根據臨床醫學的統計，敗血症的死亡率約為 15％，但在嚴重性 的敗血症死亡率躍升到 20％，若病程發展到敗血性休克時，其死亡 率增加到 45％。在美國，每年約有 75 萬個敗血症病患產生，而付出 的醫療成本為 167 億美金(Angus et al., 2001)。敗血症的預後與年紀有 相關性。在新生兒的致死率較低，20 歲到 75 歲的族群，其致死率隨 年紀而增加(Angus et al., 2001)。敗血症是由於外來微生物的入侵造成 先天與後天免疫防禦系統活化。在發炎反應產生時，會先激活先天性 免疫系統，促使單核球活化。此外，有多篇研究指出單核球對於敗血 症病理變化扮演重要角色(Haveman et al., 1999)。因此，本研究中所 使用的細胞為 THP-1 細胞與人類初級單核球細胞，藥物為 carprofen 與 CAPE，carprofen 曾經使用在臨床上作為抗發炎用藥，由於在藥理 機轉上能夠抑制 prostagladin E2的合成，因此被認為具有免疫調節的 作用(Goodwin, 1984)。CAPE 為蜂蠟中的一個活性成分，在許多文獻 中都證實有抗發炎的效果，在此我們要探討 carprofen 與 CAPE 對於 MMPs 之活化與表現的影響。
脂多醣體(LPS, Lipopolysaccharide)是革蘭氏陰性菌的外膜成分，
單核球與巨噬細胞是發炎部位的主要細胞，在 LPS 的刺激下，單核 球能夠分泌細胞激素，花生四烯酸的代謝脂質性產物及釋放有毒性的 氧自由基(Nathan, 1987)。由於這些發炎性激素生成和 MMPs 的釋放，
對宿主組織造成傷害，在敗血症病患會造成敗血性休克與器官衰竭甚 至死亡(Ulevitch et al., 1989)。在人體靜脈注射約 1mg 的 LPS 在兩小 時後就可以引發敗血症的病徵表現。LPS 在人體內可以與 LBP 形成 複合體後，與單核球細胞膜上的 CD14 交互作用連接到 Toll-like receptor 上，引起一連串發炎性的訊息傳遞，其中包含了 MAPK 與 PI3K-Akt pathway 的 活 化 。 對 於 巨 噬 細 胞 而 言 ， LPS 能 夠 引 發 proMMP-9 的生成(Min et al., 2002)。在細菌引起的敗血症中，MMP-9 與其他發炎因子會迅速的被釋放，另外，MMP 可以作為感染時細胞 活化的早期指標(Masure et al., 1991; Opdenakker et al., 1991; Pugin et
al., 1999)。
在本研究中，首先以電泳酵素分析法證實了 THP-1 細胞在不同 濃度的 LPS ( 10、50、100、500 ng/ml )刺激 24 小時下，確實可以增 加 MMP-9 的活性。接下來以西方點墨法觀察 LPS 刺激後 24 小時，
其 MMP-9 蛋白的表現量，由結果發現 LPS 也能增加 THP-1 細胞的蛋 白質表現量，這兩個結果都呈現了濃度梯度效應。文獻指出，敗血症 病人體內的 MMP-9 會增加，是在開始的 24 小時(Paemen et al., 1997;
Pugin et al., 1999)。當 LPS 的濃度到達 1 μg/ml 時，能夠發現其刺激 MMP-9 活性與蛋白表現的能力會達到飽和狀態( 數據未放入 )，與文 獻相符。由這個結果選擇一個適當的濃度作以下實驗。對照敗血症病
人血中 LPS 濃度，由於在 10 ng/ml 時刺激倍率不夠高，不易觀察，
因此最後選擇的濃度為 50 ng/ml，並以此作為敗血症的細胞實驗的模 式。
Etodolac, indoprofen 與 carprofen 在結構上都屬於 indene 類 NSAIDs 的藥物，其中 etodolac 與 indoprofen 仍在臨床上使用，大多 用於消炎止痛。Indoprofen 的結構由於含有 2-arylpropionic acid 具有
光敏感性，經過紫外線激發後會產生裂解產物(Bosca et al., 2001)，有 致癌的危機(Gentil et al., 1997)。CAPE 為蜂蠟活性成分，有文獻指出 CAPE 可抑制花生四烯酸由細胞膜的釋放(Michaluart et al., 1999)，達 到降低發炎的效果。
