含水量對酸解反應的影響

適量的水可維持酵素分子周圍的水合層以維持酵素之活性，但當水量過多時則會促進 水解(Dordick, 1989)。在以酵素催化的酸解反應過程中，兩步驟(two-step)反應例如:水解和 酯化，通常相伴發生。水解反應常被視為反應的速率決定步驟。明顯的，水是水解反應中 的反應物，但在酯化反應中卻是反應的生成物，因此水在以脂解酵素催化的酸解反應中扮

演著極重要的角色。

Oleic acid content in glycerides (mol%)

Reaction time (h) mol%，三酸甘油酯在甘油酯中之含量可達 97.12%。Irimescu et al. (2002)指出 Novozym 435 在過量乙醇的反應條件下，會具有很精確的 sn-1,3 位置特異性。本節利用 sn-1,3 位置特異 性的猪胰臟脂解與 Irimescu et al. (2002)的實驗方法，分析酸解產物 sn-2 位置脂肪酸組成。

將前述酸解反應產物以 TLC 片分離出 TG，再將此 TG 分別以猪胰臟脂解酵素及 Novozym 435 催化水解(猪胰臟脂解酵素)及醇解(Novozym 435)反應得到 2-MG，再分析 2-MG 中的脂 肪酸組成，結果如表 4-6 所示。由表 4-6 可知 2-MG 中油酸比例為 9.26 mol%(利用猪胰臟脂 解酵素分析)及 9.21 mol% (利用 Novozym 435 分析)，此表示在製備結構脂質 OPO 或以猪胰 臟脂解酵素及 Novozym 435 製備 2-MG 時，有醯基轉移產生。

表 4-6 酸解反應產物^a三酸甘油酯及 sn-2 位置之 FFA 組成 FFA (mol%)

Fatty

Acid Total^b sn-2^c sn-2^d C16:0 34.33±0.48 90.74±0.92 90.79±0.33 C18:1 65.67±0.62 9.26±1.06 9.21±0.47

a: 在正己烷中，以 Lipozyme IM 脂解酵素催化三棕櫚酸甘油酯與油酸之酸

4.9 以HPLC-ELSD分析酸解產物三酸甘油酯中OPO含量

銀離子管柱層析主要是由於銀離子的特性會與分子結構中碳-碳双鍵的π-電子形成可 逆的離子化合複合物(reversible polar complexes)，也會依照双鍵的數目、結構和位置而區分 不飽和化合物。銀離子與Carbonyl-group oxygens的自由電子對之間的相互作用力，也是產 生分離效果之因素(Dobson et al., 1995)。

圖 4-7 為以銀離子 HPLC 管柱分析三酸甘油酯標準品之圖譜，peak 1 為 Tripalmitin (PPP), peak 2 為 1,3-dipalmitoyl-2-oleoyl-glycerol (POP), peak 3 為 1,2-dipalmitoyl-3-oleoyl-glycerol (PPO), peak 4 為 1,3- dioleoyl-2-palmitoyl-glycerol (OPO), peak 5 為 1,2-dioleoyl-3-palmitoyl-glycerol (OOP), peak 6 為 Triolein (OOO)。

圖 4-8 為酸解產物三酸甘油酯的分析圖譜，由標準品相對滯留時間(retention time)比對 可知 peak 1 為 PPP, peak 2 為 PPO, peak 3 為所要合成的結構脂質 OPO, peak 4 為 POO, peak 5 為 OOO。

Letter (1993)指出 ELSD 雖然偵測相同濃度的 TG 標準品，卻不會有相等的應答 (response)。主要是由於不一樣的 TG 標準品會有不一樣的物質特性，如折射率、黏度、熔 點與揮發性，造成管柱沖提物經噴霧器噴霧後產生不一樣大小的樣品小滴(droplets)。這不 同大小的樣品小滴，將會散射(scatter)不同的光線量到 ELSD 的 photodetector 上，造成不一 樣的應答(response)。所以每一個被偵測物，都要有各別的標準品檢量線。圖 4-9 到 4-14 為

mv

peak 1 為 Tripalmitin (PPP), peak 2 為 1,3-dipalmitoyl-2- oleoyl - glycerol (POP), peak 3 為 1,2-dipalmitoyl-3-oleoyl-glycerol (PPO), peak 4 為 1,3-dioleoyl-2-palmitoyl-glycerol (OPO), peak 5 為 1,2- dioleoyl-3-palmitoyl-glycerol (OOP), peak 6 為 Triolein (OOO)。

mv

20.0 20.5 21.0 21.5 22.0 22.5 23.0 23.5 24.0

0

圖 4-9 Tripalmitin (PPP)之檢量線

圖 4-10 Triolein (OOO)之檢量線

Linear Regression for Data PPP:

Y =1 02956 +1 25793 * X

0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4

2.0 2.5 3.0 3.5 4.0

Log area (mv*s)

Log amount (mg/L)

Linear Regression for Data OOO:

Y = 1.14749 + 1.17615 * X R=0.99775

0 . 6 0 . 8 1 . 0 1 . 2 1 . 4 1 . 6 1 . 8 2 . 0 2 . 2 2 . 4

2 . 0 2 . 2 2 . 4 2 . 6 2 . 8 3 . 0 3 . 2 3 . 4 3 . 6 3 . 8 4 . 0

Log area (mv*s)

L o g a m o u n t ( m g / L )

圖 4-11 1,3-dipalmitoyl-2-oleoyl-glycerol (POP)之檢量線

圖 4-12 1,2-dipalmitoyl-3-oleoyl-glycerol (PPO)之檢量線

Linear Regression for Data POP:

Y = 0.45319 + 1.26938 * X R=0.99759

0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4

1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

Log area (mv*s)

Log am ount (m g/L)

Linear Regression for Data PPO:

Y = 0.6207 + 1.44453 * X R 0 99578

0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4

1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0

Log area (mv*s)

Log am ount (m g/L)

圖 4-13 1,3-dioleoyl-2-palmitoyl-glycerol (OPO)之檢量線

圖 4-14 1,2-dioleoyl-3-palmitoyl-glycerol (OOP)之檢量線

Linear Regression for Data OPO:

Y = 0.54614 + 1.33721 * X R=0.99948

0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4

1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0

Log area (mv*s)

Log am ount (m g/L)

Linear Regression for Data OOP:

Y =1.16442 + 1.12684 * X R=0.99892

0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4

1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8

Log area (mv*s)

Log am ount (mg/L)

表 4-7 HPLC 分析酸解反應產物^a中三酸甘油酯^b組成經檢量線換算後之重量百分比與莫耳 百分比

酸解產物 TG 組成 wt% mol%^c

PPP 1.93±1.12 2.04±1.19

PPO 13.24±1.10 13.59±1.11

OPO 74.57±3.15 74.26±3.21

OOP 6.42±0.34 6.39±0.33

OOO 3.85±0.59 3.72±0.57

a 在正己烷中，以 Lipozyme IM 脂解酵素催化三棕櫚酸甘油酯與油酸之酸解反應，反應條件：三棕櫚 酸甘油酯對油酸的莫耳比為 1:8，酵素量 20 mg，反應溶液體積 3 mL，三棕櫚酸甘油酯濃度 0.1 mmol，

操作溫度 50℃及反應 24 h。

b 為酸解反應產物經 TLC 片分離純化後之三酸甘油酯。

C 為各組成 TG 重除以其分子量，再換算為莫耳百分比。