行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
以棕櫚油為原料合成結構脂質 OPO 之研究(2/2)
計畫類別： 個別型計畫
計畫編號： NSC94-2214-E-011-004-
執行期間： 94 年 08 月 01 日至 95 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣科技大學化學工程系
計畫主持人： 朱義旭
報告類型： 完整報告
報告附件： 出席國際會議研究心得報告及發表論文 處理方式： 本計畫可公開查詢
中 華 民 國 95 年 8 月 1 日
中文摘要
人類母乳脂肪中含有 20-25%的棕櫚酸(C16:0)以及 30-35%的油酸(C18:1)，其中大約 70% 的 棕 櫚 酸 鍵 結 在 三 酸 甘 油 酯 的 第 二 個 位 置 上 。 嬰 兒 食 品 中 主 要 的 結 構 脂 質 為 1,3-dioleoyl-2-palmitoyl- glycerol(OPO)。本研究以三個步驟合成結構脂質 OPO，(一)將棕櫚 酸與甘油以 Lipozyme IM 催化進行酯化反應，可得到酯化程度 98.8%，產物甘油酯中三酸 甘油酯含量為 98.62%。經矽膠管柱純化後，可得 100%的三酸甘油酯，其脂肪酸組成 99%
為棕櫚酸。(二)從橄欖油為原料經兩階段低溫溶劑結晶法，可將橄欖油脂肪酸中油酸由原來 之 76.76%提昇至 96.64%，總回收率達 72.84%。(三)將上述三棕櫚酸甘油酯與油酸以 Lipozyme IM 催化進行酸解反應以合成結構脂質 OPO，在產物甘油酯中油酸之含量可達 66.07 mol%，三酸甘油酯佔 97.12%，結構脂質 OPO 在酸解產物三酸甘油酯中佔 74.26 mol%。
關鍵詞：母乳脂肪、棕櫚油、棕櫚酸、油酸、濃縮、結構脂質
Abstract
Human milk fat contains 20-25% palmitic acid (C16:0), 30-35% oleic acid (C18:1) and about 70% of the palmitic acid is esterified to the sn-2 position of triacylglycerols. An important structured lipid in infant formula is 1,3-dioleoyl-2-palmitoyl-glycerol (OPO). The object of this study is to synthesize structured lipid OPO. Firstly, esterification of palmitic acid and glycerol catalyzed by Lipozyme IM, gave 98.8% degree of esterification with a triacylglycerol content of 98.62% in the product. Separation of the reaction mixture by silica gel column chromatography gave 100% triacylglycerol which contained 99% palmitic acid. Secondly, the purification of oleic acid from olive oil by two-stage low temperature solvent crystallization, oleic acid content in olive oil-fatty acid can be raised from 76.76% to 96.64% with a overall recovery of 72.84%.
Finally, the resulting tripalmitin and oleic acid were employed as substrate in the acidolysis reaction catalyzed by Lipozyme IM for producing structured lipid OPO. The reaction product contains 97.12% TG with 66.07 mol% oleic acid in the fatty acid composition of acylglycerols.
The mole percentage of OPO in TG of the reaction product is 74.26.
Keywords：Human milk fat, Palm oil, Palmitic acid, Oleic acid, Enrichment, Structured lipid.
目錄
中文摘要……… I 英文摘要……… II 目錄……… III 圖索引……… V 表索引……… VI
第一章 前言……….. 1
1.1 生物技術之應用………. 1
1.2 酵素催化作用的優點………. 1
1.3 酵素固定化的優點………. 2
1.4 脂解酵素之專一性……….. 2
1.5 酵素催化油脂之反應………. 2
1.6 脂質之重要性……….. 3
1.7 脂肪酸的分類及構造……….. 4
1.8 結構脂質……….. 5
1.9 油脂在嬰兒營養上的重要性………. 5
1.10 油脂的消化與吸收………. 5
1.11 母乳中的脂肪組成……… 6
1.12 結構脂質 1,3-dioleoyl-2-palmitoyl-glycerol (OPO)………. 6
1.13 內容簡介……… 7
第二章 文獻回顧……… 8
2.1 三棕櫚酸甘油酯的合成……… 8
2.1.1 化學法合成三酸甘油酯(TG)………. 8
2.1.2 脂解酵素催化合成 TG 的反應……….. 8
2.1.3 有機溶劑對脂解酵素甘油酯化反應的影響………. 8
2.1.4 無溶劑系統對脂解酵素甘油酯化反應的影響 2.2 油酸的濃縮……….. 9
2.2.1 橄欖油簡介………. 9
2.2.2 橄欖油的分級與差別………. 9
2.2.3 低溫溶劑結晶法………. 10
2.3 結構脂質的合成……….. 11
2.3.1 結構脂質的合成方式………. 11
2.3.2 脂解酵素催化合成結構脂質………. 11
第三章 實驗藥品、設備與方法……… 13
3.1 實驗藥品……….. 13
3.2 儀器及設備……….. 14
3.3 實驗方法……….. 14
3.3.1 三棕櫚酸甘油酯的合成………. 14
3.3.1.1 棕櫚酸與甘油之酯化反應……….. 14
3.3.1.2 以薄層火燄離子分析儀分析產物中甘油酯組成………. 15
3.3.1.3 以矽膠充填管柱分離甘油酯混合物………... 15
3.3.2 油酸的濃縮……… 15
3.3.2.1 橄欖油的皂化………... 15
3.3.2.2 氣相層析儀(GC)的分析條件……… 15
3.3.2.3 一階段低溫溶劑結晶法濃縮油酸之步驟……… 16
3.3.2.4 兩階段低溫溶劑結晶法濃縮油酸之步驟………... 16
3.3.3 酸解反應……… 16
3.3.3.1 基質莫耳比對反應的影響………... 16
3.3.3.2 其他因素對酸解反應的影響……… 16
3.3.3.3 酸解產物三酸甘油酯的 sn-2 位置組成分析……….. 17
3.3.4 以HPLC-ELSD分析酸解產物三酸甘油酯中OPO含量……….. 17
3.3.5 酵素活性的測定……… 18
笫四章 結果與討論………. 20
4.1 酵素之活性……… 20
4.2 三棕櫚酸甘油酯的合成……… 20
4.3 酸解反應之基質(三棕櫚酸甘油酯)製備……….. 20
4.4 橄欖油脂肪酸之組成……… 21
4.5 一階段低溫溶劑結晶法濃縮油酸……… 21
4.6 二階段低溫溶劑結晶法濃縮油酸……… 22
