第三章 實驗方法
3.8 同分異構物相對定量分析
圖 3-6 VESI 雙重進樣與質譜的應用示意圖(雙重進樣)
3.8 同分異構物相對定量分析 3.8.1 動力學法(kinetic method)
鑑別同分異構物時，因為相異的異構物具有不同的PA值，因而其與參 考物所生成的離子訊號相對強度會有所差異。藉由未知物和標準品碰撞誘 導解離(collision-induced dissociation ,CID)圖的訊號強度比對，則可以不需 層析分離技術而達到鑑定未知物的目的，以及分析混合液中同分異構物的 個別含量。動力學法使用時以氣相中特定質子化二聚離子(A-H+-B)與惰性 氣體進行碰撞誘導解離後，得到離子斷片AH+與BH+的相對強度，而推導出 分析物A的質子親合力；B為已知PA值的參考物(圖 3-7)。選擇適當的參考 物作為動力學參考物。動力學法之溶液的配置方式，將在未來實驗方法中 敘述之。
圖 3-7 質子化二聚離子碰撞誘導解離後離子訊號相對強度示意圖
3.8.2 尋找適當的參考物
本實驗研究的方向為ketoximes 藉由 Beckmann 重排得到 Amide 的兩同 分異構物， Acetanilide(AA)與 N-methylbenzamide (NMB)，所以選擇適當 的參考物(Ref)是進行動力學法時一個重要的步驟，若是參考物和同分異構 物間的質子親合力差距過大，則無法形成質子化二聚離子，以及後續碰撞 誘導解離使用。有時即便可以生成質子化二聚離子，但是碰撞誘導解離後 只會有單一斷片離子出現。為了尋找適當的參考物，首先篩選一個與同分 異構物構造相似的化合物，將其分別與同分異構物的標準品混合後以電噴 灑游離(ESI)方式注入質譜儀進行偵測。觀察有無質子化二聚離子生成，若 無則再改換參考物，直到觀察到有質子化二聚離子生成為止。
得到質子化二聚離子X-H+-Ref後即可以串聯式質譜方式進行碰撞誘導 解離。若無法同時獲得X+和Ref+的訊號，則需更換參考物。
IAcetanilide
= RA (1) [NMB-H+-Ref]離子解離時的效率(cross section)視為相同，則X-訊號強度中 [AA+H]+和[NMB+H]+的 相 對 含 量 即 是 m/z 136 訊 號 中 [AA+-H+-Ref] 和
[NMB-H+-Ref]離子相對含量，也可代表著混合液中AA與NMB相對含量。
假設X-訊號強度中，[AA+H]+的相對含量為X%，[NMB+H]+的相對含量為 (1-X%)，而RM是由X%的RA(式 1)和(1-X%)的RN(式 1)所歸納而來，則混合 液中AA與NMB相對含量可以由算式 4 計算得到。
3.8.4 直接碰撞誘導解離法(collision-induced dissociation, CID)
鑑別同分異構物時，利用同分異構物的結構不同特性，經由碰撞誘導 解離後，會因斷鍵鍵能不同而產生不同片段離子訊號，藉此異構物間強度 差異製作不同濃度下檢量線來鑑定與同分異構物含量。
3.8.6 混合液中同分異構物的 CID 相對含量
配製不同Acetanilide與NMB標準品的相對含量比例(表 3-1)將每組待 測混合物利用甲醇/水當溶劑混合，調整並控制混合物濃度在 10-3~10-4 M，
避免濃度因素影響相對含量的鑑定。以質譜CID選定同分異構物離子m/z 136 鑑定Acetanilide與NMB的片段離子訊號強度，回推原同分異構物母離子 的相對含量關係。
表 3-1 AA 與 NMB 標準品的相對含量比例
3.8.6 CID 碰撞能的選定
調整直接碰撞誘導解離法所需的 CID 碰撞能量，將會影響本鑑定方法 的準確性，若擇選擇的碰撞能量太低則使片段離子訊號強度弱，在相對含 量計算下誤差大。若擇選擇的碰撞能量太高則片段離子再次碰撞斷裂，也 會導致在相對含量計算下因失去原預期的片段離子，造成定量上的誤差。
所以必須找尋是當的碰撞能為此直接CID 實驗的最佳參數。
3.8.7 CID 檢量線製作與相對定量計算
利用表 1 中第 1 組至第 3 組的 AA 與 NMB 標準品相對含量比值作檢 量線的橫軸(X 軸)，而將相對含量中 AA 片段離子 m/z 94 與 NMB 片段離子 m/z 105 訊號強度比值作檢量線的縱軸(y 軸)。配置表 3-1 中第 6 組比例濃度 的AA 與 NMB 標準品混合物而利用內插法檢驗檢量線的準確性，以及利用 表3-1 中第 4~5 組作檢量線的外插法再次檢驗檢量得可效性的範圍。
在計算Beckmann 同分異構物的相對含量是利用檢量線的公式(y=ax+b)得 到，將AA 片段離子 m/z 94 與 NMB 片段離子 m/z 105 訊號強度比值作 y 代入檢量線的公式，得兩同分異構物相對含量。