一、 實驗主要詴藥
1. Carprofen 為 NSAIDs 的一種，分子量為 273.71 (附圖一. A)。本
實驗使用的 carprofen 購買自 Sigma 藥廠。實驗藥物所用的溶 劑為 DMSO，加入細胞中含量皆不超過 0.2%。2. Caffeic acid phenethyl ester (CAPE)為蜂蠟中的成分之一，分子
量 284.3 (附圖二)。本實驗使用的 CAPE 購買自 Sigma 藥廠。實驗藥物所用的溶劑為 DMSO，加入細胞中含量皆不超過 0.2%。
二、 實驗細胞
1. THP-1(Human monocytic cell)
購自 American Type Culture Collection (ATCC)。
2. Human primary monocytes
由健康自願者捐贈血液分離而來，本人體詴驗研究計畫經台北 醫學大學 IRB 執行之。
三、 實驗設備
1. 37℃ 恆 溫 培 養 箱 (Kendro Laboratory Product® ， RC03000T-5-AB
2. 光學顯微鏡 (Nikon®，Diaphot 300)
3. 細胞計數器 (Haemocytometer，Hausser Scientific®，Horsham
1490)
4. 離心機 (Kubota 5910；Beckman Coulter Microfuge
®R Centrifug5. 水平式電泳槽組 Hoefer HE33 mini horizontal submarine unit
(Pharmacia Biotech)
6. 垂直電泳槽及鑄膠套件 Hoefer Mini-Vertical electrophoresis
unit SE250 (Amersham Pharmacia Biotech)7. 轉漬槽 Hoefer TE series transphor electrophoresis unit
(Amersham Pharmacia Biotech)8. 影像分析系統 (Vilber Lourmat, France) 9. ELISA reader (MRX microplate reader, USA)
四、 實驗藥品
1. 下列藥品為 Amersham 公司 (Piscataway, NJ) 之產品：
Protein molecular weight markers (Prestain markers) Triton X-100
2. 下列藥品為 Amersham Life Science 公司 (Cleveland, OH)之
產品：Sodium dodecylsulfate (SDS)
Tris (hydroxymethyl)-aminomethane (Tris-base)
3. 下列藥品為 Bio-Rad 公司 (Hercules, CA) 之產品：
Ammonium persulfate (APS) Glycine
Protein assay dye reagent concentrate
4. 下列藥品為 Gibco BRL 公司 (Grand Island, NY) 之產品：
Fetal bovine serum (FBS)
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (with phenol red) Dulbecco’s Modified Eagle Medium (without phenol red) Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)
Penicillin/ Streptomycin/ L-Glutamine
5. 下列藥品為 Sigma 公司 (st. Louis, MO) 之產品：
Aprotinin
Albumin, Human Albumine, Bovine Apocynin
Bovine serum albumin (BSA) Bromophenol blue
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Dithiothretiol (DTT)
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA-2Na)
N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N’-(2-ethanesulfonic acid) (HEPES)
Lipopolysaccharide (LPS) Leupeptin
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)
Sodium orthovandate Sodium pyrophosphate Tetrzolium dye
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)
6. 下列藥品為 Pharmacia Biotech.公司 (Uppsala, Sweden) 之
產品：
Glycerol
Polyoxyethylenesorbitan monolaurate (Tween 20)
N, N, N, N, - Tetramethylethylethylenediamine (TEMED)
7. 下列藥品為 Wako 公司 (Osaka, Japan) 之產品：
Acetic acid
Calcium chloride, Dihydrate Chloroform