4.7 酸解反應……… 23
4.7.1 基質莫耳比對酸解反應的影響……… 23
4.7.2 酵素量對酸解反應的影響……… 24
4.7.3 溫度對酸解反應的影響……… 25
4.7.4 三棕櫚酸甘油酯濃度對酸解反應的影響……… 25
4.7.5 含水量對酸解反應的影響……… 26
4.8 酸解產物三酸甘油酯的 sn-2 位置組成分析……… 27
4.9 以HPLC-ELSD分析酸解產物三酸甘油酯中OPO含量……….. 28
4.10 ChromSpher Lipids HPLC (銀離子)管柱的清洗與再生……… 33
笫五章 結論………. 35
參考文獻………. 36
計劃成果自評………. 40
可供推廣之研發成果資料表………. 41
圖索引
圖 1-1 脂質生物技術的主要領域……..………..….. 1
圖 1-2 脂解酵素催化的主要油脂修飾反應……….. 4
圖 4-1 以 Lipozyme IM 及 Novozym 435 脂解酵素催化棕櫚酸與甘油之酯化反應， 酯化程度及 TG 含量之變化……….. 20
圖 4-2 在正己烷中，以 Lipozyme IM 脂解酵素催化三棕櫚酸甘油酯與油酸之酸 解反應時，基質莫耳比對產物甘油酯脂肪酸組成中油酸含量之影響…………. 24
圖 4-3 在正己烷中，以 Lipozyme IM 脂解酵素催化三棕櫚酸甘油酯與油酸之酸 解反應時，酵素量對產物甘油酯脂肪酸組成中油酸含量之影響………. 25
圖 4-4 在正己烷中，以 Lipozyme IM 脂解酵素催化三棕櫚酸甘油酯與油酸之酸 解反應時，溫度對產物甘油酯脂肪酸組成中油酸含量之影響………. 26
圖 4-5 在正己烷中，以 Lipozyme IM 脂解酵素催化三棕櫚酸甘油酯與油酸之酸 解反應時，基質濃度對產物甘油酯脂肪酸組成中油酸含量之影響………. 26
圖 4-6 在正己烷中，以 Lipozyme IM 脂解酵素催化三棕櫚酸甘油酯與油酸之酸 解反應時，含水量對產物甘油酯脂肪酸組成中油酸含量之影響………. 27
圖 4-7 為以銀離子 HPLC 管柱分析三酸甘油酯標準品之圖譜………. 29
圖 4-8:(A)為酸解產物三酸甘油酯的分析圖譜，(B)為圖(A)之局部放大圖………. 29
圖 4-9 Tripalmitin (PPP)之檢量線………. 30
圖 4-10 Triolein (OOO)之檢量線……….. 30
圖 4-11 1,3-dipalmitoyl-2-oleoyl-glycerol (POP)之檢量線……….. 31
圖 4-12 1,2-dipalmitoyl-3-oleoyl-glycerol (PPO)之檢量線……….. 31
圖 4-13 1,3-dioleoyl-2-palmitoyl-glycerol (OPO)之檢量線………. 32
圖 4-14 1,2-dioleoyl-3-palmitoyl-glycerol (OOP)之檢量線………. 32
圖 4-15 ChromSpher Lipids HPLC 管柱效能測試圖………... 34
表索引
表 1-1 脂解酵素分類與來源……….. 3
表 1-2 母乳脂肪的脂肪酸組成與分佈………. 6
表 2-1 食用油的脂肪酸組成………. 10
表 4-1 橄欖油皂化所得 FFA 中各組成脂肪酸之含量……… 21
表 4-2 以丙酮為溶劑進行低溫溶劑結晶時，溶劑量對液相中油酸含量及回收 率之影響………. 22
表 4-3 以丙酮為溶劑經低溫結晶法處理後產物之組成………. 22
表 4-4 以氰化甲烷為溶劑進行第二階段低溫溶劑結晶法時，溶劑量對液相中 油酸含量及回收率之影響……… 23
表 4-5 以氰化甲烷為溶劑經第二階段低溫結晶法處理後產物之組成……… 23
表 4-6 酸解反應產物a三酸甘油酯及 sn-2 位置之 FFA 組成………... 28
表 4-7 HPLC 分析酸解反應產物a中三酸甘油酯b組成經檢量線換算後之重量 百分比與莫耳百分比……… 33
第一章 前言
1.1 生物技術之應用
生物技術所涵蓋的廣大範圍中，就科技層面的定義而言，可以區分廣義與狹義的生物 技術；廣義的生物技術是總合微生物學、動物學、植物學乃至工程學等科學而成的技術部 門；而狹義的生物技術，指的是新發展的關鍵技術，例如：遺傳工程技術，蛋白質工程技 術等。在著重環境保護、節約能源及開發新資源的今天，生物技術的發展更見其重要性(田，
1998)。生物技術可應用於食品、農業、醫藥、化工、能源及環保等相關產業方面。如圖 1-1 所示脂質生物技術涵蓋了改變油脂脂肪酸或脂質組成及含量之基因工程轉殖技術、在油脂 加工過程中以酵素修飾油脂組成或特性以改善油脂品質及利用微生物生產油脂或進行油脂 生物轉化反應。
圖 1-1 脂質生物技術的主要領域 (Mukherjee et al., 1998)
1.2 酵素催化作用的優點
酵素為可降低化學反應活化能功用之蛋白質，具有催化化學反應之作用。在 37℃下，
利用過氧化氫酵素(Peroxidase)催化過氧化氫之分解反應，其速率約為用鉑(Platinum)當催化 劑的 107倍；而於常溫常壓下，其催化速率更為一般無機觸媒之 108或 1011倍(侯，1993)。
酵素在低溫下具有相當大的催化效果，此點在食品加工應用上非常重要，因為可在較 低溫下，利用酵素來進行食品的加工製造，而不至於破壞食品的品質。以酵素方法修飾油 脂的優點可歸納出(Haraldsson et al., 1997)：
1. 反應效果佳，若為固定化酵素，又具重覆使用之優點。
2. 利用酵素之專一性，可針對不同產品需求而選擇不同酵素。
3. 反應條件溫和，可在常溫、常壓或中性 pH 值下操作，不但可節約能源更能預防多元不 飽和脂肪酸的氧化變質，若以傳統化學方法，則必須於高溫、高壓或固定 pH 值下才可 進行反應，極可能造成反應物被氧化分解、順式-反式同分異構化或雙鍵轉移甚至產生聚 合。
4. 可避免副產物形成，減少純化處理程序。
也由於酵素反應的高選擇性，因此可以提高產物濃度，近年來學術界與產業界均廣泛 地研究酵素反應及其應用，而在食品、醫藥、清潔劑、環保、農業之應用上均有很大的發 展，尤其當前環保意識高漲及回歸自然的潮流下，酵素的應用將更為重要。
1.3 酵素固定化的優點
酵素固定化之廣泛定義包含酵素、菌體(或微生物)的固定化。酵素在反應系統中可以用 游離態(Free)或固定化之形式使用，因為固定化酵素除比一般可溶性酵素具較高的酵素穩定 性外，尚具有以下幾個優點 (Coteron et al., 1998)：
1. 在溫和的反應條件下仍可具有極高的催化活性。
2. 酵素顯示較高的選擇性，降低副反應，進而提高產品純度。
3. 易於自反應基質中回收，且可重覆使用。
4. 不會污染最終產物，節省純化步驟時所需成本。
另外，固定化酵素亦可增加酵素對酸鹼值與熱的穩定性 (Malcata et al., 1992)，且便於 反應中進行自動化控制與連續式操作(陳國誠，1989)。由於以上優點，酵素固定化技術自 1960 年以來已被廣泛的研究。
1.4 脂解酵素之專一性
脂解酵素(E. C. 3.1.1.3)根據其專一性可以區分成下列五種，如表 1-1(江，1999)所示:
1. 具受質專一性:此類酵素僅對特殊的甘油酯作用。例如:三酸甘油酯是大部分脂解酵素最 常使用的受質;但來自於老鼠脂肪組織的脂解酵素卻僅對單酸甘油酯具有專一性。
2. 區域位置專一性:此類酵素能分辨三酸甘油酯骨幹上第二位置和外側第一及第三位置兩 個區域之能力。1,3-位置特異性脂解酵素，此類酵素僅切除或結合甘油酯上第一及第三 位置之酯鍵，是很廣泛使用的一類，如猪胰臟脂解酵素，還有 Aspergillus niger 和 Rhizopus arrhizus 之脂解酵素均屬於此類。
3. 非 專 一 性 : 此 類 酵 素 對 甘 油 酯 醯 基 的 位 置 或 特 殊 脂 肪 醯 基 無 選 擇 性，因此可切除或結合任意位置之酯鍵。如來自於 Penicillium expansum 和 Aspergillus sp.
