一、 探討 LPS 對 THP-1 細胞釋放 MMP-9 之活性與蛋白表現之影響
由於單核球細胞在 LPS 刺激下會釋放出 MMP-9，造成組織的損傷，
因此要討論給予不同濃度的 LPS(10, 50, 100 及 500 ng/ml)，THP-1 細 胞釋放 MMP-9 的情形與其活性(Figure 1)。由電泳酵素分析法的實驗 結果發現，在 10、50、100、500 ng/ml LPS 刺激下，MMP-9 的活化 程度分別為未刺激組的 2.6 ± 0.6 倍(10 ng/ml, n=3)、3.6 ± 0.2 倍(50 ng/ml, n=3)、4.3 ± 0.2 倍(100 ng/ml, n=3)、6.4 ± 0.9 倍(500 ng/ml, n=3)，
隨著 LPS 的濃度增高，THP-1 細胞釋放 MMP-9 及其活性也隨著提高，
且在濃度 50 ng/ml 時就有明顯的刺激效果，且有濃度梯度的效應。接 著以西方點墨法觀察 THP-1 細胞在不同濃度的 LPS(10, 50, 100 及 500 ng/ml)刺激下，對於 MMP-9 蛋白表現量的影響(Figure 2)。由結果發 現在 10、50、100、500 ng/ml LPS 刺激下，MMP-9 的蛋白表現量分 別為未刺激組的 1.4 倍(10 ng/ml, n=1)、4.7 倍(50 ng/ml, n=1)、5.7 倍 (100 ng/ml, n=1)、4.9 倍(500 ng/ml, n=1)，綜合以上的結果發現 LPS 能夠增加 MMP-9 的酵素活性與表現。
二、 探討 Indole 類藥物(Indoprofen、Carprofen、Etodolac) 以及
CAPE 對 MMP-9 的作用
在先前的實驗就已經證實 LPS 確實可以增加 THP-1 細胞 MMP-9 的活性與釋放，接著以不同的藥物: indoprofen (20 μM)(附圖一. B)、
carprofen (20 μM) (附圖一. A)、etodolac (20 μM) (附圖一. C)與 CAPE (20 μM)以觀察細胞對由 LPS 刺激所產生的 MMP-9 活性影響(Figure 3)。由實驗結果發現，在 LPS (50 ng/ml)的刺激情況下，MMP-9 的活 化程度為未刺激組的 3.1 ± 0.3 倍(n=3)，而各個藥物的抑制情況分別 為 indoprofen (20 μM)的濃度下 LPS 刺激作用為 2 ± 0.3 倍(n=3)，
etodolac (20 μM)的濃度下 LPS 刺激作用為 2 ± 0.3 倍，carprofen (20 μM) 的濃度下 LPS 刺激作用為 1.2 ± 0.2 倍(n=3)，CAPE (20 μM)的濃度下 LPS 刺激作用為 1.9 ± 0.4 倍(n=3)。由本結果可以發現在 LPS 刺激下，
carprofen 與 CAPE 抑制 MMP-9 活性的效果最為明顯，故在此選擇 carprofen 與 CAPE 做更進一步的研究。
三、 探討 Carprofen 與 CAPE 對於 LPS 誘導 THP-1 細胞釋放
MMP-9 活性之影響
由先前的實驗選擇 carprofen 與 CAPE 當作實驗藥物，接下來將 加入各種不同濃度的 carprofen (1、5、10、20 μM)與 CAPE (10、20、
50 μM) 觀察藥物對於 LPS (50 ng/ml )刺激 THP-1 細胞產生 MMP-9 的活性之影響程度。由實驗結果發現，在 carprofen 組中(Figure 4)，
當 LPS 刺激情況下，MMP-9 活化程度為未刺激組的 3.4 ± 0.2 倍(n=4)，
在 carprofen 各濃度作用下 LPS 刺激作用分別為未加刺激組的 2.5 ± 0.3 倍(1 μΜ, n=4)，1.9 ± 0.2 倍(5 μΜ, n=4)，1.6 ± 0.3 倍(10 μΜ, n=4) 及 1.3 ± 0.2 倍(20 μΜ, n=4)，且在 carprofen 1 μΜ 下就能夠明顯的抑 制 MMP-9 的活性；在 CAPE 組中(Figure 5)，當 LPS 刺激情況下，
