteasome system. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 26:4277-4288.
Boletta A, Benigni A, Lutz J, Remuzzi G, Soria MR, Monaco L (1997) Nonviral gene delivery to the rat kidney with polyethylenimine. Human gene therapy 8:1243-1251.
Boza-Serrano A, Reyes JF, Rey NL, Leffler H, Bousset L, Nilsson U, Brundin P, Venero JL, Burguillos MA, Deierborg T (2014) The role of Galectin-3 in α-synuclein-induced microglial activation. Acta Neuropathologica
Communications 2:156
Butterfield DA (2014) The 2013 discovery award from the society for free radical biology and medicine: selected discoveries from the butterfield laboratory of oxidative stress and its sequelae in brain in bognitive disorders exemplified by alzheimer disease and chemotherapy induced cognitive impairment. Free radical biology & medicine 0:157-174.
Cai Z, Hussain MD, Yan LJ (2014) Microglia, neuroinflammation, and beta-amyloid protein in Alzheimer's disease. The International journal of neuroscience 124:307-321.
Calabresi PA (2004) Diagnosis and management of multiple sclerosis. American family physician 70:1935-1944.
Chen YC, Hsu WL, Ma YL, Tai DJ, Lee EH (2014) CREB SUMOylation by the E3 ligase PIAS1 enhances spatial memory. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 34:9574-9589.
Chiou HY, Liu SY, Lin CH, Lee EH (2014) Hes-1 SUMOylation by protein inhibitor of activated STAT1 enhances the suppressing effect of Hes-1 on GADD45alpha
‧
expression to increase cell survival. Journal of biomedical science 21:53.
Cras P, Kawai M, Lowery D, Gonzalez-DeWhitt P, Greenberg B, Perry G (1991) Senile plaque neurites in Alzheimer disease accumulate amyloid precursor protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 88:7552-7556.
Danilova N (2006) The evolution of immune mechanisms. Journal of experimental zoology Part B, Molecular and developmental evolution 306:496-520.
Diaz-Alvarez L, Ortega E (2017) The many roles of galectin-3, a multifaceted molecule, in innate immune responses against pathogens. Mediators of inflammation 2017:9247574.
Ehehalt R, Keller P, Haass C, Thiele C, Simons K (2003) Amyloidogenic processing of the Alzheimer beta-amyloid precursor protein depends on lipid rafts. The Journal of cell biology 160:113-123.
Esch FS, Keim PS, Beattie EC, Blacher RW, Culwell AR, Oltersdorf T, McClure D, Ward PJ (1990) Cleavage of amyloid beta peptide during constitutive
processing of its precursor. Science 248:1122-1124.
Evin G, Weidemann A (2002) Biogenesis and metabolism of Alzheimer's disease Abeta amyloid peptides. Peptides 23:1285-1297.
Fanselow MS, Dong HW (2010) Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures? Neuron 65:7.
Fortuna-Costa A, Gomes AM, Kozlowski EO, Stelling MP, Pavao MS (2014) Extracellular galectin-3 in tumor progression and metastasis. Frontiers in oncology 4:138.
Frisch SM, Screaton RA (2001) Anoikis mechanisms. Current opinion in cell biology 13:555-562.
Golde TE, Koo EH, Felsenstein KM, Osborne BA, Miele L (2013) γ-Secretase Inhibitors and Modulators. Biochimica et biophysica acta 1828.
Gong CX, Shaikh S, Wang JZ, Zaidi T, Grundke-Iqbal I, Iqbal K (1995) Phosphatase activity toward abnormally phosphorylated tau: decrease in Alzheimer disease brain. Journal of neurochemistry 65:732-738.
Graeber MB, Kosel S, Grasbon-Frodl E, Moller HJ, Mehraein P (1998)
Histopathology and APOE genotype of the first Alzheimer disease patient, Auguste D. Neurogenetics 1:223-228.
‧
Haass C, Kaether C, Thinakaran G, Sisodia S (2012) Trafficking and Proteolytic Processing of APP. Cold Spring Harbor perspectives in medicine
2(5):a006270.
Hoyos HC, Rinaldi M, Mendez-Huergo SP, Marder M, Rabinovich GA, Pasquini JM, Pasquini LA (2014) Galectin-3 controls the response of microglial cells to limit cuprizone-induced demyelination. Neurobiology of disease 62:441-455.
Jeon SB, Yoon HJ, Chang CY, Koh HS, Jeon SH, Park EJ (2010) Galectin-3 exerts cytokine-like regulatory actions through the JAK-STAT pathway. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950) 185:7037-7046.
Karran E, Mercken M, De Strooper B (2011) The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nature reviews Drug discovery 10:698-712.
Koo EH, Sisodia SS, Archer DR, Martin LJ, Weidemann A, Beyreuther K, Fischer P, Masters CL, Price DL (1990) Precursor of amyloid protein in Alzheimer
disease undergoes fast anterograde axonal transport. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 87:1561-1565.
Larson ME, Lesne SE (2012) Soluble Abeta oligomer production and toxicity. Journal of neurochemistry 120 Suppl 1:125-139.
Lashuel HA, Hartley D, Petre BM, Walz T, Lansbury PT, Jr. (2002)
Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations. Nature 418:291.
Lauren J, Gimbel DA, Nygaard HB, Gilbert JW, Strittmatter SM (2009) Cellular prion protein mediates impairment of synaptic plasticity by amyloid-beta oligomers.
Nature 457:1128-1132.
Lee S, Fernandez EJ, Good TA (2007) Role of aggregation conditions in structure, stability, and toxicity of intermediates in the Aβ fibril formation pathway.
Protein Science : A Publication of the Protein Society 16:723-732.
Li X, Zhang X, Ladiwala ARA, Du D, Yadav JK, Tessier PM, Wright PE, Kelly JW, Buxbaum JN (2013) Mechanisms of Transthyretin Inhibition of β-Amyloid Aggregation In Vitro. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 33:19423-19433.
Li X, Zhang X, Ladiwala ARA, Du D, Yadav JK, Tessier PM, Wright PE, Kelly JW, Buxbaum JN (2013) Mechanisms of Transthyretin Inhibition of β-Amyloid Aggregation In Vitro. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 33:19423-19433.