之脂解酵素均屬於此類。
4. 脂肪酸特異性:此類酵素僅對特別的脂肪酸作用，大部分源自微生物的脂解酵素皆無此特 性，但 Geotrichum candidum之脂解酵素僅能與甘油酯上在第九位置有一順式雙鍵的長 鏈脂肪酸作用，對於飽和脂肪酸或第九位置無雙鍵的脂肪酸則無作用(Macrae, 1983)。
5. 對立體位置具專一性:此類酵素具有分辨三酸甘油酯上 sn-1 和 sn-3 位置的能力。
1.5 酵素催化油脂之反應
酯交換反應一詞包括了反應間醯基轉移的三種反應: (1)酯類與脂肪酸之酸解反應
(Acidolysis) ； (2) 酯 類 與 醇 類 之 醇 解 反 應 (Alcoholysis) ； (3) 相 異 酯 類 之 酯 交 換 反 應 (Interesterification)。酯交換反應由於化學平衡的問題，必須在低水量下操作以提高產率。
由於基質多為疏水性的有機物，使用有機溶劑當作介質可增加基質之溶解度。已有不少研
表 1-1 脂解酵素分類與來源(Villeneuve and Foglia, 1997)
究嘗試藉脂解酵素催化酯交換反應以改變油脂的組成，進而改變其性質以提高其經濟價值。
現行油脂工業中，為獲得較具經濟價值之油脂，大多將天然油脂經化學觸媒(如鹼金屬 或 Alcoholate)催化，進行酯交換反應(Konishi et al., 1993)。然而這些化學觸媒在進行油脂中 之醯基交換時，係以任意方式進行，即在交換醯基之位置不具特異性；因此酯交換後產生 之油脂，其組成較複雜，造成產物分離的困難。若能以酵素催化反應，即可利用酵素之特 異性獲得所要的脂質，因而提高產物的純度，降低分離成本。因反應可在常溫常壓等較溫 和的條件下進行，減少能源及材料的花費，相較於傳統之化學方法，酵素方法對環境的負 擔較低 (Forssell et al., 1993)。脂解酵素催化的主要油脂修飾反應，如圖 1-2 所示。
1.6 脂質之重要性
脂質(Lipid)在細胞正常功能上，扮演極重要之角色，除了提供各種代謝反應所需能量 外，某些脂質亦為細胞膜之重要成份，脂質之功能可歸納如下(王，1996)：
1. 供給及儲備能量：脂質為人體能量之主要來源，每公克脂質可提供 9 大卡的熱量，並可 直接或間接被利用，過剩的脂肪則被儲存於脂肪組織(Adipose Tissue)中，當攝取的熱量不 足時，即可立即補充。
2. 提供必需脂肪酸：脂質中含各種必需脂肪酸，無法由體內自行合成，而必須經由食物攝 取。
3. 參與代謝作用：脂質直接或間接參與許多代謝作用。
4. 作為細胞架構的成份：脂質與蛋白質合成脂蛋白(Lipoprotein)為細胞內各種膜的成份，一 些脂質亦為消化道分泌液、激素及神經周邊等組織的組成分。
圖 1-2 脂解酵素催化的主要油脂修飾反應(Villeneuve and Foglia, 1997)
5. 合成激素：如花生四烯酸為前列腺素(Prostaglandins)及白三烯素(Leukotrienes)的前驅物。
6. 保護及絕緣作用：儲存在皮下脂肪層的脂肪，具絕緣作用，可防止體溫迅速發散，維 持正常體溫。而在體內各器官與神經組織四周的脂肪，負責保謢器
官及神經不受外界的震動或撞擊傷害。
7. 攜帶脂溶性維生素：維生素 A、D、E、K 為脂溶性，須先溶解於脂肪才能被吸收。
在食物中之脂質約 95%為三酸甘油酯(Triacylglycerol, TG)。其結構包括 3 個碳原子為 中心的甘油(Glycerol)分子，及 3 個分別接在碳原子羥基上之脂肪酸。而 TG 分子中脂肪酸 的碳數、飽和程度及分子結構等都會影響脂質之特性與對人體的生理功能。
1.7 脂肪酸的分類及構造
脂肪酸(Fatty acid, FA)為一個羧基(Carboxyl Group)及一個偶數碳鏈所組成，在食物脂肪 中存在之脂肪酸多屬於直鏈化合物。脂肪酸依碳鏈長度不同可分為 6 個或 6 個以下碳原子 之短鏈脂肪酸(Short Chain Fatty Acids, SCFA)，8-12 個碳原子之中鏈脂肪酸(Medium Chain Fatty Acids, MCFA)及 14 個或 14 個以上碳原子之長鏈脂肪酸(Long Chain Fatty Acids, LCFA)。脂肪酸也可依飽和度(Degree of Saturation)不同而區分成飽和脂肪酸(Saturated Fatty Acid)及不飽和脂肪酸。飽和脂肪酸上的碳原子皆以單鍵結合；不飽和脂肪酸則可細分為含 一個雙鍵之單元不飽和脂肪酸(Monounsaturated Fatty Acid)及含二個或二個以上雙鍵之多元 不飽和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acid, PUFA)。
脂肪酸可簡單表示成(x：y n-z)：其中 x 表示碳原子數目，y 表示雙鍵數，z 表示由甲基
端算起第一個出現雙鍵的碳原子數目。在人體中的兩大必需脂肪酸為 n-3 系脂肪酸與 n-6 系脂肪酸。常見 n-3 及 n-6 必需脂肪酸有：γ-亞麻油酸(γ-Linolenic Acid；C18:3 n-6；GLA)、
α-亞麻油酸(α- Linolenic Acid；C18:3 n-3；ALA)、亞油酸(Linoleic Acid；C18:2 n-6；LA)、
花生四烯酸(Arachidonic Acid；C20:4 n-6；AA)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid；C20:5 n-3；EPA)、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid；C22:6 n-3；DHA)。
1.8 結構脂質
1.8.1 結構脂質之定義及應用