MMP-9 活化程度為未刺激組的 3.9 ± 0.1 倍(n=3)，在 CAPE 各濃度作 用下 LPS 刺激作用分別為未加刺激組的 1.6 ± 0.1 倍(10 μΜ, n=3)，1.5
± 0.1 倍(20 μΜ, n=3)及 0.9 ± 0.4 倍(50 μΜ, n=3)，且 CAPE 在 10 μΜ 就有抑制 MMP-9 活性的作用。
四、 探討 Carprofen 與 CAPE 對於 LPS 誘導 THP-1 細胞分泌
TIMP-1 的影響
TIMP-1 為內生性的 MMP-9 抑制劑，由前面的實驗可以知道 carprofen 與 CAPE 確實可以抑制 MMP-9 的活性。故在此要探討 carprofen 與 CAPE 抑制 MMP-9 活性的作用是否是經由增加 TIMP-1 的表現量。以 Reverse zymography 觀察在 LPS (50 ng/ml)刺激 THP-1 細胞中，TIMP-1 的表現。在 carprofen 組中(Figure 6)，當 LPS 刺激情
況下，TIMP-1 活化程度為未刺激組的 1.1 ± 0.1 倍(n=3)，在 carprofen 各濃度作用下 LPS 刺激作用分別為未加刺激組的 1.0 ± 0.1 倍(1 μΜ, n=3)，1.0 ± 0.0 倍(5 μΜ, n=3)，0.89 ± 0.0 倍(10 μΜ, n=3)及 0.79 ± 0.0 倍(20 μΜ, n=3)，在 carprofen 10 μΜ 與 20 μΜ 時，對於 TIMP-1 的表 現有抑制的作用，並具有統計意義；在 CAPE 組中(Figure 7)，當 LPS 刺激情況下，TIMP-1 活化程度為未刺激組的 1.1 ± 0.1 倍(n=3)，在 CAPE 各濃度作用下 LPS 刺激作用分別為未加刺激組的 1.0 ± 0.1 倍 (10 μΜ, n=3)，0.9 ± 0.2 倍(20 μΜ, n=3)及 0.5 ± 0.1 倍(50 μΜ, n=3)，且 在 CAPE 50 μΜ 下會大量減少 TIMP-1 的表現。
五、 探討 Carprofen 與 CAPE 對於 LPS 誘導 THP-1 細胞生成
MMP-9 蛋白之影響
以西方點墨法觀察在各種不同濃度的 carprofen (1, 5, 10, 20 μM) 與 CAPE (10, 20, 50 μM)對 LPS ( 50 ng/ml )刺激 THP-1 產生 MMP-9 的蛋白量之影響程度。由實驗結果發現，在 carprofen 組中(Figure 8)，
當 LPS 刺激情況下，MMP-9 蛋白表現量為未刺激組的 3.7 ± 0.2 倍 (n=3)，在 carprofen 各濃度作用下 LPS 刺激作用分別為未加刺激組的 2.1 ± 0.3 倍(1 μΜ, n=3)，2.1 ± 0.4 倍(5 μΜ, n=3)，1.5 ± 0.4 倍(10 μΜ, n=3)及 1.2 ± 0.1 倍(20 μΜ, n=3)，且在 carprofen 1 μΜ 下就能夠有意義
的抑制 MMP-9 蛋白表現，在 20 μΜ 的濃度下，MMP-9 蛋白表現接 近 control 組；在 CAPE 組中(Figure 9)，當 LPS 刺激情況下，MMP-9 蛋白表現為未刺激組的 3.0 ± 0.2 倍(n=3)，在 CAPE 各濃度作用下 LPS 刺激作用分別為未加刺激組的 1.6 ± 0.2 倍(10 μΜ, n=3)，1.3 ± 0.3 倍 (20 μΜ, n=3)及 1.2 ± 0.2 倍(50 μΜ, n=3)，且在 CAPE 10 μΜ 下就有抑 制 MMP-9 蛋白表現的作用，濃度增加時，抑制效果也更為明顯。
六、 探討 Carprofen 與 CAPE 的細胞毒性
由電泳酵素分析法及西方點墨法的結果顯示，carprofen 與 CAPE 對於在 LPS 刺激下的 THP-1 細胞之 MMP-9 蛋白表現與活性都有抑制 作用。因此接下來要討論 carprofen 與 CAPE 抑制 MMP-9 的作用是否 是由於藥物的細胞毒性。在此使用 MTT assay 測定細胞的存活情況。
