文氏管電噴灑游離質譜法的開發
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(2) . 目錄 中文摘要...............................................................................................................1 英文摘要...............................................................................................................2 第一章. 前言......................................................................................................4. 第二章. 文獻探討 .............................................................................................6. 2.1 線上偵測有機反應的方法 ........................................................................6 2.2 線上分析質譜法 ........................................................................................7 2.3 質譜線上偵測游離方式 ............................................................................9 2.4 質譜進樣方式: 毛細管裝置進樣 ...........................................................11 2.5 質譜進樣方式: Venturi effect裝置進樣...................................................13 2.6 質譜氮氣輔助樣品進樣探討 ..................................................................16 2.7 質譜儀線上即時偵測應用 ......................................................................17 2.7.1 利用質譜儀搭配毛細管進樣裝置線上即時偵測反應 ....................17 2.7.2 線上偵測蛋白質水解反應 ................................................................19 2.8 T型混合進樣質譜分析 .............................................................................19 2.9 Beckmann重排反應 ..................................................................................21 2.10 動力學法鑑定同分異構物 ....................................................................22 I .
(3) . 2.10.1 動力學法(kinetic method)................................................................22 2.10.2 質譜動力學法對三同分異構物相對定量分析 ...............................24 2.10.3 質譜動力學法搭配理論計算研究質子親合力大小 .......................25 2.10.4 動力學法和加速揮發方式偵測同分異構物樣品 ...........................26 第三章. 實驗方法 ...........................................................................................27. 3.1 藥品...........................................................................................................27 3.2 儀器...........................................................................................................28 3.3 VESI自動進樣的參數探討.......................................................................29 3.4 質譜儀進樣裝置設計 ..............................................................................29 3.4.1 VESI自動進樣裝置實驗 ....................................................................30 3.4.2 VESI自動進樣原理與裝置改良 ........................................................32 3.5 VESI自動進樣裝置測定流速的參數探討 ..............................................33 3.6 VESI進行線上偵測實驗...........................................................................34 3.7 VESI雙重進樣裝置...................................................................................34 3.8 同分異構物相對定量分析 .......................................................................35 3.8.1 動力學法(kinetic method)...................................................................35 3.8.2 尋找適當的參考物 ............................................................................36 II .
(4) . 3.8.3 混合液中同分異構物的相對含量 ....................................................37 3.8.4 直接碰撞誘導解離法(collision-induced dissociation, CID) ............38 3.8.6 混合液中同分異構物的CID相對含量 .............................................38 3.8.6 CID碰撞能的選定 ..............................................................................39 3.8.7 CID檢量線製作與相對定量計算 ......................................................39 第四章. 結果與討論 .......................................................................................40. 4.1 VESI自動進樣裝置與注射針幫浦的比較 ..............................................40 4.2 以自動進樣裝置偵測化學反應 ..............................................................41 4.3 VESI自動進樣與游離法的開發 ..............................................................43 4.3.1 自動進樣裝置探討 .............................................................................43 4.3.2 VESI自動進樣裝置機制探討 ............................................................43 4.4 質譜儀進行自動進樣裝置參數的探討 ..................................................46 4.4.1 比較不同內徑裝置的流速 ................................................................48 4.4.2 毛細管電壓對於裝置流速的影響 ....................................................50 4.4.3 分析物濃度對於裝置流速的影響 ....................................................52 4.4.4 無毛細管電壓與不同分析物對於裝置流速的影響 .........................53 4.4.5 溶劑對於裝置流速的影響 .................................................................56 III .
(5) . 4.4.6 質譜儀進行自動進樣裝置參數比較結果 ........................................57 4.5 VESI自動進樣裝置結論與應用 ..............................................................58 4.6 VESI對蛋白質水解反應的即時偵測應用 ..............................................59 4.6.1 蛋白質Cytochrome c水解反應線上偵測..........................................60 4.6.2 蛋白質Cytochrome c水解片段探討..................................................61 4.7 自動進樣裝置實驗時的問題解決 ..........................................................63 4.7.1 自動進樣裝置問題解決: 氣泡 .........................................................63 4.7.2 自動進樣裝置問題解決: 更換樣品 .................................................64 4.8 VESI雙重進樣裝置...................................................................................65 4.8.1 VESI雙重進樣裝置應用: 動力學法 .................................................65 4.8.2 乙醯水楊酸水解反應的探討 .............................................................69 4.8.3 雙重自動進樣裝置應用: 輔助咖啡因質子化.................................72 4.8.4 雙重進樣對不同酸鹼值的蛋白質帶電荷分佈即時偵測 ................75 4.9 VESI線上偵測Beckmann rearrangement產物 .........................................79 4.9.1 同分異構物相對含量的推導 ............................................................83 4.9.2 特定斷片離子的相對強度 ................................................................84 4.9.3 Beckmann重排反應的同分異構物動力學法 ....................................88 IV .
(6) . 第五章. 結論....................................................................................................94. 第六章. 參考文獻 ...........................................................................................97 . V .
(7) . 表目錄 表 2-1 兩種計算方法所求得混合液中ADMA/SDMA比例 ..........................26 表 2-2 比較不同比例的醣胺類分析物混合液實驗結果與理論值...............26 表 3-1 AA與NMB標準品的相對含量比例 .....................................................38 表 4-1 不同樣品中所含AA與NMB的相對比例 ............................................84 表 4-2 AA與NMB相對含量(MAA/MNMB)和MS/MS圖中離子斷片相對強度(I 94/I105)數值...........................................................................................................87 . VI .
(8) . 圖目錄 圖 2-1 mobile HPLC裝置與自動進樣設備........................................................7 圖 2-2 利用API-MS與汞燈作光化學反應裝置示意圖 ...................................8 圖 2-3 微型反應器混合分析液後直接和ESI游離源連接偵測........................8 圖 2-4 利用毛細管自動拉回的裝置控制反應時間裝置示意圖.....................9 圖 2-5 萃取式電噴灑游離法裝置示意圖 .......................................................10 圖 2-6 solid-state organic reaction生成物與產物的質荷比、強度與時間的即 時偵測結果.................................................................................................11 圖 2-7 以毛細作用直接進樣裝置樣品進樣與游離示意圖 ...........................12 圖 2-8 以光學鏡頭拍攝毛細管作用進樣的過程與電壓實驗探討...............12 圖 2-9 利用EESI對水楊酸乙酯水解反應即時偵測的時間質譜圖 ..............13 圖 2-10 Venturi pump裝置進樣圖以及Venturi effect抽樣原理圖 .................14 圖 2-11 Venturi pump裝置線上偵測與動力學結果........................................14 圖 2-12 V-EASI快速偵測實驗裝置示意圖與真實樣品圖 .............................15 圖 2-13 分別以正模式(A)以及負模式(B)對分析物做偵測的質譜圖 ..........16 圖 2-14 利用壓力差作大氣游離進樣方式進行快速檢測裝置圖.................16 圖 2-15 氮氣進樣端裝置壓力大小對於訊號大小的影響比較 .....................17 圖 2-16 UASI-MS作反應線上質譜偵測示意圖..............................................18 圖 2-17 Zemplen reaction對於時間變化的質譜圖 ..........................................18 VII .
(9) . 圖 2-18 利用線上偵測cytochrome c在pH8 條件下的變化質譜圖 ...............19 圖 2-19 注射針結合Berger ball mixer偵測acetylcholine溶液 .......................20 圖 2-20 T型混合器與DESI裝置作萃取式電噴灑(EESI)裝置示意圖 ...........21 圖 2-21 苯乙酮的Beckmann重排反應產物 ....................................................22 圖 3-1 self-pumping裝置測試流速示意圖以Glu 溶液作偵測.......................29 圖 3-2 VESI自動進樣的裝置圖 .......................................................................31 圖 3-3VESI自動進樣裝置進樣裝置與質譜儀連接示意圖 ............................31 圖 3-4 改良VESI進樣自動進樣裝置與質譜連接介面的應用示意圖 ..........32 圖 3-5 探討實驗參數部分將對self-pumping裝置流速實驗圖......................33 圖 3-6 VESI雙重進樣與質譜的應用示意圖(雙重進樣) ................................35 圖 3-7 質子化二聚離子碰撞誘導解離後離子訊號相對強度示意圖...........36 圖 3-8 質子化二聚離子X-H+-Ref碰撞誘導動力學式 ...................................37 圖 4-1 VESI自動進樣裝置的穩定性 ...............................................................40 圖 4-2 注射針幫浦(A)與自動進樣裝置(B)進樣的比較 ................................41 圖 4-3 探討自動進樣裝置進樣時間的示意圖 ...............................................42 圖 4-4 自動進樣裝置進樣的質譜圖: (A) TIC 圖；(B) 進樣MeOH/H2O 溶 液 1 分鐘後，添加EDTA溶液前；(C) 添加EDTA溶液 ........................42 圖 4-5 連續進樣偵測Glu訊號質譜圖(無毛細管電壓) ..................................44 圖 4-6 連續進樣偵測Glu訊號質譜圖(有毛細管電壓) ..................................44 VIII .