由結果可以發現，在 LPS 的刺激下，相同濃度的藥物對 MMP-9 活性的抑制作用最為明顯的是 carprofen，etodolac、indoprofen 與 CAPE 的壓制效果較差，推測在 LPS 所引發的訊息傳導路徑並不完全只有 NF-κB 的參與。選擇 carprofen 與 CAPE 濃度分別為 1、5、10 與 20 μΜ 及 10、20 與 50 μΜ 作為實驗藥物的濃度，進行以下各項實驗。
在 LPS 所引起 MMP-9 的活性與蛋白表現量增加的現象，結果顯 示無論是 carprofen 或 CAPE 都能夠抑制 THP-1 與人類初級單核球細 胞中，由 LPS 所誘導產生的 MMP-9 活性及蛋白表現。且兩者的抑制
作用都是呈現濃度梯度效應，推測抑制作用的來源可能為內生性的 MMP-9 抑制劑 TIMP-1, 可能來自於藥物對細胞的毒性作用或是更上 游的 transcription 而來。
MMP-9 的內生性抑制劑為 TIMP-1，MMP-9 與 TIMP-1 在人體內 的平衡，在發炎反應中扮演了很重要的角色。敗血症時，TIMP-1 得 血中濃度會大幅度的上升，敗血症的死亡病例中，其 TIMP-1 的含量 高於其他存活病例。因此，TIMP-1 血中的濃度可作為一個評估敗血 症病人死亡率以及預後的一個參考指標。當病人血中 TIMP-1 的濃度 高達 3200 ng/ml 時，病患在 28 天內死亡的機率比 TIMP-1 低的病人 多了 4.5 倍(Hoffmann et al., 2006)。結果顯示，carprofen 只有在 10、
20 μM 的濃度下才能夠抑制 TIMP-1 的表現，而 CAPE 在 50 μM 的濃 度下的抑制作用才具有統計意義。由這樣的結果可以推測，這些藥物 對於 MMP-9 的抑制作用，TIMP-1 不是抑制作用的來源。因此，在下 面的實驗主要目的是研究藥物對細胞的毒性作用。在文獻中指出，
CAPE 對於癌細胞具有毒殺作用(Jin et al., 2008)，在此我們的實驗細 胞為 THP-1 細胞，屬於癌細胞。可以發現在 20μM 與 50μM 的濃度下，
細胞就有死亡的情況發生，與前面 CAPE 壓制作用的強度比較，其對 於 TIMP-1 的抑制作用推測是來自於細胞的死亡，但其對 MMP-9 活 性與蛋白表現的抑制作用應有其他機轉的參與，因為在 10 μM 下，
細胞的存活不受影響，但是對於 MMP-9 的抑制作用都達七成以上，
所以推估 CAPE 對於 MMP-9 的抑制作用有其他機轉參與。由結果發 現 carprofen 不會細胞的存活，沒有細胞毒性作用。所以 carprofen 可 能是作用在轉譯或轉錄的階層。
文獻指出，LPS 能夠誘導單核球和巨噬細胞 MMP-9 的生成，主 要 是 由 PGE2-cAMP-dependent pathway 而 來 (Busiek et al., 1995;
Pentland et al., 1995; Shankavaram et al., 1997; Shapiro et al., 1993;
Wahl and Lampel, 1987)。接下來以 RT-PCR 看藥物的抑制蛋白表現的 作用是否是經由降低 MMP-9 mRNA 表現而來。結果顯示，carprofen 與 CAPE 對於 MMP-9 mRNA 的抑制作用很明顯。由這個結果可以推 測 mRNA 不是藥物抑制作用的起點，藥物作用可能在基因或訊息傳 遞階層。
NF-κB 是人體免疫反應中最重要的一個媒介物質，NF-κB 的活化 能夠調節體內許多基因的表現。在許多細胞中，細菌或其產物能夠活 化 NF-κB，而 NF-κB 的活化能夠促使 200 種以上的基因表現，這些 基因參與了發炎、細胞凋亡、細胞增生與分化、器官發展和癌化。因 此，能藉由 NF-κB 活化而製造的蛋白都與宿主免疫系統相關。在這 裡面包含了 27 種的細胞激素與化學趨化激素、免疫反應所需的接受