加入各種不同濃度的 carprofen (5、10、20 μM)與 CAPE (10、20、50 μM)，
觀察藥物對 THP-1 細胞是否有毒性作用。在 carprofen 各濃度作用下 (Figure 10)，與未加藥物組相比，其存活率為 1.1 ± 0.1 倍(5 μΜ, n=3)，
1.0 ± 0.1 倍(10 μΜ, n=3)及 0.9 ± 0.1 倍(20 μΜ, n=3)，由結果可發現，
carprofen 不會影響細胞的存活，對 THP-1 細胞不具有細胞毒性；在 CAPE 各濃度作用下(Figure 11)，與未加藥物組相比，其存活率為 1.0
± 0.1 倍(10 μΜ, n=3)，0.7 ± 0.1 倍(20 μΜ, n=3)及 0.5 ± 0.0 倍(50 μΜ,
n=3)，由 CAPE 的結果發現，當 CAPE 濃度增加時，細胞的存活率會 減少，在濃度 20 μM 時，細胞的存活率呈現有意義的減少，由此可 推測 CAPE 會抑制 THP-1 細胞的存活。
七、 探討 LPS 對於 THP-1 細胞之 MMP-9 mRNA 表現的影響
使用 RT-PCR 探討 LPS 刺激對 THP-1 細胞 mRNA 表現的影響。
以 LPS (50 ng/ml)在不同的時間點 0、6、8、10、12 小時刺激下(Figure 12A)，與未加入刺激劑相比，其 MMP-9 mRNA 表現量分別為分別為 未刺激組的 15.1 倍(6 小時, n=1)，12.6 倍(8 小時, n=1)，16.2 倍(10 小時, n=1)與，17.1 倍(12 小時, n=1)。最後選擇 8 小時為 mRNA 的刺 激時間點作以下的實驗。
八、 探討在 LPS 刺激下 CAPE 與 Carprofen 對於 THP-1 細胞之
MMP-9 mRNA 表現的影響
以西方點墨法觀察在各種不同濃度的 carprofen (10, 20 μM)與 CAPE (10, 20 μM)對 LPS ( 50 ng/ml )刺激 THP-1 產生 MMP-9 mRNA 的抑制作用。由實驗結果發現，在 carprofen 組中(Figure 12B)，當 LPS 刺激情況下，MMP-9 蛋白表現量為未刺激組的 8.9 倍(n=1)，在 carprofen 各濃度作用下 LPS 刺激作用分別為未加刺激組的 5.9 倍(10 μΜ, n=1)及 5.2 倍(10 μΜ, n=1)，且在 carprofen 10 μΜ 下就能夠顯著
的抑制 MMP-9 mRNA 表現；而在 CAPE 組中(Figure 12C)，當 LPS 刺激情況下，MMP-9 蛋白表現為未刺激組的 8.1 倍(n=1)，在 CAPE 各濃度作用下 LPS 刺激作用分別為未加刺激組的 5.8 倍(10 μΜ, n=1) 與 4 倍(20 μΜ, n=1)，且 CAPE 在 10 μΜ 下就能抑制 MMP-9 mRNA 表現，濃度增加時，抑制效果也更為明顯。
九、 探討 LPS 對於 THP-1 細胞之 NF-κB reporter 基因活化的影響
由於 MMP-9 的 promoter 上含有 NF-κB 結合位置，所以使用 Transfection 方法，將 NF-κB 基因轉殖進入 THP-1 細胞，加入刺激劑 LPS(50 mg/ml)，分別刺激 0、2、4、6 小時，由 Figure 13 可知在 LPS 刺激 2、4、6 小時下，THP-1 細胞中 NF-κB reporter 基因活化的情況 分別是 1.1 ± 0.1 倍(2 小時, n=3)，1.9 ± 0.1 倍(4 小時, n=3)，3.1 ± 0.4 倍(6 小時, n=3)，由結果可以發現在刺激 6 小時的時候，NF-κB reporter 基因的活化達到最大量，且具有統計上的意義。此外在 LPS 刺激 8 與 10 小時的時候，轉殖入細胞的基因已經開始被細胞所丟出，因此 不考慮後面的時間點，最後選擇 6 小時作為刺激時間。
十、 探討 Carprofen 與 CAPE 對於 NF-κB reporter 基因活化的影響