(10) . 圖 4-7 VESI自動進樣裝置氮氣的輔助造成Venturi effect現象 .....................45 圖 4-8 葡萄糖胺(Glu)標準品的質譜圖 ..........................................................47 圖 4-9 VESI裝置測定流速TIC圖以及質譜圖隨時間變化的結果.................47 圖 4-10 不同管徑對於自動進樣的流速比較以及其再現性結果.................48 圖 4-11 重複實驗以管徑 750 μm進行偵測的質譜TIC圖三次結果 .............49 圖 4-12 不同毛細管電壓得到的質譜TIC圖並計算滯留時間DT與流速 .....50 圖 4-13 不同毛細管電壓對流速變化圖與其再現性結果 .............................51 圖 4-14 不同濃度下得到的Glu訊號強度關係 ...............................................52 圖 4-15 不同濃度實驗self-pumping的流速影響與分析物強度影響............52 圖 4-16 VESI裝置無毛細管電壓 0 V的質譜圖與裝置流速計算 ..................54 圖 4-17 VESI裝置在毛細管電壓 2600 V的質譜圖與裝置流速計算 ...........54 圖 4-18 連續式實驗切換電壓對於自動進樣流速計算質譜TIC圖 ..............55 圖 4-19 VESI裝置在甲醇溶劑的質譜圖與流速計算結果 .............................56 圖 4-20 以質譜儀進行自動進樣裝置參數結果比較圖 .................................57 圖 4-21 不同酸鹼條件下o-PDA光化學催化聚合反應的研究： (A)未以緩衝 溶液控制pH值；(B)以緩衝溶液控制pH值 .............................................59 圖 4-22 Cytochrome c 與Trypsin反應得到的即時質譜圖 .............................60 圖 4-23 Cytochrome c 與Trypsin反應得到的線上即時反應圖 .....................61 圖 4-24 m/z 584.9 有出現m/z 584.4 的訊號為帶兩個電荷的質譜圖.............61 IX .
(11) . 圖 4-25 以CyC做Trypsin的水解反應的反應變化圖 .....................................62 圖 4-26 VESI self-pumping裝置與器材示意圖...............................................63 圖 4-27 以Glu 10-3 M做Self-pumping裝置流速的實驗結果: (A) 進樣效果受 到氣泡干擾的質譜訊號圖; (B) 進樣正常所得到的質譜訊號圖...........63 圖 4-28 VESI self-pumping裝置重新填裝架設的流程示意圖.......................64 圖 4-29 經過問題維修後的質譜層析訊號圖 1.5 分鐘後為穩定訊號結果..64 圖 4-30 比較直接進樣裝置(A)與傳統先混合進樣(B)質譜圖 ......................66 圖 4-31 GlaNH2與Pro藉由T型裝置進樣混合液的電噴灑質譜圖 .................67 圖 4-32 m/z 295 離子於 5 V碰撞能量下的碰撞誘導解離質譜圖..................67 圖 4-33 雙重進樣裝置(A)和注射針幫浦進樣(B)所生成質子化二聚離子 [GlaNH2-H+-Pro]的CID圖..........................................................................68 圖 4-34 雙重進樣裝置(A)和注射針幫浦進樣(B)所生成質子化二聚離子 [GluNH2-H+-Pro]的CID圖 .........................................................................68 圖 4-35 乙醯水楊酸水解反應實驗裝置圖與反應式 .....................................69 圖 4-36 乙醯水楊酸水解反應於不同pH值的溶液 ........................................70 圖 4-37 pH值與SA-/ASA-比值的關係圖 .........................................................71 圖 4-38 乙醯水楊酸的ESI質譜圖cone energy為 15 V...................................72 圖 4-39 不同碰撞能下的ASA-的MS/MS圖....................................................72 圖 4-40 以咖啡因作為雙重進樣裝置應用的質譜圖與示意圖 .....................73 X .
(12) . 圖 4-41 T-pumping應用輔助咖啡因質子化質譜圖:(A)MS圖第 4 分鐘的積分 訊號圖；(B)MS圖第 6 分鐘的積分訊號圖。 .........................................73 圖 4-42 質譜TIC圖的時間與相對關係圖表...................................................74 圖 4-43 Cytochrome c from horse heart帶多電荷分佈情形以及計算得知蛋白 質分子量大小(MW 12384)........................................................................75 圖 4-44 Cytochrome c from bovine帶多電荷分佈情形以及計算得知蛋白質 分子量大小(MW 12327)............................................................................76 圖 4-45 Myoglobin帶多電荷分佈情形以及計算得知蛋白質分子量大小(MW 16951) .........................................................................................................76 圖 4-46 雙重進樣對不同酸鹼值的蛋白質帶電荷分佈即時偵測示意圖.....77 圖 4-47 雙重進樣對不同酸鹼值的Myo連續變化質譜TIC圖 .......................77 圖 4-48 雙重進樣連續進樣對不同酸鹼值的Myo即時變化質荷比圖 .........78 圖 4-49 Beckmann重排反應機制圖 .................................................................79 圖 4-50 苯乙酮的Beckmann重排反應產物 ....................................................80 圖 4-51 苯乙酮標準品的質譜圖 .....................................................................81 圖 4-52 由苯乙酮合成醯胺的反應產物質譜圖 .............................................81 圖 4-53 質子化合成產物X於 12 V碰撞能下的MS/MS質譜圖.....................81 圖 4-54 [NMB+H]+ 的MS/MS質譜圖 .............................................................82 圖 4-55 [AA+H]+ 的MS/MS質譜圖 ................................................................82 圖 4-56 Beckmann reaction以質譜儀即時偵測反應動力學關係...................83 XI .
(13) . 圖 4-57 不同碰撞能下質子化AA的MS/MS圖...............................................85 圖 4-58 不同碰撞能下質子化NMB的MS/MS圖 ...........................................85 圖 4-59 含不同比例混AA 與 NMB樣品的MS/MS質譜圖..........................86 圖 4-60 樣品中AA (A)與NMB (B)相對含量檢量線: 橫軸為配製樣品中 AA/NMB相對比；縱軸為MS/MS圖中 (I 94/I105)值 ................................87 圖 4-61 (A) AA與APAP混合液的質譜圖；(B) NMB與APAP混合液的質譜圖 .....................................................................................................................89 圖 4-62 AA與NMB結合APAP形成的質子化二聚離子示意圖 .....................89 圖 4-63 PBD的斷片質譜圖: (A)AA與APAP; (B)NMB與APAP ....................90 圖 4-64 含不同AA與APAP量生成之質子化二聚體的CID圖：(AA/APAP)體 積比(A) 1:1； (B) 1:10； (C) 10:1..........................................................91 圖 4-65 含不同NMB與APAP量生成之質子化二聚體的CID圖：(NMB/APAP) 體積比(A) 1:1； (B) 1:10； (C) 10:1......................................................92 圖 4-66 AA:NMB:APAP = 2:3:1 混合之樣品所得PBD的MS/MS圖 .............93 . XII .
(14) . 文氏管電噴灑游離質譜法的開發. 指導教授：何永皓 博士 國立高雄大學應用化學系 (碩士班) 學生：楊瑞崎 國立高雄大學應用化學系 (碩士班) 摘要 本研究應用文氏管效應(Venturi effect)開發一項可以進行線上即時分析化合物的簡 易質譜法，此項方式命名為文氏管電噴灑游離質譜法(Venturi electrospray ionization mass spectrometry, VESI-MS)。使用 VESI-MS 時不需要加裝任何輔助設備就可以自動將樣 品導入質譜儀的游離源中進行分析，而進樣方式可以採用單一進樣或是以 T 型連接方 式進行雙重進樣。VESI-MS 可應用於即時分析化學反應時化合物的生成變化，並觀測 不同實驗條件對產物選擇性的影響，可以增加對反應機制的了解；VESI-MS 也可以用 來線上改變樣品的基質，達到增強分析物於電噴灑游離時的訊號。 雖然電噴灑游離時泰勒錐(Taylor cone)的持續生成有可能會拖曳溶液，然而實驗證 明霧化氮氣所形成的文氏管效應才是自動進樣的主因，以 VESI-MS 分析葡萄糖胺水溶 液時，開啟或關閉電噴灑游離電壓時所記錄的流速依序為 19.9±1.9 μL/min 和 18.7±1.1 μL/min，證實泰勒錐對樣品液的流動影響極小。樣品溶液的種類和輸送管內徑大小等參 數皆會影響進樣流速的快慢，用於 VESI-MS 的 PEEK 管或毛細管長度分別須短於 20 公分和 15 公分才能自動進樣，而適用的輸送管的內徑介於 75 μm 到 250 μm 之間。 以VESI-MS探討cytochrome c水解反應機制時，可以觀察到KIFVQK胜肽斷片生成 後才再繼續水解成IFVQK片段，顯示cytochrome c中不同位置lysine (K)的水解速率會因 構型的影響而有顯著的不同。VESI-MS雙重進樣方式的研究，包含將醋酸水溶液線上添 加入咖啡因樣品液中，因而提升了咖啡因訊號強度約 55 倍，並且降低了鹽類訊號的干 擾。雙重進樣方式也可以應用於同分異構物的辨別，苯乙酮經Beckmann重排合成醯胺， 可以得到acetanilide (AA)與N-methylbenzamide (NMB)兩種同分異構物，以雙重進樣裝置 導入參考物acetaminophen (APAP)分別和AA或NMB標準品生成質子化二聚體，經碰撞 誘導解離後斷片訊號強度比分別為IAA/IAPAP = 0.15 和INMB/IAPAP = 4.17，利用此項數據進 一步分析混合液中AA和NMB的相對含量其結果符合預期，未來可以使用VESI-MS線上 即時分析不同反應參數對產物選擇性的影響。 關鍵字: 文氏管效應、VESI-MS、線上即時分析、自動進樣、Beckmann 重排、同分異 構物選擇性、動力學法 1 .