Ethanol Glycerol Methanol
Sodium Hydrogen Carbonate Sodium Hydroxide
8. 下列藥品為 MDBio Inc.公司 (Taipei, Taiwan) 之產品：
40 % Acrylamide / Bis solution DNA markers
TBE solution 5X
9. 下列藥品為其他公司之產品：
2-Propanol (Showa)
Sodium fluoride (Fluka, MO) 五、 套組詴劑 (Kit)
Enhanced chemiluminescence (ECL) Western blotting detection reagent (Millipore, MA)
六、 引子(Primer)
1. 購自鉅生(Genemed Synthesis, U.S.A.)公司：
MMP-9 sense: 5’-CGTGGAGAGTCAAATCTCTG-3’
MMP-9 antisense: 5’-CCAAACTGGATGACGATGTCT-3’
2. 購自生工(MDBio Inc.)公司：
GAPDH sense: 5’-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3’
GAPDH antisense: 5’-TCAAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3’
七、 抗體 (Antibody)
SAPK/ JNK Polyclonal Antibody (Cell Signaling, MA) p42/42 MAPK Antibody (Cell Signaling, MA)
Akt Antibody (Cell Signaling, MA) p38 Antibody (Cell Signaling, MA)
Phospho-SAPK/JNK Antibody (Cell Signaling, MA)
Phospho-p42/42 MAPK Antibody (Cell Signaling, MA) Phospho-Akt Antibody (Cell Signaling, MA)
Phospho-p38 Antibody (Cell Signaling, MA)
-tubulin Monoclonal Antibody (NeoMarkers, CA) MMP-9 Antibody (NeoMarkers, CA)
MMP-9 Antibody (Abcam, CA)
Anti-mouse Ig, HRP linked whole antibody (Amersham. NJ) Anti-rabbit Ig, HRP linked whole antibody (Amersham, NJ) Myeloperoxidase Polyclonal Antibody (DakoCytomation, Denmark)
八、 耗材
Blotting paper (Amersham, NJ ) Cassette ( Okamoto, Japan )
Developer and replenisher ( Kodak, NY ) Fixer and replenisher ( Kodak, NY )
Nitrocellulose membrane ( NC;Hybond-C, Amersham, NJ )
Polyvinylidene fluoride microporous membrane ( PVDF;
Hybond-P, Amersham, NJ )
Scientific Imaging film ( Kodak, NY )
6 well plates,12 well plates, 24 and 96 well plates, 75cm2 culture flask 等細胞培耗材 ( Costar, MA; Orange, Belgium )
Eppendorf, 96 well-ELISA plates, cuvette 及 0.2 ml 薄壁微量
PCR 管等實驗耗材( Corning, NY ) 九、 實驗方法
1. 人類單核球細胞 THP-1 之培養 (Human monocyte THP-1 cells culture)
THP-1 cells 為 human acute monocytic leukemia cell line，購自 American Type Culture Collection (ATCC)，將此細胞株之抗凍管由液 態氮中取出，快速置於 37℃之水浴槽(water bath)中解凍 1 分鐘後，迅 速移到無菌操作台(laminar flow)內取出細胞株，放入含有 4~6 ml RPMI 1640 培養液之 75 cm2培養瓶中，此 RPMI 1640 培養液外加 10 % 去活性之胎牛血清(heat-inactivated fetal bovine serum, FBS)、2 mM 之 L-glutamine、100 U/ml penicillin 及 100 g/ml streptomycin。取 20 l 以細胞計數器(Hemocytometer)計算細胞濃度並加入適量 RPMI 1640 培養液，使其細胞濃度介於 4 × 105 ~ 1 × 106 cells/ml。將培養瓶置 於 37℃恆溫箱(incubator)中，以條件 95 % air 及 5 % CO2的混合氣體，