在前面的實驗中發現 carprofen 與 CAPE 能夠抑制 MMP-9 的活性、
蛋白表現量以及 mRNA 表現。接下來要探討 carprofen 與 CAPE 對於
MMP-9 的抑制作用是否是經由抑制 MMP-9 的基因 promoter 上的 NF-κB 而來，本實驗以 parthenolide 10 μΜ 作為對照組。由實驗結果 發現，在 carprofen 組中(Figure 14)，當 LPS 刺激情況下，NF-κB 基因 活化程度為未刺激組的 2.6 ± 0.4 倍(n=4)，在 carprofen 各濃度作用下 LPS 刺激作用分別為未加刺激組的 2.9 ± 0.6 倍(5 μΜ, n=4)，3.1 ± 0.3 倍(10 μΜ, n=4)，2.7 ± 0.3 倍(20 μΜ, n=4)及 parthenolide 1.2 ± 0.2 倍(10 μΜ, n=3)，由結果可知 carprofen 對於 NF-κB reporter 基因的活化完全 沒有影響，因此推測其抑制點不是 NF-κB；在 CAPE 組中(Figure 15)，
當 LPS 刺激情況下 NF-κB reporter 基因活化程度為未刺激組的 2.6 ± 0.4 倍(n=4)，在 CAPE 各濃度作用下 LPS 刺激作用分別為未加刺激組 的 2.2 ± 0.4 倍(10 μΜ, n=4)，1.7 ± 0.3 倍(20 μΜ, n=4)，0.5 ± 0.0 倍(50 μΜ, n=4)及 parthenolide 1.3 ± 0.2 倍(10 μΜ, n=4)，且在 CAPE 20 μΜ 下就有抑制 NF-κB reporter 基因活化的作用。
十一、 探討 p38、Akt、JNK、ERK 與 NF-κB 抑制劑對 LPS 刺激
THP-1 細胞釋放 MMP-9 活性
LPS 所活化的訊息傳遞路徑主要有 MAPK、PI3K 與 NF-κB。在 此加入不同訊息的抑制劑分別為 JNK inhibitor：SP600125 (10 μM)、
p38 inhibitor：SB203580 (10 μM)、Akt inhibitor：LY294002 (5 μM)、
NF-κB inhibitor：Parthenolide (10 μM)與 ERK inhibitor：PD98059 (20 μM)觀察各種訊息抑制劑對 LPS 刺激 THP-1 細胞釋放 MMP-9 的活性 之影響，由電泳酵素分析法實驗結果發現，在 p38、Akt、JNK、ERK 與 NF-κB 抑制劑的作用下 (Figure 16A)，LPS (50 ng/ml) 所誘導 THP-1 細胞釋放 MMP-9 的活性為未刺激組的 3.4 ± 0.0 倍(n=3)，在 SP600125 (10 μM) 、 SB203580 (10 μM) 、 LY294002 (5 μM) 、 Parthenolide (10 μM)與 PD98059 (20 μM)的作用下，LPS 刺激作用分 別為未加刺激組的 1.5 ± 0.1 倍(SP600125, 10 μΜ, n=3)，2.6 ± 0.1 倍 (SB203580, 10 μΜ, n=3)，1.3 ± 0.1 倍(LY294002, 5 μΜ, n=3)，1.3 ± 0.2 倍(Parthenolide, 10 μΜ, n=3)及 1.2 ± 0.2 倍(PD98059, 20 μΜ, n=3)。此 外，由西方點墨法結果發現，在 p38、Akt、JNK、ERK 與 NF-κB 抑 制劑的作用下 (Figure 16B)，LPS (50 ng/ml) 所誘導 THP-1 細胞釋放 MMP-9 的活性為未刺激組的 4.8 倍(n=1)，在各種抑制劑作用下，LPS 刺激作用分別為未加刺激組的 0.5 倍(SP600125, 10 μΜ, n=1)，3.7 倍 (SB203580, 10 μΜ, n=1)，1 倍(LY294002, 5 μΜ, n=1)，1 倍(Parthenolide, 10 μΜ, n=1)及 0.8 倍(PD98059, 20 μΜ, n=1)。由本結果可以推測在 LPS 所誘導 THP-1 細胞釋放 MMP-9，其訊息傳導路徑可能主要是經 由 Akt、JNK、ERK 與 NF-κB。