體如: MHC 等、與抗原呈現相關的蛋白以及嗜中性白血球要穿越血管 壁而進行黏附與遷移之接受器。在敗血症產生時，細胞內會有一連串 的訊息傳遞路徑，最後使 NF-κB 活化。文獻指出在 MMP-9 基因的啟 動子上，具有 AP-1(Campbell et al., 2001; He, 1996; Huhtala et al., 1991;
Sato and Seiki, 1993)與 NF-κB(Campbell et al., 2001; Han et al., 2001;
He, 1996; Sato and Seiki, 1993)的結合位置。在此先以 transfection 的方 式觀察 NF-κB 在細胞內的活化情況。由結果可以發現，CAPE 對於 NF-κB 的活化具有抑制作用，這個結果與文獻符合。在 carprofen 的 部分，其對於 NF-κB 的活化是完全沒有抑制的效果。因此，由 transfection 的結果可以推測 carprofen 可能是藉由作用在 AP-1 抑制 MMP-9 的合成或其他上游機制。
根據文獻指出，在敗血症時，訊息傳遞路徑主要為 MAPK 與 PI3K-Akt 這兩條路徑。MAPK 是一群很重要的激酶，當發炎反應產 生時，它們可以快速的活化下游發炎性訊息，最後使核內蛋白與傳遞 因子活化。MAPK 的成員包含 ERK、JNK 和 p38。由 MAPK 所引發 的訊息傳遞路徑會有細胞特異性。當 ERK 活化時，會使單核球與巨 噬細胞無法調控細胞激素的生成。文獻指出，由 LPS 所導致單核球 細胞 MMP-9 表現的增加主要是經由 ERK 活化。p38 主要被缺血後的 再灌流所活化，當其活化時間延長時，這個現象與 IL-10 的生成相關。
JNK 的活化會使單核球與巨噬細胞合成 TNF 與表現 iNOS(Cuschieri and Maier, 2005)。PI3K 在急性系統性發炎中扮演重要角色，PI3K 會 藉由與細胞膜結合反應產生二級訊息傳遞者，活化其下游 Akt。當 Akt 活化時，可調控許多體內的生理反應與生物活性。Akt 能夠調節 基因轉錄和蛋白質的形成、免疫細胞的化學趨化性( chemotaxis )、細 胞凋亡與細胞的代謝反應。Akt 可以藉由活化 NF-κB 促進發炎性細胞 激素產生，同時也能降低在病理狀態時嗜中性白血球的凋亡。
有文獻指出，在單核球中由 LPS 所誘導的 MMP-9 表現主要是由 ERK 所調控，此外，由於 NF-κB 主要受 Akt 所調控，所以這條路徑 也是較重要的。由結果顯示，在 LPS ( 50 ng/ml )刺激下，加入各種不 同訊息抑制劑對 MMP-9 活性與蛋白表現的影響。可以發現，在細胞 內主要調控 MMP-9 的訊息傳遞路徑為 JNK、ERK、NF-κB 及 Akt，
其中 ERK、NF-κB 及 Akt 的抑制程度較大，推測應該是主要路徑。
在 LPS 的刺激下，細胞內磷酸化 JNK、ERK、p38 及 Akt 都有顯著的 增加。此外，在加入藥物後發現，CAPE 對於 Akt 沒有抑制的作用，
但是，Akt 能夠藉由活化 NF-κB 使 MMP-9 增加，因此推測 CAPE 可 能是藉由抑制 IκB 的降解，並非是抑制上游訊息。另外，CAPE 對於 p38 與 ERK 的抑制效果並不明顯，當 CAPE 增加濃度到 20 μM 時，
其對 ERK 的活化就有抑制的效果，其抑制比例約為 20％，與藥物的
細胞毒性作比較，與濃度 20 Μm 下的細胞存活率相近，因此抑制的 作用有可能來自於藥物的細胞毒性。實驗結果中，無論是 p38 或 ERK，
carprofen 都具有抑制的作用，已知 MAPK 作用的下游為 AP-1，這個 結果或許可以解釋在 transfection 實驗中，carprofen 對於 NF-κB reporter 基因的活化沒有影響，可進一步探討是否作用於 MMP-9 基 因的另一個 promoter AP-1。
綜合以上結果，可以發現 carprofen 與 CAPE 對於 LPS 刺激 THP-1 細胞或人類初級單核球細胞之 MMP-9 生成都有抑制作用。但是，更 進一步的分子機轉尚需其他實驗來證明。