濕度 70 %的環境中培養。當細胞增殖至接近飽和時，以細胞計數器 測量細胞之數量，約 1 × 106 ~ 2 × 106 cells/ml 時，便以 1 : 1 的比例稀 釋做細胞之繼代培養(subculture)。因 THP-1 細胞為懸浮型細胞，故更 換時需先將含細胞之培養液吸至 50 ml 離心管中，在室溫下以轉速 72 g 離心 5 分鐘。離心後，吸除上清液再加入新鮮培養液培養；大約每 隔二至三天便需更換新鮮培養液。細胞於實驗前需更換成含 0.5 % FBS 之 RPMI 1640。
2. 全血分離出人類單核球細胞 (human primary monocytes)
使用 Ficoll-paque 利用細胞密度的原理，由健康捐贈者捐贈的 30 mL 人類全血中分離出 PBMCs (peripheral blood mononuclear cells)，並 且利用 3 次 PBS 清洗的過程來去除殘餘的 Ficoll-paque 及混雜在細胞 中的血小板。接著利用 MACS monocyte isolation kit (Miltenyi Biotec Ltd., Bisley, GB) 所附的標有 CD14 antibodies 的磁珠和 PBMCs 混合 培養 (incubation) 15 分鐘進行 positive isolation，由 PBMCs 中標定出 單核球細胞，再通過具有磁場的管子 (colume)，未被磁珠標定的細胞 會被 buffer (PBS/0.5% BSA) 洗出，而有標定磁珠的細胞在管子拿離 磁場之後，可由培養液 (w/o phenol red RPMI 1640 medium) 洗出，並 將細胞濃度調整為 1 × 106 cells/ml，方便進行各項實驗。
3. 電泳酵素分析法 (SDS-PAGE Zymography)
實驗前將培養液更換成含 0.5 % FBS 之 w/o phenol red RPMI 1640，將定量的 THP-1 細胞(1 × 106 cells/ml)分置於 24 well 培養盤中，
放入 incubator 培養 15 分鐘後，各別加入 CAPE (10, 20, 50M)或 Carprofen (1, 5, 10, 20 M)，放入 incubator 培養 15 分鐘後再加刺激劑 LPS (50 ng/ml)並培養 24 小時後，在冰上收集細胞之上清液以進行實 驗。將實驗處理後取得之細胞培養液以 1：2 的體積比例加入 sample loading dye (500 mM Tris-HCl、25 % Glycerol、10 % SDS 和 0.32 % Bromophenol blue 調成 pH 6.8)充分混勻，再以 10 % polyacrylamide gel
(含 1 % gelatin)於 running buffer (25 mM Tris-base、192 mM Glycerol 和 0.1 % SDS 調成 pH 8.3)下，以 125 V/40 mA 進行電泳分離。分離 後之膠片再以 2.5 % Triton X-100 於室溫下洗滌兩次後，把膠片置於 reacting buffer (50 mM Tris-base、200 mM NaCl、5 mM CaCl2和 0.02 % Brij 35 調成 pH 7.5)中，在 37℃的恆溫箱內反應 17 小時，之後再以 fixing solution (7 % acetic acid 和 40 % methanol)固定蛋白質於膠片上 30 分鐘。接著以 Brilliant Blue G-Colloidal 染色使膠片呈色均勻，並 以 destain solution (10 % acetic acid 與 25 % methanol)做去色處理，使 結果達到最佳化。最後將膠片置於影像分析系統 (Vilber Lourmat, France)，以 CCD 拍攝並將圖檔存入磁片中，再將磁片所存之影像於 電腦中以影像分析軟體(Bio-1D version 99)做分析處理。以 Resting 亮 度當作 1，其餘 band 之亮度以其相對倍數表現之，所計算之藥物抑 制百分比如下：
4. Reverse Zymography
TIMP-1 的活性使用 reverse zymography 偵測。將實驗處理取得 細胞培養液以 1：2 的體積比例加入 sample loading dye (500 mM Tris-HCL、25 % Glycerol、10 % SDS 和 0.32 % Bromophenol blue 調 成 pH 6.8)充分混勻，使用 12% polyacrylamide gels(含 1% Glatin 與濃 度 1×106 cells/ml THP-1 細胞以 PMA(10 nM)刺激 24 小時後的上清液 23.5%)，電泳分離後之膠片再以 2.5 % Triton X-100 於室溫下 30 分鐘
× 100%
刺激劑之相對亮度－藥物處理之相對亮度 刺激劑之相對亮度－1
洗滌兩次後，把膠片置於 reacting buffer (50 mM Tris-base、200 mM NaCl、5 mM CaCl2 和 0.02 % Brij 35 調成 pH 7.5)中，在 37 ℃的恆溫 箱內反應 24 小時，之後再以 fixing solution (7 % acetic acid 與 40 % methanol) 固 定 蛋 白 質 於 膠 片 上 30 分 鐘 。 接 著 以 Brilliant Blue G-Colloidial 染色使膠片呈色均勻，並以 destain solution (10 % acetic acid 和 40 % methanol)做去色處理，使結果達到最佳化。最後將膠片 置於影像分析系統(Vilber Lounmat, France)，以 CCD 拍攝並將圖檔存 入磁片中，再以磁片所存之影像於電腦中以影像分析軟體(Bio-1D version 99)做分析處理。以 resing 的亮度當作 1，其餘 band 之亮度以 其相對倍數表現之。計算之藥物抑制百分比如下：