十二、 探討在 LPS 刺激下 THP-1 細胞內 ERK 的活化
選擇 15、30、45、60、90 和 120 分鐘作為 LPS 的刺激時間，由 Figure 17A 可發現，THP-1 細胞在受到 LPS 刺激的 15、30、45、60、90 和 120 分鐘其磷酸化 ERK 的刺激倍數分別為未刺激組的 1.2 倍(15 mins, n=1)，0.8 倍(30 mins, n=1)，0.7 倍(45 mins, n=1)，1.1 倍(60 mins, n=1)，
1.5 倍(90 mins, n=1)及 1.1 倍(120 mins, n=1)。結果顯示，當 THP-1 細 胞受到 LPS 刺激時，在 90 分鐘 ERK 的磷酸化會達到最大值。
十三、 探討在 LPS 刺激下 THP-1 細胞內 p38 的活化
在許多文獻中都指出 LPS 可以經由活化 MAPK 進而增加 MMP-9 的表現，因此使用西方點墨法觀察 THP-1 細胞在 LPS (50 ng/ml) 的 刺激下，是否能夠引發 p38 的活化。因為細胞內訊息活化的時間很短，
因此選擇 15、30、45、60、90 和 120 分鐘作為 LPS 的刺激時間，由 Figure 18A 可發現，THP-1 細胞在受到 LPS 刺激的 15、30、45、60、
90 和 120 分鐘其磷酸化 p38 的刺激倍數分別為未刺激組的 1.0 ± 0.1 倍(15 mins, n=3)，1.3 ± 0.1 倍(30 mins, n=3)，1.7 ± 0.1 倍(45 mins, n=3)，
2.2 ± 0.2 倍(60 mins, n=3)，2.9 ± 0.5 倍(90 mins, n=3)及 2.2 ± 0.1 倍(120 mins, n=3)。結果顯示，當 THP-1 細胞受到 LPS 刺激時，在 90 分鐘 p38 的磷酸化會達到最大值，且具統計意義。
十四、 探討在 LPS 刺激下 THP-1 細胞內 JNK 的活化
選擇 15、30、45、60、90 和 120 分鐘作為 LPS 的刺激時間，由 Figure 19 可發現，THP-1 細胞在受到 LPS 刺激的 15、30、45、60、90 和 120 分鐘其磷酸化 JNK 的刺激倍數分別為未刺激組的 1.5 ± 0.1 倍(15 mins, n=2)，2.6 ± 0.2 倍(30 mins, n=2)，3.9 ± 0.8 倍(45 mins, n=2)，2.7
± 0.7 倍(60 mins, n=2)，2.5 ± 1.3 倍(90 mins, n=2)及 2.0 ± 1.0 倍(120 mins, n=2)。結果顯示，當 THP-1 細胞受到 LPS 刺激時，在 45 分鐘 JNK 的磷酸化會達到最大值。
十五、 探討在 LPS 刺激下 THP-1 細胞內 Akt 的活化
在 LPS 刺激 THP-1 細胞產生 MMP-9 的過程中，PI3K-Akt 路徑 也被認為扮演重要角色，因此使用西方點墨法觀察 THP-1 細胞在 LPS (50 ng/ml) 的刺激下，是否能夠引發 Akt 的活化。因為細胞內訊息活 化的時間很短，因此選擇 15、30、45、60、90 和 120 分鐘作為 LPS 的刺激時間，由 Figure 20A 可發現，THP-1 細胞在受到 LPS 刺激的 15、30、45、60、90 和 120 分鐘其磷酸化 Akt 的刺激倍數分別為未 刺激組的 1.1 ± 0.1 倍(15 mins, n=3)，0.90 ± 0.0 倍(30 mins, n=3)，0.9 ± 0.0 倍(45 mins, n=3)，1.2 ± 0.0 倍(60 mins, n=3)，1.3 ± 0.1 倍(90 mins, n=3)及 1.5 ± 0.2 倍(120 mins, n=3)。結果顯示，當 THP-1 細胞受到 LPS
刺激時，在 120 分鐘 Akt 的磷酸化會達到最大值，且具統計意義。
十六、 探討 CAPE 與 Carprofen 對於 LPS 刺激 THP-1 細胞內 JNK、