結構脂質(Structured Lipids, SL)為經由化學或酵素催化反應以改變 TG 分子上脂肪酸組 成或立體位置所得之脂質。脂質可針對營養上的需求而修飾，應用範圍包括：醫藥治療、
營養、低熱量食物等。
1.8.2 酵素法合成結構脂質
江(1999)指出以脂解酵素催化合成 SL 比傳統化學合成方法具有下列主要優勢：(1)反 應條件溫和可降低能量的消耗，(2)避免不必要或有害副產物的形成，可免除純化的步驟，
(3)可選擇性的應用不同脂解酵素所具有的專一性以開發特殊或新的油脂衍生產品。
1.9 油脂在嬰兒營養上的重要性
我們人類或動物在出生後的嬰兒時期，若以所含熱量來比較的話，食用最多的營養素 是油脂。無論是母奶或牛奶，若沒有另外加入糖或穀粉的話，由油脂供給的熱量約佔總熱 量的一半。雖然奶的油脂含量那麼高，我們食用奶時並不覺得油膩，主要是因為奶油以乳 化狀態存在，即成為微小的脂肪球。奶是母親準備給六個月以內嬰兒的理想食品，由此可 推想油脂在營養上的重要性。
嬰兒身體小，生理機能尚未成熟，但為了達到正常的生長發育，每公斤體重的熱量需 求卻是成人的二倍以上，若主要以醣類及蛋白質供應所需能量的話，每公克只能供給四大 卡的熱量，所以食量必須相當大，對消化機能尚差的嬰兒來說是一項不小的負擔。油脂能 供應蛋白質或醣類二倍以上的熱量即每公克九大卡，所以食物中油脂含量高的話，則可減 少食物的體積，而減小胃的負擔。
1.10 油脂的消化與吸收
正常人油脂的消化吸收率(約 95%)是比植物性蛋白質的消化吸收率(約 90%)高。因為唾 液不含脂解酶，所以油脂在口腔內不消化。胃液含有在弱酸性(pH 5)作用的脂解酶，但成人 的胃液酸度較強(pH 1-2)，故幾乎不作用;嬰兒的胃液是弱酸性(pH 4.5-5)，且奶中脂肪已乳 化，故部分奶油在胃中就會被分解。
胃中食物送入十二指腸後，被鹼性的胰液，腸液中和，隨著進行油脂的乳化，即與肝 臟分泌出來的膽汁中所含的膽汁鹽均勻混合成細小的脂肪球。在十二指腸及空腸前半部 份，脂肪小球接受活性較強的胰脂解酶的作用，將接在甘油兩端(sn-1,3 位置)的脂肪酸水 解，使兩分子的脂肪酸游離出來，剩下 2-單酸甘油酯。接在甘油 sn-2 位置的脂肪酸不易被 脂解酶水解，因此 2-單酸甘油酯約有三分之二不再分解就被吸收，其餘的三分之一轉變為 1-單酸甘油酯後除一小部分直接被吸收外，其餘的再進一步被腸液中的脂解酶分解成為游
離脂肪酸及甘油再被吸收。被吸收進入小腸黏膜上皮細胞的脂肪酸及單酸甘油酯等，先合 成三酸甘油酯，再與蛋白質、膽固醇及磷脂等結合成為乳糜微粒，送入淋巴系統經胸管再 送到血液中，後來傳達到肝臟參與新陳代謝。
1.11 母乳中的脂肪組成
自有人類以來，即靠哺餵母乳來養育新生兒，母乳遠優於其他任何嬰兒食品，是生物 界中最自然、最適合嬰兒的食物。然而，有些母親無法親自哺育母乳，遠在西元前兩千年 就有母乳替代品產生，直到十九世紀末，開始有醫師參與製造比較科學化的母乳替代品。
母乳是嬰兒營養及能量的主要來源，約佔全部的50-60%。母乳的組成範圍很廣，除了 和種族、血統有關外，母親的飲食也是重要影響因素之一(Jensen, 1998; Clark and Hundrieser, 1993)。在人類母乳脂肪中97-99%是三酸甘油酯也是母乳中的主要能量產生成分，人類母乳 脂肪約含20-25%的棕櫚酸(C16:0)以及30-35%的油酸(C18:1)，其中大約70%之棕櫚酸鍵結在 三酸甘油酯的sn-2位置上(Martin et al., 1993)，而sn-1,3位置主要是不飽和脂肪酸(Schmid et al., 1998)，此種結構對三酸甘油酯是很重要的，因為三酸甘油酯是直接與分解脂肪的酵素 作用而不是以脂肪酸的型式(De Fouw et al., 1994; Lien, 1994; Lien et al., 1997; Summers et al., 1998)。另外，嬰兒食品中主要的結構脂質為1,3-dioleoyl-2-palmitoyl-glycerol (OPO) (Nagao et al., 2001)，而本篇論文研究目的即在利用1,3-位置特異性脂解酵素進行酸解反應合 成此種結構脂質。母乳脂肪的脂肪酸組成與分佈如表1-2所示。
表 1-2 母乳脂肪的脂肪酸組成與分佈 (Lien et al., 1997) Fatty acidb Total sn-2 %sn-2c sn-1,3d C12:0 4.9 5.3 36.0 4.7
C14:0 6.6 11.2 57.0 4.3
C16:0 21.8 44.8 68.0 10.3
C18:0 8.0 1.2 5.0 11.4
C18:1n-9 33.9 9.2 9.0 46.3
C18:2n-6 13.2 7.1 18.0 16.3
C18:3n-3 1.2 _ _ _
a Values are derived from Lien et al. (1997).
b C12:0, lauric; C14:0, myristic; C16:0, palmitic; C18:0, stearic;
C18:1n-9, oleic; C18:2n-6, linoleic and C18:3n-3, linolenic acids.
c Indicates the percentage of the fatty acids esterified at the sn-2 position, calculated as 【sn-2 fatty acids×100% /
（3×Total fatty acids）】.
d Indicates fatty acid composition at the sn-1,3 positions, calculated as 【3×Total－（sn-2）】/2.