(15) . Development of Venturi Electrospray Ionization Mass Spectrometry Advisor: Dr. Yeung-Haw Ho Department of Applied Chemistry National University of Kaohsiung Student: Ruei-Chi Yang Department of Applied Chemistry National University of Kaohsiung ABSTRACT A handy ionization method on the basis of Venturi effect was developed. The method was named as Venturi electrospray ionization mass spectrometry (VESI-MS). VESI-MS can self-pumping sample solution into the ion source of Q-TOF mass spectrometry. Sample inlet device of VESI-MS can be either single or dual inlets. VESI-MS can perform online study on organic reactions in real-time and investigated effects of experimental conditions on variation of products. Result will assist researchers to understand reaction mechanisms that interested. VESI-MS with dual inlets was applied for modification of matrix in sample solution to enhance analyte ionization efficiency or to perform kinetic method. Studies showed that nitrogen used as nebulization gas for ESI is the major driving force for self-pumping and formation of Taylor cone has only minor effect. Self-pumping flow rates of glucosamine solution are 19.9 ± 1.9 μL / min and 18.7 ± 1.1 μL / min for turning on or off capillary voltage, respectively. The self-pumping flow rate is affected by solvent used and diameter of tubing for transporting solution. Suitable diameter of transporting tubing is ranged from 75 μm to 250 μm and lengths of transporting tubing should be less than 20 cm and 15 cm for PEEK and capillary tubes, respectively. VESI-MS was demonstrated to investigate tryptic digestion of cytochrome c in real-time. Result showed that formation KIFVQK is more facile than that of IFVQK. The hydrolysis rate of lysine (K) is affected by its location on cytochrome c. VESI with dual inlets (T-VESI) was applied to improve signal intensity. Intensity of protonated caffeine is enhanced approximately 55 times after online adding acetic acid aqueous solution into sample solution via T-shape connector. Formation of sodiated caffeine cation is also suppressed. Moreover, T-VESI was combined with kinetic method to distinguish acetanilide (AA) and N-methylbenzamide (NMB). AA and NMB are isomeric products that generated from 2 .
(16) . acetophenone via Beckmann rearrangement. T-VESI can be used for post-reactor mixing reference compound acetaminophen (APAP) and AA or NMB standard to perform kinetic method. Collision-Induced dissociation of proton-bound dimers generated showed that the relative intensities of fragments are IAA/IAPAP = 0.15 and INMB/IAPAP = 4.17. These data were applied to solve relative amount of AA and NMB in artificial sample and the result is inconsistent with expectation. The strategy can be used to investigate effect of reaction conditions on isomeric selectivity in the future. Keywords: online, real-time, Venturi effect, VESI-MS, self-pumping, Beckmann rearrangement, kinetic method, isomeric selectivity. 3 .
(17) . 第一章. 前言. 了解反應機制是尋求有機反應實驗條件最佳化過程中不可或缺的一 環，探討反應機制的策略則可分為離線(off-line)和線上(on-line)兩種。採用 離線方式時，樣品的分離與鑑定分別於兩個獨立的場域進行，例如將樣品 中的化合物以管柱分離純化後，再以 NMR 和其他的光譜儀器進行各個成 份的鑑定。離線偵測方式不但耗時且所得資訊也較不連貫，不利於一些不 穩定化合物的偵測；相反的，線上分析方式是將分離與鑑定儀器藉由界面 串連使用，改善了離線偵測的缺失，例如將 HPLC 與 Raman 或 UV 結合使 用。近年來以不須要任何樣品前處理或分離方法的質譜法，作為線上分析 方法則被廣為研究探討。 本研究計畫利用現有的 ESI 電噴灑游離法搭配質譜儀介面，開發出不 需改造游離法，對反應進行線上偵測的一套自動進樣系統，命名為文氏管 電 噴 灑 游 離 質 譜 法 (Venturi electrospray ionization mass spectrometry, VESI)，進行線上即時偵測反應產物的應用。 研究初期為樣品進樣方式的開發，主要是利用電噴灑游離電壓與質譜儀 氮氣扮演游離化合物和進樣的功能，數個模擬實驗將被用來檢視所開發的 自動進樣裝置與 VESI 的可行性，其中包含乙醯水楊酸的水解以及動力學法 的應用。研究的結果討論上包含探討所開發的自動進樣原與裝置最佳化參 數結果以及線上即時偵測反應。線上偵測的優勢是能即時了解反應的機 制，將自動進樣裝置搭配於特定反應上，其中牽涉到的反應有蛋白質水解 反應以及 Beckmann 重排反應，將作為開發的自動進樣裝置應用。 4 .
(18) . 不同於萃取式電噴灑游離法EESI1或超音波輔助游離法UASI2進行線上 偵測要加裝或修改一些設備，本研究開發的VESI使用現有電噴灑游離源即 可以自動進樣進行線上分析。由於同分異構物具有相同的質量，以質譜法 直接進行同分異構物的判別有其困難，至今還沒有線上分析有機反應所生 成同分異構物的研究發表，同分異構物的鑑別為本實驗室研究重點之一， 藉由T型接頭的使用，VESI除了單重進樣外也可進一步做雙重進樣，本計 畫利用VESI可雙重進樣的優點，將原本不利ESI操作分析的樣品，以 post-reactor方式改變溶液特性，使其能以ESI質譜法分析。未來將進一步將 雙重進樣的VESI運用於線上分析有機反應中同分異構物的相對含量。其中 同 分 異 構 物 的 辨 別 將 採 直 接 比 較 碰 撞 誘 導 解 離 (collision-induced dissociation, CID)所產生斷片離子的不同，以及動力學法(kinetic method)的 運用兩種不同方式。. 5 .
(19) . 第二章. 文獻探討. 以質譜法線上偵測的方法發展上包含兩個領域，首先是如何將樣品導 入質譜儀的游離源，其次是樣品的游離方式，樣品的導入方式主要是將進 樣裝置進行改良將樣品導入，因為也開發不少新的游離方式。目前常用的 游離方式可分為電噴灑游離法(electrospray ionization, ESI)和介質輔助雷射 脫附游離法(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI)兩種，前者適 用於有機小分子的分析，後者則較常用於生化大分子等的分析。2004 年後， 由Cooks3等人所研發的脫附電噴灑游離法(desorption electrospary ionization, DESI)，更帶動了一連串新的常態游離方式(ambient ionization)的發展。. 2.1 線上偵測有機反應的方法 根據 2011 年Workman4所整理的線上偵測方法，在 1999 年Farquharson 等人，利用拉曼光譜儀(Raman spectroscopy)搭配穩定的光纖系統的光感測 器，作為Raman probes對線上監測有機反應過程中的中間產物，研究其反 應機制。2004 年Besson5等人利用傅立葉轉換紅外光譜儀/減弱全反射光譜 儀. (fourier. transform. infrared. spectroscopy/attenuated. total. reflection, FTIR/ATR) 線 上 偵 測 未 飽 和 酮 類 的 氫 催 化 反 應 ， 例 如 exocyclicα,β-unsaturated ketone，得到的產物藉由chiral auxiliary使反應具有 鏡相異構物選擇性的效果，以FTIR/ATR作為即時監測的工具，可對動力學 反應的實驗作線上偵測應用。 2007 年Schafer6等人利用mobile HPLC裝置與自動進樣設備(圖 2-1)將 有機反應瓶中的反應溶液抽樣偵測反應的進度，例如Suzuki coupling反應的 探討。此方式以極少的樣品量即可作即時分析，作為攜帶型的監測工具。 6 .
(20) . 圖 2-1 mobile HPLC裝置與自動進樣設備6 . 2.2 線上分析質譜法 近年來有多個研究團隊開發以質譜法進行有機反應的線上分析，在 1998 年 Brum 與 Dell’Orco7 利 用 線 上 的 大 氣 游 離 法 (atmospheric pressure ionization, API)方式設計液相實驗裝置(圖 2-2)，先行利用光解的三苯乙烯分 子溶於甲醇先作光化學反應的模擬實驗，以證明此裝置可被應用於即時監 控反應動力學的變化。作者利用開發的的裝置研究液相的idoxifene光化學 轉換反應，即時偵測反應動力學結果並探討其反應機制。這種以傳統的 HPLC進樣系統方式直接與質譜儀連接，表現出質譜儀游離端與即時偵測裝 置的潛在應用性，作者設計此裝置介面希望成為一套即時偵測的探針 (in-situ probing)來對有機合成反應與其反應途徑作探討。. 7 .
(21) . 圖 2-2 利用API-MS與汞燈作光化學反應裝置示意圖7 . 2005 年Santos8等人也利用此API-MS質譜法搭配光化學反應裝置的概 念作線上偵測有機反應，探究反應機制。作者設計一微型反應器 (microreactor)作有機反應的反應槽介面，連接質譜儀作線上偵測，並說明 此裝置的優勢是能快速偵測反應結果。搭配HPLC管線與注射針幫浦而設計 了針對有機反應的即時偵測裝置(圖 2-3與圖 2-4)，搭配API-MS直接從溶液 中快速偵測反應的中間體(intermediate)，這將會對有機化學家在研究化學反 應的機制上獲得更多資訊。. 圖 2-3 微型反應器混合分析液後直接和ESI游離源連接偵測8 8 .