5. 人類單核球細胞(THP-1)存活率測定(MTT assay)
此實驗目的是為了測詴 CAPE 與 carprofen 是否對於 THP-1 具有 細胞毒性，以得知其抑制效果是否導因於其細胞毒性作用。所以利用 存活細胞的粒線體酵素 dehydrogenase 將 MTT 詴劑還原成 formazan 紫色結晶，再用 DMSO 將結晶溶解，亦即藉由細胞之代謝活性來作 為細胞是否存活之依據，而測得之溶解吸光值等於相對細胞存活率，
故存活細胞越多，其吸光值越高。針對 THP-1 細胞存活率的測定須 在實驗前先將培養液更換成含 0.5 % FBS 之 w/o phenol red RPMI 1640，將定量的 THP-1 細胞(1 × 106 cells/ml)分置於 24 well 的培養盤，
放入 incubator 內 15 分鐘後，以不同濃度的 CAPE 與 Carprofen 處理
× 100%
刺激劑之相對亮度－藥物處理之相對亮度 刺激劑之相對亮度－1
細胞培養 22 小時後，加入 0.55 mg/ml MTT，於 37℃下作用 2 小時，
再將每 well 內的液體吸至 eppendorf，於室溫下以轉速 1431 g 離心 10 分鐘。離心後，去除上清液，加入 1 ml dimethylsulfoxide (DMSO)到 每個 eppendorf 中，混合均勻後，再將液體加回到 24 well 中，於室溫 下避光輕搖 15 分鐘，待 well 內殘餘細胞完全溶解後，再從每 well 中各取出 100 l 置入含有 100 l DMSO 之 96 well-ELISA plates，充 分均勻後用酵素免疫分析儀(MRX microplate reader, USA)以 550 nm 之波長偵測每一個 well 之吸光值。而存活百分率之運算如下：
6. 細 胞 內 蛋 白 質 分 離 與 定 量 (Intracellular protein isolation and quantification)
將實驗處理後之細胞，以外加 protease inhibitor (10 l/ml aprotinin、
1 mM PMSF 和 10 l/ml leupeptin)及 2 mM Dithiothreitol (DTT) 之 lysis buffer (50 mM HEPES、5 mM EDTA‧2 Na、50 mM NaCl 與 1 % Triton X-100)將細胞溶破，4℃下靜置 30 分鐘，每 5 分鐘 vortex 15 秒，
隨後以 4℃轉速 12879 g 離心 20 分鐘，取上清液，定量蛋白質。若進 行有關 p-Akt、MAPKs 等磷酸化蛋白質之測定時，其 lysis buffer 則必 須再多加入 phosphatase inhibitor (10 mM sodium fluoride、1 mM sodium orthoranadate 和 5 mM sodium pyrophosphate)。蛋白質定量時，
先取 2 mg/ml 之 albumin bovine (BSA)以二次水分別稀釋成濃度為 5 加藥處理之吸光值
Resting 之吸光值
× 100 ％
g/ml、10 g/ml、15 g/ml、20 g/ml、25 g/ml，做為 standard。並
取蛋白質樣品 3 l 與二次水 797 l 充分混合。靜置十分鐘後，連同 標準品全數加入 200l Dye reagent concentrate (Bio-Rad)充分混合，再 靜置五分鐘後，取 200 l 至 96 well-ELISA plates，用酵素免疫分析儀 (MRX microplate reader, USA)以 550 nm 之波長偵測每一個 well 之吸 光值。所得之吸光值以線性迴歸方式換算成濃度，測定後，樣品分裝 保存於-80℃以備用。
7. 西方點墨法 (Western blotting)
將實驗處理取得之已定量的細胞內蛋白質成份以 5 : 1 的體積比 例加入 6 倍 sample loading dye (350 mM Tris-base、30 % Glycerol、350 mM SDS、175 M Bromophenol blue 與 600 mM DTT 調成 pH 6.8)充 分混勻後，95℃加熱 5 分鐘，使蛋白質 denature 後，快速置於冰上至 少 5 分鐘，以免回溫過程中酵素影響蛋白質，最後在 4℃下以轉速 2236 g 離心 5 分鐘後備用。再以 7 % polyacrylamide gel 於 running buffer (25 mM Tris-base、192 mM Glycine 和 0.1 % SDS 調成 pH 8.3)下，每行分 別 load 入 50 g 之蛋白質(針對 MMP-9)，並以 125 V/80 mA 進行電泳 分離。隨後將膠片置於 transfer buffer (1 M Tris-base、20 % methanol 和 150 mM glycine 調成 pH 8.3)中，以 70 V/300 mA 進行電泳轉漬 3 小時 ，使膠片上之蛋 白質轉移至 Nitrocellulose membrane (NC ;