1.12 結構脂質 1,3-dioleoyl-2-palmitoyl-glycerol (OPO)
母乳脂肪吸收優於配方奶可歸因於母乳中 TG 獨特的立體結構。
Carnielli et al. (1995)比較二種配方奶對早產兒脂肪吸收與礦物質平衡之影響；以人工 合成乳脂肪中之 TG，β配方為模擬母乳 TG 中棕櫚酸含量及酯化位置(sn-2)，α配方 類似市面配方奶，棕櫚酸酯化在 sn-1、sn-3 位置，實驗採隨機雙盲、交叉設計，結果
接受β配方早產兒糞便排出較少飽和脂肪酸(14:0、16:0、18:0)，脂肪吸收率較佳，鈣 吸收及鈣保留率均優於α配方，結論：TG 結構類似母乳之配方，可有效改善小腸脂 肪酸吸收與礦物質平衡。反之，若嬰兒食品中的棕櫚酸存在於三酸甘油酯的 sn-1,3 位 置，經由胃和胰臟脂解酵素消化作用後釋放出來形成鈣鹽或鎂鹽，會造成嬰兒消化吸 收不良。
1.13 內容簡介
本研究以酸解反應合成 1,3-dioleoyl-2-palmitoyl-glycerol(OPO)型式的 SL。內容主要分 成三個步驟，(一)以 Lipozyme IM 固定化脂解酵素，催化棕櫚酸與甘油之酯化反應，目的在 得到酸解反應之基質三棕櫚酸甘油酯。(二)因為各種食用油中以橄欖油含有最高量的油酸 (約佔 70-80%)，所以選擇自橄欖油中濃縮油酸，先將橄欖油皂化得到游離脂肪酸(Free Fatty Acid, FFA)，再以低溫溶劑結晶法進行濃縮。(三)以上述所得之三棕櫚酸甘油酯與油酸，在 正己烷中利用 1,3-位置特異性脂解酵素催化進行酸解反應，以得到所要的結構脂質 1,3-dioleoyl-2-palmitoyl-glycerol(OPO)。
第二章 文獻回顧
2.1 三棕櫚酸甘油酯的合成
2.1.1 化學法合成三酸甘油酯(TG)
Wheeler et al. (1940)以 p-Toluenesulfonic Acid 所催化的酯化反應，有效地合成含單元 不飽和脂肪酸的 TG，此法會有少量的異構化副產物生成。Mattson and Volpenhein (1962)以 脂肪酸氯化物與甘油反應來合成甘油酯，沒有異構化副產物產生，但缺點是總產率只有 60-70%，且未反應的脂肪酸不易回收。Adlof and Emken (1984)以甲醇鈉(Sodium Methoxide) 於 65℃下催化三醋酸甘油酯(Triacetin)與脂肪酸的甲基酯進行轉酯化反應，以合成含 PUFA 的 TG；此法的產物含有脂肪酸甲基酯、TG 及微量的二酸甘油酯，不易以一般方法如液- 液萃取法或矽膠層析法(Silica Gel Chromatography)來純化產物，需以含銀離子的層析管柱 (Silver Resin Chromatography)方能分離得到所要的 TG。
工業上合成 TG 是以 FFA 與甘油做為基質，於高溫高壓下反應，此方法需要多個純化 步驟(Captex, 1986)，且反應的溫度高，僅適合用來合成含飽和脂肪酸的 TG，例如 MCT (Medium Chain Triglycerides)，不適合於含 PUFA 的 TG 之合成。
2.1.2 脂解酵素催化合成 TG 的反應
通常以脂解酵素催化合成甘油酯，多是以甘油與 FFA 做為基質，以進行酯化反應。例 如，Li and Ward (1993)以由皂化鱈魚肝油濃縮所得富含 n-3 PUFA 的 FFA 與甘油做為基質，
在有機溶劑中以八種脂解酵素催化反應，藉以合成富含 n-3 PUFA 的甘油酯。Medina et al.
(1999)則以 Novozym 435 催化由魚油與海藻油所得之富含 PUFA 的 FFA 與甘油進行酯化反 應以合成 TG。
2.1.3 有機溶劑對脂解酵素甘油酯化反應的影響
Li and Ward (1993)比較八種不同來源的脂解酵素，在有機溶劑中催化 n-3 PUFA 濃縮液 與甘油進行酯化反應的活性；結果顯示 PS 30 (從 Pseudomonas sp.得到, Amono 公司生產) 和 Lipozyme IM 有較高的酯化活性，溶劑則以正己烷及異辛烷效果最好。
Cerdán et al. (1998)以 n-3 PUFA 濃縮液與甘油在正己烷中進行酯化反應合成 TG，比較 Novozym 435、Lipozyme IM 及 PS-30 等三種脂解酵素的酯化能力，結果發現不論是酯化程 度或 TG 產率，Novozym 435 都有最好的效果。他們並指出 Log P 值較高的溶劑如正己烷與 異辛烷反應性較高，其中又以使用正己烷可得到最高的 TG 產率。
Medina et al. (1999)以脂解酵素 Novozym 435 在正己烷中催化由魚油或海藻油所得的 PUFA 濃縮液與甘油進行酯化反應，以合成 TG。在最適的條件下，從鱈魚肝油得到的 PUFA 濃縮液之反應可得 93.5%的 TG 產率，酯化程度則為 95.7%；從海藻油 Phaeodactylum tricornutum 得到的 PUFA 濃縮液之反應可得 96.5%的 TG 產率， 酯化程度有 98.3%；從 Porphyridium cruentum 得到的 PUFA 濃縮液的反應可得 89.3%的 TG 產率，酯化程度有 99.4%。
Janssen et al. (1993)探討在有機溶劑中，以脂解酵素催化 FFA 與甘油進行酯化反應合成 甘油酯時，脂肪酸鏈長及溶劑極性對產物中甘油酯組成的影響。他們指出在極性溶劑中反
應，對單酸甘油酯的產生速率有利，且在有溶劑的系統中反應，飽和及不飽和的 C18 脂肪 酸會有相同的平衡位置。故對於合成 TG 而言，疏水性有機溶劑如正己烷會是較理想的反 應溶劑。
2.1.4 無溶劑系統對脂解酵素甘油酯化反應的影響
Selmi et al. (1998)在無溶劑的系統下，以 FFA 與甘油在 Lipozyme IM 的催化下合成 TG。此反應對於飽和脂肪酸(C10:0-C18:0)及單元不飽和脂肪酸如油酸(C18:1)而言，可得到 高的酯化程度及 TG 產率，但對於較高不飽和度的脂肪酸如 C18:2，由於酯化速率慢，導致 FFA 的酯化程度偏低。他們指出脂肪酸的不飽和度愈高，則酯化速率愈慢，TG 產率也愈低。
Kawashima et al. (2001)在無溶劑與低壓(15 mm-Hg)的系統下，以 PUFA 與甘油在 Novozym 435 的催化下合成 TG。此反應對 GLA, AA, EPA 及 DHA 而言，皆可得到高的酯 化程度及 TG 產率。他們並指出 Novozym 435 對上述 PUFA 有較強的作用力。