(22) . 圖 2-4 利用毛細管自動拉回的裝置控制反應時間裝置示意圖8 . 2.3 質譜線上偵測游離方式 質譜儀線上偵測的游離方式是由ESI游離源開始作應用，雖然直接注入 電噴霧游離質譜法(direct infusion electrospray ionization spectrometry)9-14與 膜進樣質譜法(membrane introduction mass spectrometry, MIMS)15-17已經有 了許多線上即時偵測的應用與研究，但為了改善前處理的步驟及避免樣品 變質，2007 年有直接分析即時離子化方法(direct analysis in real time, DART)18的發展，但由於DART游離所開發的裝置溫度過高 (250°C以上)， 會使反應物產生降解成熱不穩定的化合物而無法得到完整的質譜資訊。因 此發展了萃取式電噴灑游離法EESI作化學反應的線上即時偵測有機反應， 在 2008 年Zenobi1團隊利用氮氣吹送方式將分析物與電噴灑液滴混合，以萃 取式電噴灑游離法與串聯式質譜儀作Michael addition反應的線上偵測，裝 置示意圖(圖 2-5)中可得知反應處與游離源為兩個不同場合，此種萃取進樣 與游離方式改善了反應基質會干擾質譜偵測的現象。 作者藉 EESI 裝置介面搭配質譜儀得到反應機制與動力學資訊，協助提 高反應產率及降低對環境的損耗和污染。. 9 .
(23) . 圖 2-5 萃取式電噴灑游離法裝置示意圖1 . 雖然 EESI 裝置以氮氣吹送的方式較利於質譜法對易揮發的分析物偵 測，改善了進樣時反應溶液的基質干擾，但無法得知反應中未被吹送出裝 置的物質資訊，仍具有偵測上的限制。 2009 年Zheng19等人研究酮類化合物在大氣環境下，以間-氯過氧苯甲酸 (meta-chloroperoxybenzoic acid, m-CPBA)作固態的氧化反應Baeyer-Villiger (BV)並搭配脫附電噴灑游離法DESI與質譜儀作反應的線上偵測工具，直接 將反應的產物以質譜法進行偵測，得到有關於固態的BV反應的即時動力學 結果，包括反應速率、動力學曲線等資訊。此裝置的開發將質譜儀的技術 擴充應用於直接固態有機反應偵測solid-state organic reactions (SSORs)，能 使結果得到一關於生成物與產物的質荷比、強度與時間的即時 3D資訊(圖 2-6)，更利於反應機制的探討。. 10 .
(24) . 圖 2-6 solid-state organic reaction生成物與產物的質荷比、強度與時間的即 時偵測結果19 . 2.4 質譜進樣方式: 毛細管裝置進樣 了解質譜法的游離方式後，以質譜法線上即時偵測有機反應的方法發展 上，我們將探討是如何將樣品導入質譜儀的游離源，目前採用的有毛細管 自動進樣裝置與雙重 T 型混合進樣裝置等不同的方式。針對毛細管自動進 樣的裝置，希望能在不外加電力設備或是氣動裝置及注射針幫浦下，就能 達到進樣的目的，好處是能減少能源的損耗。 在 2011 年Chen20團隊開發出毛細作用的即時偵測工具，以大氣游離法 對少量樣品進行直接偵測，不需外添加進樣裝置就能使樣品導入，以簡單、 可拋棄式與低成本的偵測裝置作應用。其團隊也推測裝置運行的機制如圖 2-7作說明，藉由毛細現象與電荷吸引將樣品導入質譜進樣端，同時達到自 動進樣與游離效果。. 11 .
(25) . . 圖 2-7 以毛細作用直接進樣裝置樣品進樣與游離示意圖20 在 2012 年Chen21團隊以毛細管作線上質譜偵測時，用光學鏡頭拍攝進 樣過程(圖 2-8)，發現帶電分析物會受電牽引作用進樣而有毛細現象出現。 來印證裝置的毛細現象對於進樣具有輔助的效果。並在毛細管電壓大小對 於裝置進樣的影響探討上發現無電壓也能偵測得到分析物訊號，表示在毛 細管端就產生游離現象並同時以毛細作用將樣品導入。. . 圖 2-8 以光學鏡頭拍攝毛細管作用進樣的過程與電壓實驗探討21 12 .
(26) . 2.5 質譜進樣方式: Venturi effect 裝置進樣 2011 年McCullough22等人利用EESI-MS質譜方式作有機反應的線上即 時偵測，將分析物以Venturi effect方式進樣，與ESI電噴灑液作萃取使分析 物帶電荷，不需額外動力推送分析物進入質譜作反應的即時偵測，可以得 到反應中的動力學曲線以及反應速率。得到即時監測水楊酸乙酯(ethyl salicylate)水解成水楊酸(salicylic acid)的動力學研究，其中發現此技術可以 偵測到中間產物水楊酸甲酯(methyl salicylate)的訊號(圖 2-9)，搭配設計的 Venturi pump裝置其中反應的質譜圖(圖 2-9)：(A)是啟動反應的偵測；(B) 反應 25 分鐘後；(C)反應 25 分鐘後，可得到水楊酸乙酯水解的動力學研究。. 圖 2-9 利用EESI對水楊酸乙酯水解反應即時偵測的時間質譜圖22 2011 年作者Santos23團隊以Venturi pump的抽樣方式作線上反應偵測(圖 2-10)，開發大氣游離法進樣方式Venturi Easy Ambient Sonic-Spray Ionization (V-EASI)利用氮氣的輔助產生Venturi effect作為樣品導入的方式將液態樣 品或是溶劑抽取並吹送至質譜儀，其中裝置的開發設計後也利用古柯鹼 (cocaine)與市售的sildenaphil tablet作裝置的質譜應用。V-EASI裝置以 Morita–Baylis–Hillman reaction(MBH reaction)作線上偵測得到隨時間變化 13 .
(27) . 的即時質譜圖與反應的動力學變化結果(圖 2-11)。可以得到MBH reaction 的m/z 194 與m/z 306 的反應產物隨時間逐漸生成。. 圖 2-10 Venturi pump裝置進樣圖以及Venturi effect抽樣原理圖23 . . 圖 2-11 Venturi pump裝置線上偵測與動力學結果23 . 作者開發的 Venturi pump 進樣裝置上，所使用的壓縮氮氣流量為 3.5 L/min 以及毛細管(fused-silica capillary)的外徑為 125 μm 進行游離進樣，並 研究以純甲醇作溶劑裝置吸取的進樣流速約 20 μL/min;若為水溶液裝置的 流速約為 5-10 μL/min。 14 .
(28) . 2012 年作者Schwab24團隊更擴展利用Venturi easy ambient sonic-spray ionization (V-EASI)方式利用壓縮空氣瓶提供瞬間的高速氣流，可以在無施 加額外電壓下，使得裝置產生Venturi effect抽取樣品溶液，並利用壓縮空氣 作樣品的氣化與游離，達到質譜快速分析的結果(圖 2-12)，分別以正電模 式與負電模式偵測分析物(圖 2-13)。利用V-EASI快速偵測乙醯水楊酸分析 物作負電偵測模式，以及市售的sildenafil tablet測試裝置的可行性。以低成 本裝置結合直接質譜偵測已成為現在質譜法線上偵測的趨勢。. . 圖 2-12 V-EASI快速偵測實驗裝置示意圖與真實樣品圖24. 15 .
(29) . . 圖 2-13 分別以正模式(A)以及負模式(B)對分析物做偵測的質譜圖24. 2.6 質譜氮氣輔助樣品進樣探討 2011 年由Takada25等人發表了因質譜儀內部真空壓力小於外面待測樣 品氣壓，藉由氣流將樣品導入質譜儀中達到進樣效果，並應用此原理設計 一高通量的爆裂物成份快速偵測閘道，來快速檢測(圖 2-14)。. . 圖 2-14 利用壓力差作大氣游離進樣方式進行快速檢測裝置圖25 16 .
(30) . 繼Venturi pump裝置發展後，於同年 2011 年Karl-Christian26團隊也利用 Venturi effect作樣品進入質譜儀游離源的導入方式，即時得到腦部組織特定 的Lipids質譜訊號，作為疾病診斷資訊。文獻提到可以利用氮氣管線裝置的 設計達到Venturi effect進樣並且發現此氮氣可以做為有效的霧化氣體，使得 特定組織成份可以形成氣態離子被質譜儀偵測。其中作者也對改裝的氮氣 氣壓大小對於分析物訊號強度的影響作研究(圖 2-15)，在裝置運行下約 10 bar的氮氣能達到理想的質譜進樣與偵測效果。. . 圖 2-15 氮氣進樣端裝置壓力大小對於訊號大小的影響比較26 . 2.7 質譜儀線上即時偵測應用 2.7.1 利用質譜儀搭配毛細管進樣裝置線上即時偵測反應 在 2010 年 Chen2 等 人 ultrasonication-assisted spray ionization mass spectrometry (UASI-MS) 以毛細管與超音波震盪器連接質譜儀直接進樣裝 置，將微量離心管接上毛細管作線上即時偵測水解反應，如圖 2-16的裝置 17 .
(31) . 示意圖，利用UASIMS的連續偵測特性，作 4-O-benzyl-2,3,6-tri-O-benzoyl thioglucopyranoside的Zemplen reaction，可以得到隨時間變化的質譜圖資 訊。可以發現起始物m/z 711 隨反應時間，訊號強度逐漸遞減而生成m/z 607 的中間產物訊號與m/z 503 產物訊號，成功地運用開發的裝置得到反應的線 上偵測結果(圖 2-17)。. . 圖 2-16 UASI-MS作反應線上質譜偵測示意圖2. . 圖 2-17 Zemplen reaction對於時間變化的質譜圖2. 18 .