Hybond-C)或 Polyvinylidene fluoride microporous membrane ( PVDF ; Hybond-P)表面，隨後將轉漬膜浸潤在 25℃下的 blocking buffer ( 5 % non-fat milk、10 mM Tris-base、100 mM NaCl 和 0.1 % Tween 20 調成 pH 7.5)中，1 小時後，以 TBST (10 mM Tris-base、100 mM NaCl 和 0.1 % Tween 20 調成 pH 7.5)清洗轉漬膜三次，每次 10 分鐘，之後加 入一級抗體( primary antibody )，(如：MMP-9、-tubulin、p-Akt、MAPK 等)，於室溫中搖晃作用 2 ~ 4 小時。再用 TBST 清洗轉漬膜四次，每 次 7 分鐘，之後再加入標記有 horseradish perosidase (HRP)的二級抗 體( secondary antibody)，於室溫下反應 1 ~ 4 小時，再以 TBST 清洗 轉 漬 膜 四 次 ， 每 次 7 分 鐘 。 最 後 使 用 冷 光 反 應 劑 Enhanced chemiluminescence (ECL) Western blotting detection reagent 使底片感 光，以用來偵測蛋白質量的表現情形。最後將成像後的底片掃瞄輸入 電腦，以影像分析軟體(Bio-1D version 99)做分析處理。以 Resting 亮 度當作 1，其餘 band 之亮度以其相對倍數表現之。
8. 轉染(Transfection)
於繼代培養的隔天進行實驗，在實驗進行前10小時，將細胞離心 並更換培養液同時將細胞濃度調至1.6×106個/ml，置於十公分dish中培 養。10小時後，將含細胞的培養液吸起，種於6-well中，每格細胞數
為3×106 cells個細胞，最後以serum free 之w/o phenol red RPMI 1640 將總體積補到2.5 ml，放入incubator內計時1小時。於前35分鐘時配置 詴劑，依後使用Effectene transfection reagent (Qiagen, Valencia, CA)說 明書指示進行實驗，每格所需詴劑量如下：
Component Volumn ( μl ) Enhancer 4.4 μl / well
Effectene 5.5 μl / well plasmid DNA 0.55 μg / well
serum free w/o phenol red RPMI 1640 0.5 ml / well
其中，質體DNA包含了reporter plasmid(NF-κB)與做為控制組的Renilla。
在本實驗的reporter plasmid序列中，將NF-κB序列接上pTAL-promoter vector (Clontech, Mountain View, CA)，因此可表現出螢火蟲冷光。同 理 ， 在 Renilla 中 含 有 Renilla luciferase vector, pRL-TK (Promega, Madison, WI)作為控制組，可用來評估transfection的效力。將詴劑加 到細胞後，放入incubator 12小時，使質體DNA送入細胞中。
9. 冷光酵素分析測定(Luciferase assay)
經 過 12 小 時 的 transfection 後 ， 將 細 胞 離 心 並 加 入 含 0.5%FBS RPMI 1640的培養液，於離心時開始計時85分鐘(包含starvation 1小時)，
將細胞種於12-well中，每格分配1.2 ml含細胞之培養液，細胞濃度為1
× 106(cells/ml) ， 依 序 加 入 不 同 濃 度 的 CAPE (10, 20, 50 μM) 和 Carprofen (1, 5, 10, 20 μM)，並於加入藥物的15分鐘後，加刺激劑 LPS(50 ng/ml)incubation 8小時，於時間到時，將細胞吸到eppendorf 中，以900 rpm , 5分鐘離心去除上清液後，每管加入0.5 ml PBS混合 均勻後，進行離心，此步驟是為了將培養液清除乾淨。離心後，移除 上清液加入reporter lysis buffer (Promega) 50 μl，震盪數秒後於室溫下 反應5分鐘後凍於- 80 ℃ 10分鐘以上，使細胞破裂更完全。使用 Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)測Luciferase 活性，
將樣品置於Orion MPL2 microplate luminometer (Berthold Detection Systems, Bleichstrae, Germany)冷光盤中以冷光儀偵測冷光的強度，並 使用分析軟體(Simplicity photon counting, vers. 2.0 R1)。所有的螢火蟲 冷光強度數據會使用Renilla強度數據進行校正。
將樣品置於Orion MPL2 microplate luminometer (Berthold Detection Systems, Bleichstrae, Germany)冷光盤中以冷光儀偵測冷光的強度，並 使用分析軟體(Simplicity photon counting, vers. 2.0 R1)。所有的螢火蟲 冷光強度數據會使用Renilla強度數據進行校正。