綜合以上所述，本研究選擇以甘油與棕櫚酸在無溶劑系統中反應，利用真空幫浦去除 水來合成三棕櫚酸甘油酯，探討酵素(Lipozyme IM 與 Novozym 435)對酯化反應的影響。
2.2 油酸的濃縮
天然油脂的脂肪酸組成複雜，不易以甘油酯的型態進行濃縮而提高其中 FFA 的含量。
通常先將油脂皂化，以得到 FFA 或 FFA 的甲基酯或乙基酯，再加以濃縮以提高其中脂肪酸 的含量。
2.2.1 橄欖油簡介
橄欖油成分中的單元不飽和脂肪酸比例約 70-80%，是各種食用油當中最高的，而且 富含維他命 A、D、E、K 等營養，對於消化的功能也有幫助，環地中海國家的人膽固醇比 例與罹患心血管疾病的比例明顯較低，據說就是跟常食用橄欖油有關。一般而言，油脂中 的單元不飽和脂肪酸及多元不飽和脂肪酸都有助於降低心血管疾病的罹患率。前者能降低 人體中低密度脂蛋白(LDL，俗稱壞的膽固醇)，且不會破壞對人體有益處的高密度脂蛋白 (HDL，俗稱好的膽固醇)，如表 2-1 所示油品中富含單元不飽和脂肪酸的以橄欖油為代表；
多元不飽和脂肪酸則可降低人體血液中的膽固醇，而以玉米油、大豆油及葵花油等含量豐 富。所以本研究選擇以橄欖油為原料，經皂化後再進行低溫溶劑結晶，以得到酸解反應所 需的油酸。
2.2.2 橄欖油的分級與差別
根據歐盟及國際橄欖油協會的規定，市售橄欖油可分為以下四等級：Extra Virgin 特級 橄欖油、Virgin 橄欖原油、Pure 一般純橄欖油、橄欖渣油，其中最大的差別在於酸度，Extra Virgin 特級橄欖油酸度在百分之一以下，Virgin 橄欖原油酸度在百分之一至百分之二之間，
Pure 一般純橄欖油則是以酸度百分之三的原油再調和特級橄欖油而成。
橄欖果實經採收、清洗、壓榨，再以離心方式將油、水分開，即可得到橄欖原油，而 此原油可分三種，Extra Virgin 特級橄欖油最為天然，其次為 Virgin 橄欖原油，酸度較高的 則經精製(Refine)後再加入少許特級橄欖油添加風味而成為 Pure 一般純橄欖油，台灣市面上 銷售的主要為 Extra Virgin 特級橄欖油與 Pure 純橄欖油兩種。
表 2-1 食用油的脂肪酸組成(台灣地區食品營養成分資料庫，1998) 脂肪酸組成
食用油 不飽和
飽和 單元 多元
油酸 (C18:1)
亞油酸 (C18:2)
亞麻酸 (C18:3) 菜籽油 7.93 64.17 27.89 62.61 20.23 7.66 橄欖油 15.28 75.36 9.36 74.2 8.65 0.72 椰子油 90.19 8.11 1.69 7.98 1.69 0 大豆油 15.68 22.73 61.59 22.4 55.17 6.42 葵花油 11.83 23.28 64.89 23.28 64.89 0 玉米油 13.86 26.51 59.62 25.9 59.02 0.6 花生油 20.8 40.91 38.31 39.89 38.22 0.09 芝麻油 15.59 40.66 43.75 40.4 43.43 0.32
牛油 54.23 43.7 2.06 40.83 1.63 0.43 猪油 39.34 44.5 16.17 41.22 14.46 0.79
(wt%) (克)
克:脂肪酸總量 100 克之中的脂肪酸所佔克數。
而國際橄欖油協會對於橄欖油品質好壞還有另一分級指標可供參考，第一級為 Extra Virgin，油質是以橄欖第一次榨出，無任何添加物的橄欖油；經過二榨、三榨等級的油品，
加進 Extra Virgin 油調配的則標示為 Pure；經過五榨或五榨以上的油在製作過程中會產生毒 性副產品，有致癌的可能，因此不能成為食用油等級。但值得注意的是，植物油中的單元 不飽和脂肪酸比例越高，油質越穩定；而多元不飽和脂肪酸越高則在高溫下越容易產生氧 化作用，油質越不安定。
2.2.3 低溫溶劑結晶法
低溫溶劑結晶法(Low Temperature Solvent Crystallization)是一種古典分離脂肪酸的方 法，主要係利用脂肪酸或脂肪酸甲基酯於低溫溶劑中溶解度之差異，來濃縮特定的脂肪酸。
通常脂肪酸在極性有機溶劑中的溶解度會因碳鏈愈長則溶解度愈低，雙鍵數目愈多則溶解 度愈高(Schlenk, 1961)。此方法之結晶程序於低溫下進行，能降低脂肪酸氧化的機率，同時 具有操作簡單及溶劑容易回收重覆使用的優點。
Brown and Shinowara (1937)以丙酮做為溶劑，濃縮皂化橄欖油中的油酸。在不同的溫 度下部份結晶(Fractional Crystallization)，在-35℃的濾液中，可得到碘值(Iodine Value)為 89.71 的油酸混合物。
野口泰久(1983)利用低溫溶劑結晶法，將沙丁魚等魚油溶於丙酮中，在-80℃下攪拌過 濾結晶後，將魚油中 EPA 濃度自 12.8%提昇至 27.9%，DHA 濃度由 8.8%提昇至 15.0%，回 收率為 18%。
除了丙酮外，氰化甲烷亦常做為分離飽和及不飽和脂肪酸之溶劑，Pryde (1979)以氰化 甲烷在 31℃下將 47% C18:0 及 53% C18:1 之混合物分離成固、液相；其中固相中含 97%
C18:0 與 3% C18:1，液相含 4% C18:0 及 96% C18:1。
Chen and Ju (2001)利用低溫溶劑結晶法濃縮琉璃苣油與亞麻仁油中之 GLA，在-80℃，
丙酮-氰化甲烷混合液(70/30, v/v)與脂肪酸在 30:1 (mL:g) 之比例下，可將琉璃苣油脂肪酸中 GLA 由原來之 23.4%提昇到 88.9%，回收率達 62.0%。另外混合液與脂肪酸在 70:1 (mL:g) 之比例下，可將亞麻仁油脂肪酸中 GLA 由原來之 55.0%提昇到 85.7%，回收率 24.9%。
Chen and Ju (2002)利用兩階段低溫溶劑結晶法濃縮鯡魚油脂肪酸中 n-3 PUFAs。以氰化 甲烷當第一階段濃縮的溶劑，在氰化甲烷與脂肪酸 60:1 (mL:g)，-40℃，24 h 的條件下，可 分別將 EPA, DHA 與 n-3 PUFAs 從原來之 15.45%、9.67%與 32.63%提昇到 28.94%、18.36%
與 60.92%，且 n-3 PUFAs 回收率 90.26%。在第二階段濃縮時以丙酮-氰化甲烷混合液(70/30, v/v)與脂肪酸在 60:1 (mL:g)的比例，-80℃，24 h 之條件下，可分別再將 EPA, DHA 與 n-3 PUFAs 提昇到 33.85%、21.35%與 70.77%，且 n-3 PUFAs 回收率 89.03%，總回收率達 80.36%。