(32) . 2.7.2 線上偵測蛋白質水解反應 質譜法線上偵測除了應用於有機小分子的偵測分析外，也能對生化分子 作偵測，具有廣大的應用範圍。利用光學性質偵測蛋白質由酵素催化水解 反應的資訊在早期已建立，但以質譜學法建立其資訊可以有更佳的靈敏 性，以及搭配線上偵測更有利於蛋白質水解的機制探討。2012 年作者Yu 27 團隊利用自行開發的游離裝置probe electrospray ionization (PESI)結合質譜 儀作線上的即時偵測蛋白質水解反應，提供即時的資訊作為特定蛋白質在 不同pH值下水解的路徑與機制比較。其中作者利用cytochrome c在不同pH 值的消化反應得到不同生肽序列來推測不同的反應途徑(圖 2-18)。. . 圖 2-18 利用線上偵測cytochrome c在pH8 條件下的變化質譜圖27 . 2.8 T 型混合進樣質譜分析 2000 年Konermann28利用兩注射針結合Berger ball mixer與電噴灑質譜 儀裝置(stopped-flow ESI-MS)作acetylcholine溶液在不同pH值下的水解動力 學反應(圖 2-19)，其中S1 與S2 注射針幫浦為電腦控制的樣品進樣處，M 為 樣品的mixer，S3 為將混合樣品推送到ESI的注射針幫浦，以水稀釋樣品， 而兩組HS為進樣的控制閥，R為樣品反應的tube，C為進樣的毛細管。2011 19 .
(33) . 年Miao29 等人發展以pump為動力推送分析液至T型混合器將兩分析物混 合，再利用DESI裝置的電噴灑液作EESI來偵測即時反應(圖 2-20)，可從快 速的反應中得到反應動力學的研究，對於快速時間間距(milliseconds)進行的 生化反應有更進一步的偵測應用。作者將此EESI概念的裝置稱time-resolved DESI-MS，能於微秒間得到 2,6-二氯酚靛酚(2,6-dichlorophenolindophenol, DCIP) 與L-抗壞血酸(L-ascorbic acid, L-AA)還原反應的結果，具有高解析 度的偵測效果，而此time-resolved ESI-MS裝置則是來自於Konermann與其 他團隊設計與應用 30-35 。圖 2-20(A)為T型混合器與DESI裝置示意圖；圖 2-20(B)為質譜儀改造後的裝置圖。. 圖 2-19 注射針結合Berger ball mixer偵測acetylcholine溶液28. 20 .
(34) . 圖 2-20 T型混合器與DESI裝置作萃取式電噴灑(EESI)裝置示意圖29 . 2.9 Beckmann 重排反應 Beckmann 重排反應在有機化學裡是常見的反應之一。由德國化學家 Ernst Beckmann 所命名，此重排反應在碳-碳鍵間分裂而形成碳-氮鍵 (carbonnitrogen bond)在化學工業上製造 ε-Caprolactam 的過程扮演一重要的 重 要 方 法 ， 如 在 工 業 上 纖 維 耐 綸 (nylon) 合 成 時 所 需 的 粗 產 物 ， 由 cyclohexanone 與 cyclododecanone oximes 經由 Beckmann 反應重排得到。 另一 Beckmann 重排反應的應用為藥物對乙醯氨基酚(acetaminophen, APAP) 的合成，這是一種普遍存在於市場且常用的退熱和止痛藥物，也是許多感 冒藥和止痛藥的主要成分。 Beckmann重排反應通常需要較高的反應溫度、強酸與脫水介質36，2002 年Giacomelli37嘗試在室溫環境下，使用少量DMF為溶劑來取代有毒溶劑及 昂貴溶劑，並利用TLC片作反應的監控並計算ketoximes 轉換成amides的轉 換率。 21 .
(35) . 首 先 研 究 苯 乙 酮 (acetophenone) 的 反 應 ， 醛 酮 類 化 合 物 與 聚 磷 酸 (polyphosphoric acid, PPA)和鹽酸羥胺(hydroxylamine, NH2OH．HCl)混合後 加熱，醛酮化合物會先與鹽酸羥胺反應生成oxime中間產物，聚磷酸隨後提 供質子給oxime使其脫水後得到產物(圖 2-21)。若以苯乙酮(acetophenone, AP) 作 為 起 始 物 ， 理 論 上 產 物 可 為 acetanilide (AA) 和 n-methylbenzamide (NMB)兩種同分異構物. 圖 2-21 苯乙酮的 Beckmann 重排反應產物. 2.10 動力學法鑑定同分異構物 2.10.1 動力學法(kinetic method) 動力學法的概念是由Cooks等人 38 於 1977 年首先提出，並用來量測 alkylamines的質子親合力，所量得的pyridine質子親合力為 224.7 kcal/mol， 3-aminopentane則為 225.7 kcal/mol，這項結果與利用其他方式所得數據相 符。動力學法使用時以氣相中特定質子化二聚離子[A-H+-B]與惰性氣體進 行碰撞誘導解離後，離子斷片AH+與BH+的相對強度(式 1 和 2)，推導出分 析物A的質子親合力和氣相酸度；B為已知PA值的參考物。假設質子化二聚 22 .
(36) . 離子[A-H+-B]解離形成AH+或BH+的反應為不可逆，則k-1與k-2可忽略不計。 此外若AH+和BH+穩定不再進行二次解離，則AH+與BH+離子訊號強度取決 於k1和k2的大小。. 除了質子親合力和氣相酸度以外，動力學法也被廣泛的應用於電子親 合力(EA)、金屬離子親合力(metal-ion affinity)等物理性質的測量，或是生化 分子結構的判定，以及有機金屬配位基強度的探討等研究上。以下取自 Cooks等人 1994 年所發表的回顧文章39，舉例說明動力學法的不同應用: Hass 等人利用 formate ester 為參考物測量了 52 種 aliphatic alcohols 與 cyclic aliphatic alcohols 的氣相酸度，實驗結果與以平衡法求得的氣相酸度 結果相符。他們並觀察到在一級醇與二級醇上不同位置甲基化對氣相酸度 的影響，發現若在一級醇的 α、β、γ 位置分別加以甲基化，則會使得氣相 酸度分別增加 1.9 kcal/mol、1.6 kcal/mol 與 0.9 kcal/mol；同樣的，二級醇 上 α、β、γ 位置的甲基化，也使氣相酸度分別增加 1.0 kcal/mol、1.3 kcal/mol 與 0.8 kcal/mol。 動力學法除了物性的探討外，也可以應用質子親合力或氣相酸度的差 異區分同分異構物。Majumdar等人首先於 1992 年以動力學法辨別數種 methylcyclohexanols，發現它們氣相酸度的大小為：cis-2-methylcyclohexanol <. trans-2-methylcyclo-hexanol. =. cis-4-methyl-cyclohexanol. <. trans-4-methylcyclohexanol，而其中cis-和trans-4-methylcyclohexanol的氣相 23 .
(37) . 酸度雖然只差 0.1 kcal/mol，仍然可以加以分辨。除了區分同分異構物以外， Squires等人則將動力學法運用於研究烷基環己酮類進行還原反應時，不同 烷基取代基對產物選擇性的影響。他們先將具有不同取代基的烷基環己酮 於氣相中以hydride(H-)進行還原，生成兩種不同烷氧離子(alkoxide ion)異構 物。這兩種環氧離子具有不同的質子親合力。 除了結構異構物外，Cooks 等人於 1994 年更將動力學法推展至分析混 合液中鏡像異構物的組成。以鏡像異構物l-lucine(l-Ile)和d-lucine(d-Ile)標準 品與參考物l-alanine(l-Ala)形成聚合離子，經碰撞誘導解離後，可得相對強 度比l-Ala/l-Ile = 0.0047；l-Ala/d-Ile = 0.0056。並根據這些結果，結合兩點 校正法(two-point calibration curves)推算出混合液中l-Ile與d-Ile的相對含 量，以分析物l-Ile與參考物產生的產物離子斷片比值對分析物l-Ile的相對含 量作圖即可得到兩點所形成的檢量線，以此檢量線對分析物l-Ile與d-Ile進行 相對含量的定量分析即稱之為兩點校正法。近來Vairamani 等人40也利用相 似的方法以L-3,5 diiodo-L-tyrosine為參考物，對混合液中d-Val與l-Val進行相 對含量的定量分析。除了成功的對鏡像異構物定量外，也發現以Cu(Ⅱ)為 中 心 錯 合 金 屬 所 得 的 離 子 斷 片 差 異 性 較 以 Ni( Ⅱ ) 為 中 心 金 屬 時 大 。 Vainiotalo等人 41 以參考物l-Pro對兩組di-endo與di-exo的環類胺基酸異構物 以及三組順反式的環類胺基酸異構物。. 2.10.2 質譜動力學法對三同分異構物相對定量分析 除了以動力學法對混合液中的兩種同分異構物進行分析外，Cooks等人 也在 2003 年提出對混合液中三個立體異構物進行分析。42以Ni金屬與參考 物以及分析物形成錯化合物，再由兩個不同的參考物對相同的金屬錯合物 24 .
(38) . 可得到兩種不同的分析物與參考物斷片離子比例，最後藉由求出混合液中 d、l與meso tartaric acid的莫耳分率。Cooks於 2003 年成功地展示以動力學 法對混合液中三種同分異構物進行相對含量的定量分析。隨後，Vairamani 等人也在 2004 年發表利用相似的方法對混合液中的三種醣胺類進行相對 含 量 的 定 量 分 析 43 。 分 別 選 用 l-Pro 與 l-Trp 作 為 參 考 物 與 三 種 醣 胺 類 (glucosamine、galactosamine、mannosamine)形成質子化二聚離子，再藉由 外加能量碰撞產生不同的分析物/參考物離子斷片比例並與分析物相對含 量作圖，即可成功地以三點校正法對混合液中三種醣胺類分析物進行相對 含量的定量分析。 動力學法不僅可利用質子親合力或氣相酸度的不同達到分辨同分異構 物的效果，也可以同分異構物與參考物所形成的質子化二聚離子藉由碰撞 後所生成的分析物/參考物斷片離子比例不同進而分辨同分異物，並成功地 利用兩點或三點校正法對混合液中兩個以及三個同分異物進行相對含量的 定量分析。. 2.10.3 質譜動力學法搭配理論計算研究質子親合力大小 動力學法除了可將兩個以及三個同分異物進行相對含量的定量分析 外，也搭配理論計算方式對未知的質子親合力化合物作研究，Cooks等人也 在 2005 年提出利用動力學法計算N-Heterocyclic Carbenes的質子親合力大 小，並利用密度泛涵理論(DFT calculations)來推算理論值作實驗與理論的比 較44。2010 年Lee 等人也利用此方法與理論計算方式對Phosphines的化合物 作計算，建立於有機合成上關於Phosphines的質子親合力大小45。2012 年 Nyulászi等人將carbene作催化反應的催化特性利用密度泛涵理論計算來解 釋，並用動力學法得知carbene五圓環取代基效應的原子質子親合力大小為 25 .
(39) . N > S > O，較高的質子親合力會因為碳氮鍵間有雙鍵的結構而有些微減少 46. 。. 2.10.4 動力學法和加速揮發方式偵測同分異構物樣品 本實驗室已於 2010 年 47 成功利用動力學法和加速揮發方式偵測同分異 構 物 樣 品 ， 選 定 以 結 構 異 構 物 ： 非 對 稱 性 二 甲 基 精 氨 酸 (asymmetric dimethylarginine,. ADMA) 和 對 稱 性 二 甲 基 精 氨 酸 (symmetric. dimethylarginine, SDMA) 為分析物研究 ( 表 2-1) 。以及對混合液中的三個同 分異構物的分析，探討的分析物有三大類，分別為醣胺類(GluNH2, GalNH2 and ManNH2) 、 醣 類 (glucose, galactose and mannose) 與 甲 基 精 胺 酸 (2-methylpyridine, 3-methylpyridine and 4-methylpyridine)。各別將醣胺類、 醣類進行相對含量的定量分析，並利用文獻值比較結果( 表 2-2)。 表 2-1 兩種計算方法所求得混合液中ADMA/SDMA比例51. 表 2-2 比較不同比例的醣胺類分析物混合液實驗結果與理論值51. 26 .
(40) . 第三章. 實驗方法. 3.1 藥品 藥品名稱. 廠牌. 分子量(g/mol). CAS Number. Acetylsalicylic acid Salicylic acid D-galactosamine D-glucosamine L-proline o-xylylenediamine Acetaminophen N-methylbenzamide Acetanilide Phenyl acetate EDTA．2NH3 Caffeine Ammonium bicarbonate. Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Fluka Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Alfa Aesar -a Alfa Aesar Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich. 180 138 179 179 174 136 151 135 135 136 362 194. 50-78-2 69-72-7 1772-03-8 66-84-2 147-85-3 17300-02-6 103-90-2 613-93-4 103-84-4 122-79-2 304675-80-7 58-08-2. Sigma-Aldrich. 79. 1066-33-7. ~12 kDa. 9007-43-6. ~12 kDa. 9007-43-6. ~17 kDa. 100684-32-0. 23.8 kDa. 9002-07-7. 蛋白質 Cytochrome c from horse heart C7752 Cytochrome c from bovine C3131 Myoglobin from equine skeletal muscle M0630 Trypsin from bovine T1426. Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich. a. Acetanilide 是利用實驗得到的產物自我純化而成. 27 .
(41) . 實驗中所使用的樣品溶液皆是先以1:1的甲醇水溶液為溶劑配製成約 10-2 M的貯存溶液(stock solution)，進行質譜分析前再取10 μL的貯存溶液並 加入1:1的甲醇水溶液990 μL稀釋成約為10-4 M的溶液，配置完成的溶液放 置於冰箱中保存，等待後續實驗使用。H2O為18.2 MΩ/cm超純水(DI-water)， 貯存溶液最終濃度約為10-2 M。 蛋白質的樣品溶液是先以超純水為溶劑配製成約10-2 M的貯存溶液，配 置完成的溶液放置於零下20°C冰箱中保存。進行質譜分析前再取10 μL的貯 存溶液並加入溶劑990 μL稀釋成約為10-4 M的溶液或稀釋成10-5 M溶液進行 實驗。. 3.2 儀器 質譜儀為Micromass®UK所生產的Micromass Q-TOF，游離源可為電噴 灑游離與大氣化學游離兩種。質量分析器為四級桿質譜分析器(quadrupole mass analyzer)與時間飛行器(time of flight，TOF)的串聯使用。分析時的質 譜最佳參數為：Source Block Temp：100°C、Desolvation Temp：180°C、Cone： 15 V 、Gas Cell：5 psi 、CID能量：3 V。選擇離子的CID是使用四極柱串 聯飛行時間式質譜儀(Q-TOF MS)，碰撞氣體為氬氣，質譜儀電噴灑裝置使 用的氮氣分為兩種:Nebuliser Gas與Desolvation Gas其中Nebuliser Gas流速 約為20 liters/hour而Desolvation Gas流速300 liters/hour。電噴灑游離質譜圖 和碰撞誘導解離質譜圖為收集時間1分鐘。進樣系統以本實驗室開發的自動 進樣(self-pumping pump)或直接注入進樣(direct infusion)兩種方式，直接注 入進樣系統所使用的注射針幫浦為KDS101 (kd scientific)，操作流速固定為 8.0 μL/min。. 28 .
(42) . 3.3 VESI自動進樣的參數探討 取 0.0220 g葡萄糖胺鹽(D-Glucosamine‧HCl)以 10 mL DI-water配置成 10-1 M D-Glucosamine水溶液(Glu)作為母液保存。每次一個新實驗由母液 10-1 M稀釋作實驗。取用已配置的 10-1 M母液 10 μL與 990 μL DI-water稀釋 成 10-3 M溶液。吸取 10-3 M溶液體積 100 μL(以 10-100 μL微量吸管)實驗。. 實驗步驟 以self-pumping方式進樣DI-water收集 1 分鐘偵測訊號作為背景值後快 速置換微量離心管 100 μL的Glu溶液，將 100 μL 10-3 M的Glu和水分別置入 1.8 mL的微量離心管中，約 10-15 秒(sampling time)後MS圖TIC強度會上升 (因不同管徑，有所差異)在質譜圖上出現m/z 180 與m/z 162 的Glu訊號，隨 時間逐漸增強而連續進樣得到穩定的進樣訊號，直到self-pumping裝置將溶 液抽完訊號消失，收集質譜層析圖，如圖 3-1所示。最後計算出現m/z 180 時間到結束的時間差DT(during time)後以 100 μL體積計算得到self-pumping 裝置 100 μL分析物所產生流速。. 圖 3-1 self-pumping 裝置測試流速示意圖以 Glu 溶液作偵測 . 3.4 質譜儀進樣裝置設計 29 .
(43) . 在傳統的質譜儀進樣偵測與動力學法實驗上，皆以傳統電噴灑游離源 ESI執行，其中在動力學法上分析物與參考物會處配置於同一個樣品液中， 無可避免的，樣品液中的基質可能會抑制分析物的游離效率，而無法有較 低的偵測極限。因此實驗室發展了以加速揮發游離法，嘗試降低基質的干 擾的目的，但裝置因注射針幫浦作為ESI溶劑容量體積有限，無法作常時間 連續式的ESI進樣，本實驗設計之裝置則嘗試改良加速揮發游離法，將注射 針幫浦改以氮氣作Venturi effect自動進樣裝置取代作為質譜進樣工具。 設計VESI自動進樣裝置的目的是作分析溶液的連續進樣，連接於質譜 儀作即時的偵測，希望藉此裝置改良本實驗室以往利用注射針幫浦或是以 HPLC進樣的方式，可觀察到反應隨時間變化的反應動力學結果。 本研究設計的VESI自動進樣裝置其優勢是不需將游離源作額外改造， 作快速偵，將對有機反應與蛋白質水解反應作即時偵測的應用，以及進樣 流速參數作探討。. 3.4.1 VESI自動進樣裝置實驗 本實驗室設計的VESI自動進樣的裝置，希望能在不外加電力設備或是 氣動裝置及注射針幫浦下，就能達到進樣的目的，設計並測試裝置的穩定 性，再利用裝置的連續進樣與多通道進樣來針對線上的反應作即時偵測。. 30 .
(44) . 圖 3-2 VESI 自動進樣的裝置圖 VESI自動進樣裝置進樣設計(圖 3-2)，是將口徑為0.005公分毛細管裁切 約12公分長度作為自動進樣裝置管線，再將樣品瓶蓋打孔洞以便毛細管穿 入，將末端浸入溶液液面下，另一端以轉接頭連接，接上質譜儀的電噴灑 游離源後進樣偵測訊號。 將此裝置設計方法的反應瓶應用到微量離心管(eppendorf)中作改良(圖 3-3)，將配置於微量離心管的樣品，直接連接裝置作質譜儀即時偵測。在不 外加電力設備或是氣動裝置及注射針幫浦下，自動進樣裝置搭配操作人員 的輔助能幫助質譜儀作快速且大量樣品的偵測。. . 圖 3-3VESI 自動進樣裝置進樣裝置與質譜儀連接示意圖 31 .