陳(2002)將棕櫚油皂化後之 FFA 以一階段低溫溶劑結晶法分離所得脂肪酸(含 69.5%油 酸)，再利用兩次低溫溶劑結晶，最後可將棕櫚油脂肪酸中油酸由原來之 42.5%提昇到 94.5%，總回收率高達 77.5%。於論文中指出以丙酮當第一階段及第二階段低溫溶劑結晶之 溶劑時，可有效的分離飽和及不飽和脂肪酸，在第三階段低溫結晶法中選用氰化甲烷為溶 劑，可有效去除亞麻油酸並可得到高的油酸回收率。
綜合前述文獻，本研究選擇以橄欖油為原料，先將橄欖油皂化再分別以丙酮、氰化甲 烷為溶劑，進行兩階段低溫溶劑結晶濃縮油酸。
2.3 結構脂質的合成 2.3.1 結構脂質的合成方式
SL可以不同的反應方式得到。例如：(1)TG與TG間的交酯化反應(Lee and Akoh, 1998)；
(2)TG與FFA間的酸解反應(Akoh and Huang, 1995)；(3)TG與FFA酯間的轉酯化反應(Huang and Akoh, 1996)。通常方法(1)雖可得到SL，但得到的產物中甘油酯的組成通常較為複雜(Lee and Akoh, 1997)，甘油酯中所希望得到的SL含量也較低，產物的分離純化也不容易。要得 到SL以方法(2)及(3)，並以具有sn-1,3位置特異性的脂解酵素做為催化劑是較可行的方法。
Bloomer et al. (1992)指出以羧酸的乙基酯(Carboxylic Acid Ethyl Ester)做為醯基捐贈 者，雖然比羧酸做為醯基捐贈者有更高的反應速率，但會導致較多的二酸甘油酯(Diglyceride, DG)生成。所以本研究選擇以油酸做為酸解反應的醯基捐贈者。
2.3.2 脂解酵素催化合成結構脂質
對於催化 TG 與 FFA 進行酸解反應以合成 SL 所使用之脂解酵素，文獻中常用的有源 自 Rhizopus delemar 與 Mucor miehei 之兩種脂解酵素。此兩種脂解酵素對甘油酯具有 sn-1 及 sn-3 之位置特異性。
Lee and Akoh (1998) 在 正 己 烷 中 以 無 特 異 性 Novozym 435 催 化 三 辛 酸 甘 油 酯
(Tricaprylin)及含 EPA 33.8%與 DHA 26.0%的 FFA 間之酸解反應，期望將 EPA 及 DHA 混入 甘油酯的 sn-2 位置。最終產物 SL 中，sn-2 位置僅含 17.8%的 EPA 及 15.0%的 DHA，表示 因使用無位置特異性酵素造成 EPA 與 DHA 於甘油酯中隨意分佈，所以效果不佳。
Senanayake and Shahidi (1999)以脂解酵素催化琉璃苣油與富含 DHA 的脂肪酸間之酸解 反應，目的是合成同時富含 n-3 與 n-6 PUFA 的結構脂質，並探討酵素量、溫度及不同溶劑 對反應的影響。結果指出甘油酯中 DHA 含量隨酵素量增加而上升；當以正己烷為溶劑時，
可達到最好的效果，在反應二十四小時後，n-3 與 n-6 PUFA 於甘油酯中所佔比例分別為 27.6%及 44.0%。
Miura et al. (1999)以 sn-1,3 位置特異性脂解酵素 Lipozyme IM 催化三油精(Triolein)與月 桂酸之酸解反應，在產物中所要得到之結構脂質(1,3-dilauroyl-2-oleoyl-glycerol)佔 70%，經 由管柱層析純化，可得所要之 SL 達 95%以上。最終產物 SL 中，sn-2 位置上油酸佔 96.2%，
而月桂酸僅含 3.8%。
Shimada et al. (1999)以琉璃苣油與辛酸在 Rhizopus delemar 脂解酵素(Ta-lipase, Osaka, Japan)的催化下合成 SL。結果發現若無添加水，可抑制水解反應的發生，辛酸混入甘油的 比例有 50-55%，所合成的 SL 於 sn-2 位置的 GLA 含量為 16.4 mol%，與原來琉璃苣油 sn-2 位置 GLA 含量相同。
Yankah and Akoh (2000)在正己烷中以脂解酵素 Lipozyme IM 催化三硬脂酸甘油酯 (Tristearin)與油酸或辛酸反應以合成 SL。他們指出添加超過 10 wt%的水會導致油酸與辛酸 混入 TG 的比例降低，由分析 TG 的 sn-2 位置脂肪酸組成，顯示並未有醯基轉移發生。
Jennings et al. (2000)在正己烷中以 Lipozyme IM 催化癸酸(Capric Acid)與芝麻油間之酸 解反應以合成 SL。他們發現在不添加水且於溶劑的系統下反應，辛酸於甘油酯產物中有較 高的混入率。脂解酵素通常於疏水性有機溶劑中(如正己烷)能保持良好的活性。
Schmid et al. (1998) 以 兩 階 段 反 應 的 方 式 合 成 嬰 兒 營 養 中 重 要 的 結 構 脂 質 1,3-dioleoyl-2-palmitoyl-glycerol(OPO)，先將三棕櫚酸甘油酯溶於 MTBE (Methyl Tert-butyl Ether) 中 ， 以 sn-1,3 位 置 特 異 性 的 脂 解 酵 素 催 化 與 乙 醇 間 之 醇 解 反 應 ， 產 生 2-MP (2-Monopalmitin)，以結晶法分離後可得純度高於 95%、產率達 88%，再以 sn-1,3 位置特異 性的脂解酵素催化此 2-MP 與油酸進行酸解反應，目的是合成結構脂質 OPO，其產率可達 72%，於 sn-2 位置棕櫚酸的含量佔 94%。Schmid et al. (1999)同上述之反應，可得 2-MP 純 度高於 95%、產率 85%，合成的結構脂質 OPO 中，其產率可達 78%，於 sn-2 位置棕櫚酸 的含量佔 96%。
Nagao et al. (2001)利用新開發的 sn-1,3 位置特異性且具耐熱性的脂解酵素 Fusarium heterosporum(named R275A lipase)固定在 Dowex WBA 上，催化三棕櫚酸甘油酯與油酸間之 酸解反應，當酸解程度達 50%時，分析產物甘油酯組成其中 OPO 佔 36 mol%。
Lipozyme IM 是將由 Mucor miehei 而得之脂解酵素固定在陰離子交換樹脂的固定化酵 素，由於有高的酵素穩定性(Stability)與轉酯化活性，近來常用以做為催化脂肪酸與甘油酯 進行酸解反應以合成 SL (Iwasaki et. al., 1999; Shimada et. al., 1999; Jennings et al., 2000;