(45) . 3.4.2 VESI 自動進樣原理與裝置改良 質譜儀電噴灑裝置使用的氮氣分為兩種霧化氣體 Nebuliser Gas 與去溶 劑氣體 Desolvation Gas。以實驗結果統整發現裝置能進樣的原因為是質譜 儀氮氣在導入游離源時，會產生一氣壓差使得在游離源進樣處產生吸引力 使溶液進樣。在質譜儀設計上，離游離源進樣處較接近的為 Desolvation Gas 所以推測主要影響自動進樣的效果為氮氣。 VESI 自動進樣優勢是利用本研究開發的進樣裝置可快速拆裝且簡易的 對分析樣品進樣，作為質譜儀的額外配件，不須受過專業訓練的人員也能 獨立操作本實驗裝置，為本研究中實驗裝置設計的最大優勢。 藉由 VESI 裝置簡易的特性，能依不同的反應需求改良管徑大小，來控 制進樣流速大小。如作蛋白質水解反應時需要將反應作控溫以及在有限的 反應溶液體積下需要收集 60 分鐘的反應即時圖，所以以較低的進樣流速， 作線上即時偵測收集質譜的反應時間圖，改成毛細管進樣，使得在固定的 體積內有更長的進樣收集時間。. . 圖 3-4 改良 VESI 進樣自動進樣裝置與質譜連接介面的應用示意圖. 32 .
(46) . 因為連續自動進樣方式能提供穩定的進樣速率使偵測訊號穩定。樣品瓶 為微量離心管在質譜的操作上可快速更換待測樣反應瓶，達大量分析效 果。可利用不同容量的反應瓶作連續進樣與清洗質譜系統，不需擔心注射 針幫浦的注射針容量影響連續偵測時間與樣品交叉汙染的問題。. 3.5 VESI 自動進樣裝置測定流速的參數探討 在探討實驗參數部分將對self-pumping裝置分別討論毛細管不同長度與 不同材質、不同進樣體積、不同毛細管電壓大小與分析物對於進樣速率的 影響實驗參數比較如下圖 3-5。. . 圖 3-5 探討實驗參數部分將對 self-pumping 裝置流速實驗圖 實驗方法以VESI自動進樣裝置測定，選用Glu水溶液作為偵測溶液，濃 度為 10-3 M(裝置PEEK管徑為 130 μm長度 10 公分)進行流速測定實驗。 證明 VESI 裝置的可行性後，本研究將探討裝置進樣的實驗參數以便自 動進樣進行線上即時偵測反應實驗。探討的裝置條件主要是以影響進樣流 速的參數，以求得在進行線上即時偵測反應的反應時間準確性。其中探討 33 .
(47) . 了同口徑不同長度的毛細管對於進樣速率的比較以及不同進樣體積、不同 毛細管電壓大小與分析物對於進樣速率的影響。並對樣品進行線上偵測的 應用以及裝置在架設時的 troubleshooting。. 3.6 VESI 進行線上偵測實驗 利用開發的 VESI 自動進樣裝置分別進行了乙醯水楊酸水解反應、蛋白 質水解反應與苯乙酮於酸催化下合成醯胺反應的測試。其中進行蛋白質 Cytochrome c 和 Myoglobin 與 Trypsin 反應得到的線上即時反應結果以已知 的流速結果進行反應的偵測，可以更精確的得到反應時間與偵測的延遲關 係及得到反應的變化過程，希望在即時途中可以得到反應中進行的方式， 希望利用簡易的 VESI 自動進樣裝置進行即時反應，了解反應進行的機制 與路徑。. 3.7 VESI 雙重進樣裝置 藉由T型接頭的使用，VESI除了單重進樣外也可進一步改良成雙重進樣，達連續. 自動進樣的效果。方法是將兩配製好的不同樣品能先行以物理方式進樣混 合，不需偵測前先混合後以質譜儀量測，如實驗裝置示意圖(圖 3-6)。 分別以兩個實驗作為應用為例證明裝置的可行性，一是選用在液相中可 產生的反應，阿斯匹靈水解反應，藉由質譜的偵測分析水解產生的產物與 起始物強度，會因不同pH值而有不同水解的變化。第二實驗是利用本實驗 室作同分異構物鑑定時所用的動力學法方式，將兩分析物形成的二聚體離 子作CID實驗來推測兩分析物的質子親合力大小關係，並比較文獻值，發現 此進樣方法不需在質譜分析前將分析物混合就能利用VESI雙重進樣裝置， 使兩分析物形成二聚體離子。. 34 .
(48) . . 圖 3-6 VESI 雙重進樣與質譜的應用示意圖(雙重進樣) . 3.8 同分異構物相對定量分析 3.8.1 動力學法(kinetic method) 鑑別同分異構物時，因為相異的異構物具有不同的PA值，因而其與參 考物所生成的離子訊號相對強度會有所差異。藉由未知物和標準品碰撞誘 導解離(collision-induced dissociation ,CID)圖的訊號強度比對，則可以不需 層析分離技術而達到鑑定未知物的目的，以及分析混合液中同分異構物的 個別含量。動力學法使用時以氣相中特定質子化二聚離子(A-H+-B)與惰性 氣體進行碰撞誘導解離後，得到離子斷片AH+與BH+的相對強度，而推導出 分析物A的質子親合力；B為已知PA值的參考物(圖 3-7)。選擇適當的參考 物作為動力學參考物。動力學法之溶液的配置方式，將在未來實驗方法中 敘述之。. 35 .
(49) . . 圖 3-7 質子化二聚離子碰撞誘導解離後離子訊號相對強度示意圖 . 3.8.2 尋找適當的參考物 本實驗研究的方向為 ketoximes 藉由 Beckmann 重排得到 Amide 的兩同 分異構物， Acetanilide(AA)與 N-methylbenzamide (NMB)，所以選擇適當 的參考物(Ref)是進行動力學法時一個重要的步驟，若是參考物和同分異構 物間的質子親合力差距過大，則無法形成質子化二聚離子，以及後續碰撞 誘導解離使用。有時即便可以生成質子化二聚離子，但是碰撞誘導解離後 只會有單一斷片離子出現。為了尋找適當的參考物，首先篩選一個與同分 異構物構造相似的化合物，將其分別與同分異構物的標準品混合後以電噴 灑游離(ESI)方式注入質譜儀進行偵測。觀察有無質子化二聚離子生成，若 無則再改換參考物，直到觀察到有質子化二聚離子生成為止。 得到質子化二聚離子X-H+-Ref後即可以串聯式質譜方式進行碰撞誘導 解離。若無法同時獲得X+和Ref+的訊號，則需更換參考物。. 36 .
(50) . . 圖 3-8 質子化二聚離子X-H+-Ref碰撞誘導動力學式 . 3.8.3 混合液中同分異構物的相對含量 找到合適的參考物後，則將AA和NMB標準液分別與參考物混合，以電 噴 灑 游 離 方 式 合 成 X+---H+---Ref ， 並 紀 錄 碰 撞 誘 導 解 離 後 I(Acetanilide+)/I(Ref+)和I(NMB+)/I(Ref+)的數值RA(式 1)和RN(式 2)。 Acetanilide + RefH. ⎯ESI ⎯→. Acetanilide-H+-Ref ⎯CID ⎯→. + NMB + RefH ⎯ESI ⎯→ NMB-H -Ref ⎯CID ⎯→. + Mix + RefH ⎯ESI ⎯→ Mix-H -Ref ⎯CID ⎯→. % Acetanilide = X =. I NMB+ I Re f +. I Mix+ I Re f +. = RN. = RM. ( RM − RN )(1 + RA ) x 100 % ( RA − RN )(1 + RM ). I Acetanilide+ I Re f +. = RA. (1). (2). (3). (4). 將參考物加入含AA與NMB的混合液中，由於AA與NMB為同分異構 物，所衍生的質子化二聚離子具有相同的質荷比(m/z 136)。經過碰撞誘導 解離(CID)後m/z 136 將產生強度比值為RM的X-和Ref-兩種斷片離子(式 3)， 在 此 X- 為 [AA+H]+ 和 [NMB+H]+ 兩 種 離 子 的 混 合 ， 若 將 [AA-H+-Ref] 和 [NMB-H+-Ref]離子解離時的效率(cross section)視為相同，則X-訊號強度中 [AA+H]+ 和 [NMB+H]+ 的 相 對 含 量 即 是 m/z 136 訊 號 中 [AA+-H+-Ref] 和 37 .
(51) . [NMB-H+-Ref]離子相對含量，也可代表著混合液中AA與NMB相對含量。 假設X-訊號強度中，[AA+H]+的相對含量為X%，[NMB+H]+的相對含量為 (1-X%)，而RM是由X%的RA(式 1)和(1-X%)的RN(式 1)所歸納而來，則混合 液中AA與NMB相對含量可以由算式 4 計算得到。. 3.8.4 直接碰撞誘導解離法(collision-induced dissociation, CID) 鑑別同分異構物時，利用同分異構物的結構不同特性，經由碰撞誘導 解離後，會因斷鍵鍵能不同而產生不同片段離子訊號，藉此異構物間強度 差異製作不同濃度下檢量線來鑑定與同分異構物含量。. 3.8.6 混合液中同分異構物的 CID 相對含量 配製不同Acetanilide與NMB標準品的相對含量比例(表 3-1)將每組待 測混合物利用甲醇/水當溶劑混合，調整並控制混合物濃度在 10-3~10-4 M， 避免濃度因素影響相對含量的鑑定。以質譜CID選定同分異構物離子m/z 136 鑑定Acetanilide與NMB的片段離子訊號強度，回推原同分異構物母離子 的相對含量關係。 表 3-1 AA 與 NMB 標準品的相對含量比例. 38 .
(52) . 3.8.6 CID 碰撞能的選定 調整直接碰撞誘導解離法所需的 CID 碰撞能量，將會影響本鑑定方法 的準確性，若擇選擇的碰撞能量太低則使片段離子訊號強度弱，在相對含 量計算下誤差大。若擇選擇的碰撞能量太高則片段離子再次碰撞斷裂，也 會導致在相對含量計算下因失去原預期的片段離子，造成定量上的誤差。 所以必須找尋是當的碰撞能為此直接 CID 實驗的最佳參數。. 3.8.7 CID 檢量線製作與相對定量計算 利用表 1 中第 1 組至第 3 組的 AA 與 NMB 標準品相對含量比值作檢 量線的橫軸(X 軸)，而將相對含量中 AA 片段離子 m/z 94 與 NMB 片段離子 m/z 105 訊號強度比值作檢量線的縱軸(y 軸)。配置表 3-1 中第 6 組比例濃度 的 AA 與 NMB 標準品混合物而利用內插法檢驗檢量線的準確性，以及利用 表 3-1 中第 4~5 組作檢量線的外插法再次檢驗檢量得可效性的範圍。 在計算 Beckmann 同分異構物的相對含量是利用檢量線的公式(y=ax+b)得 到，將 AA 片段離子 m/z 94 與 NMB 片段離子 m/z 105 訊號強度比值作 y 代入檢量線的公式，得兩同分異構物相對含量。. 39 .
(53) . 第四章. 結果與討論. 針對本研究開發的 VESI 自動進樣裝置與直接進樣兩種裝置進行探討， 發現 VESI 自動進樣裝置可取代傳統的注射針幫浦進行樣品分析，並能有穩 定的進樣效果，作未來線上偵測反應的自動進樣裝置及其應用。. 4.1 VESI 自動進樣裝置與注射針幫浦的比較 首先將PEEK進樣管口浸於溶液液面下，利用Venturi effect的原理與毛細 現象，以 1:1 甲醇水溶液偵測，可以得到穩定的溶液訊號，甲醇水溶液的 訊號強度與施加的電噴灑游離電壓和質譜儀入口所施加的cone電壓有正相 關。為了瞭解所觀察到的訊號確實來自電噴灑游離，乃將電噴灑游離電壓 進行多次的開/關切換，發現當電壓開啟時總訊號強度(total ion current, TIC) 立即上升且趨於穩定(圖 4-1)，電噴灑游離電壓關閉時則無明顯訊號產生， 以每隔 2 分鐘進行電壓的開關切換，比較 4 次開關切換循環的總訊號強度 並無明顯差異，證實VESI自動進樣裝置有很好的穩定性。. 圖 4-1 VESI 自動進樣裝置的穩定性 40 .
(54) . 確認自動進樣裝置的可行性後，乃進一步比較它與傳統注射針幫浦進樣 方式的效果;使用的注射針幫浦流速為 8.0 μL/min。圖 4-2是acetaminophen 標準品的離子總訊號質譜圖，其中(A)是以注射針幫浦進樣，(B)是以自動進 樣，發現自動進樣較注射針幫浦進樣的總離子訊號高了 50%以上，由於自 動進樣操作及成本上都遠優於注射針幫浦進樣，未來應可以取代注射針幫 浦作為進樣裝置，並且可以擴展為多樣品的同時進樣。. 圖 4-2 注射針幫浦(A)與自動進樣裝置(B)進樣的比較. 4.2 以自動進樣裝置偵測化學反應 自動進樣裝置可以連續進樣，克服了以注射針幫浦或HPLC進樣方式無 法進行線上即時偵測化學反應變化的缺點，為了解此項裝置使用上的表 現，我們以乙二胺四乙酸二胺鹽(ethylenediaminetetraacetic acid diammonium salt, EDTA․2NH3)作為樣品，記錄質子化EDTA訊號強度與觀察時間的關 係。測試時先將 1:1 甲醇水溶液置入容器中，等待 1 分鐘後再加入EDTA溶 液(圖 4-3)。. 41 .
(55) . 圖 4-3 探討自動進樣裝置進樣時間的示意圖 . 加入EDTA溶液約 1 分鐘後，可以觀察到穩定的質子化EDTA (m/z 293) 訊號 (圖 4-4)，因此所設計的自動進樣裝置可以觀察，化學反應經過 1 分 鐘以後的變化。此項觀測時間的延遲會受到溶液黏度和毛細管長度的影 響，較黏稠的樣品將導致延遲時間的增加。. 圖 4-4 自動進樣裝置進樣的質譜圖: (A) TIC 圖；(B) 進樣MeOH/H2O 溶 液 1 分鐘後，添加EDTA溶液前；(C) 添加EDTA溶液 42 .
(56) . 4.3 VESI 自動進樣與游離法的開發 4.3.1 自動進樣裝置探討 本研究原有構想為利用質譜儀進行電噴灑游離時，液體會在出口端形成 泰勒錐不斷將液體牽引出而造成流動，來達到將樣品自動導入游離源的目 的，研究發現所設計的 VESI 方式確實可以自動將樣品導入電噴灑游離源 中，但液體趨動的力量主要來自電噴灑游離時所用的霧化氣體所造成 Venturi effect 所形成的壓力差而非原先設想的泰勒錐。進一步探討質譜儀中 真空效果與氮氣導入的參數影響。研究利用 VESI 連續是偵測特性，以不改 ESI-MS 的游離機制下加裝進樣裝置並探討裝置進樣的主因。. 4.3.2 VESI 自動進樣裝置機制探討 實驗發現，在沒有氮氣輔助下質譜 TIC 圖上無法看到訊號變化，只能 以觀察方式看樣品瓶的液面高度下降情形作判斷。在未開氮氣下液面不會 下降，而再度開啟氮氣後液面就有明顯的下降現象，因此推測造成裝置能 自動進樣的因素推測為氮氣導入而非真空壓差所致。 設計連續進樣實驗如圖 4-5，先開啟毛細管電壓偵測Glu水溶液訊號後 接續關閉電壓及將質譜儀降溫(排除電壓、溫度參數影響)只保留氮氣導入裝 置處於開啟狀態發現水溶液液面有下降情形後，在偵測時間 9 分鐘時關閉 氮氣並持續觀察發現液面無在下降，證明在無電壓下氮氣的導入是影響流 速大小的關鍵參數。. 43 .
(57) . . 圖 4-5 連續進樣偵測 Glu 訊號質譜圖(無毛細管電壓) . 開啟電壓 2600 V下關閉氮氣導入後實驗觀察發現液面下降情形，比較 無電壓結果，在質譜偵測時間 1 分鐘確定樣品正常導入偵測後，保持電壓 開啟但關閉氮氣，訊號隨即下降液面高度也隨時間逐漸下降，至偵測時間 約 12 分鐘時發現容易即將抽取完，為了以訊號表示再開啟氮氣後將最後一 滴溶液偵測，而出現訊號後再度下降如圖 4-6(表示溶液抽完)，說明在施加 電壓下氮氣的導入是影響流速大小的關鍵參數。. . 圖 4-6 連續進樣偵測 Glu 訊號質譜圖(有毛細管電壓). 44 .
(58) . 研究發現所設計的VESI方式確實可以自動將樣品導入電噴灑游離源 中，但液體趨動的力量主要來自電噴灑游離時所用的霧化氣體所造成 Venturi effect所形成的壓力差而非原先設想的泰勒錐。實驗後推測自動進樣 裝置是因為有氮氣的輔助而將待測溶液導入質譜儀游離源，氮氣對溶液作 氣化與去溶劑的作用。對質譜儀裝置的設計上發現氮氣導入系統中，氣體 管線的口徑差異會導致系統出現壓力差而產生Venturi effect的進樣機制如 圖 4-7。. . 圖 4-7 VESI 自動進樣裝置氮氣的輔助造成 Venturi effect 現象 . 利用質譜氮氣系統設計上額外產生的 Venturi effect 現象將溶液吸取導 入質譜儀，開發出不需改造游離法，對反應進行線上偵測的一套自動進樣 系統，命名為文氏管電噴灑游離質譜法(Venturi electrospray ionization mass spectrometry, VESI)，以此性質進行線上即時偵測反應產物的應用。以自動 進樣裝置對本研究針對樣品液所用的溶劑和樣品液輸送管的管內徑等因素 對樣品液傳送速度的影響進行了探討，並尋找適於偵測探討的反應並開發 雙管自動進樣裝置來擴展其應用性。 45 .
(59) . 4.4 質譜儀進行自動進樣裝置參數的探討 . 在探討實驗參數部分將對 self-pumping 裝置分別討論毛細管不同管徑. 與材質、毛細管電壓大小與分析物對於進樣流速的影響實驗參數比較以及 選用的分析物於質譜儀中參數的最佳化。 探討參數實驗首先利用自動進樣裝置(self-pumping)測試質譜儀對於分 析物訊號效果，本實驗所選定可溶於水的葡萄糖胺(D-Glucosamine, Glu)作 實驗， Glu在質譜正離子模式下質譜圖(圖 4-8)得到m/z 180 且在質譜圖中 也會看到Glu因質譜能量斷裂得到m/z 162。 進行流速測定時，將超純水置入容器中以self-pumping裝置材質為PEEK 種類，管內徑 130 μm長度 10 公分抽取，等待 1 分鐘後再加入 100 μL Glu 水溶液，在質譜TIC圖(圖 4-7A)上看到訊號上升且穩定直到溶液被抽乾後訊 號下降。計算有Glu訊號時間(During time)在除上 100 μL得知自動進樣裝置 的流速，且可以由不同時間如 0.5 分鐘(圖 4-9B)與 1.5 分鐘(圖 4-9C)的質 荷比圖看到訊號的上升的確是因質譜儀偵測到Glu質子化的訊號導致。. 46 .
(60) . . 圖 4-8 葡萄糖胺(Glu)標準品的質譜圖. . 圖 4-9 VESI 裝置測定流速 TIC 圖以及質譜圖隨時間變化的結果 . 47 .
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