Jennings and Akoh, 2000)。
綜合前述文獻，本研究將以正己烷為溶劑，以固定化脂解酵素 Lipozyme IM 催化三棕 櫚酸甘油酯與油酸之酸解反應，期望得到 sn-1,3 位置為油酸，sn-2 為棕櫚酸之結構脂質 OPO。
第三章 實驗藥品、設備與方法
3.1 實驗藥品
1. 醋酸(Acetic Acid)：99.8%，Merck，德國 2. 丙酮(Acetone)：99.9%，Tedia，美國
3. 氰化甲烷(Acetonitrile)：99.97%，Tedia，美國
4. 無水硫酸鎂(Anhydrous Magnesium Sulfate)：98%，Yakuri，日本
5. 三氟化硼與甲醇混合物(Boron Trifluoride-methanol Complex) ，Merck，德國 6. 膽鹽(Bile Salts): Sigma，德國
7. 氯仿(Chloroform)：99.9%，Mallinckrodt，美國
8. 氯化鈣(Calcium Chloride, Dihydrate): Nacalai Tesque, Inc.，日本 9. 二氯甲烷(Dichloromethane)：99.9 %，Tedia，美國
10. 1,2-二氯乙烷(1,2 Dichloroethane)：100%，Mallinckrodt，美國 11. 乙醚(Diethyl Ether): Riedel-deHaën，德國
12. 二甲亞砜(Dimethyl Sulfoxide, DMSO): Amresco，美國 13. 乙酸乙酯(Ethyl Acetate): 99.9 %，Tedia，美國
14. 乙醇(Ethanol)：99.5%，Merck，德國
15. 脂肪酸標準品(Fatty Acid Standard)：Sigma，德國 16. 甘油(Glycerol)：99%，Riedel-deHaen，德國 17. 己烷(Hexane)：95%，Tedia，美國
18. 氫氣(Hydrogen)：東興行，臺灣
19. 鹽酸(Hydrogen Chloride)：37%，Acros，比利時 20. 月桂酸(Lauric Acid)：99%，Sigma，德國
21. 甲醇(Methanol)：99.98%，Tedia，美國
22. 分子篩(Molecular Sieve)：0.4 nm，Merck，德國 23. 氮氣(Nitrogen)：99.95%，東興行，臺灣
24. 橄欖油(Olive Oil)：佳格食品，臺灣
25. 橄欖油乳化液(Olive Oil Emulsion)：50%，Sigma，美國 26. 棕櫚酸(Palmitic Acid)：99%，Sigma，德國
27. 氫氧化鉀(Potassium Hydroxide)：85%，Acros，比利時
28. 猪胰臟脂解酵素(Porcine Pancreatic Lipase)：L-3126，Sigma，德國 29. 正丙醇(Propanol)：99%，Acros，美國
30. 矽膠(Silica Gel)：60-200 Mesh，J. T. Baker，美國 31. 硝酸銀(Silver Nitrate)：Extra Pure Reagent，島久，日本 32. 氫氧化鈉(Sodium Hydroxide)：97%，Acros，比利時
33. 三酸甘油酯標準品(Triacylglyceride Standard)：Sigma，德國
34. Lipozyme IM (from Mucor miehei, Immobilized on Macroporous Anion Exchange Resin)：
Novo，丹麥
35. Novozym 435 (from Candida antarctica, Immobilized on Macroporous Acrylic Resin)：Novo，丹麥
36. Trizma Base (Tris[hydroxymethyl] aminomethane): Sigma，德國
37. Trizma Hydrochloride (Tris[hydroxymethyl] aminomethane hydrochloride): Sigma，德 國
38. TLC aluminium sheets: Merck，德國
3.2 儀器及設備
1. pH 計：686 Titroprocessor，Metrohm，瑞士
2. 薄層火燄離子分析儀: Iatronscan TLC/FID Analyzer MK-5，Iatron Laboratories, Inc.，日本 3. 多點式攪拌器：Telemodul 20P，H+P Labortechnik GmbH，德國
4. 恆溫水槽：東達儀器，臺灣
5. 真空旋轉濃縮機：R-3000，Buchi，瑞士 6. 真空幫浦：GVD-050A，Sinku Kiko，日本 7. 氣相層析儀：8700F，中國層析，臺灣
8. 氣相層析儀管柱：SP-2330 (30 m x 0.25mm i.d.)，Supelco，美國 9. 超音波洗淨機：T780H，Elma，德國
10. 超低溫冰箱：MDF-192，Sanyo，日本 11. 微量吸管：Gilson，法國
12. 微量注射器: Hamilton，美國
13. 電子式天平：AR210，Ohaus，中國
14. 電磁加熱攪拌器：PC-320，Corning，美國 15. 電腦積分器: SISC 訊華科技股份有限公司，臺灣 16. 離心機：KA-1000，Kubota，日本
17. 真空烘箱: RUD-40，Sinku Kiko，日本
18. 高效能液相層析儀幫浦：PU-980，Jasco，日本 19. 低壓溶媒梯度混合器：LG-980-02，Jasco，日本 20. 線上溶媒除氣裝置：Gastorr，Jasco，日本
21. 蒸發式光線散射偵測器(Evaporative Light Scattering Detector)： ELSD 2000，Alletch，
美國
22. 銀離子液相層析管：(ChromSpher Lipids Silver Ion HPLC Column, 250 ×4.6 mm)，
Varian，美國
3.3 實驗方法
3.3.1 三棕櫚酸甘油酯的合成
3.3.1.1 棕櫚酸與甘油之酯化反應 (陳，2002)
1. 取 2.1 mmol 棕櫚酸、0.7 mmol 甘油置於 20 mL 小瓶中。
2. 加入 50 mg 脂解酵素(Lipozyme IM)，於 80℃水浴下以磁石在 500 rpm 攪拌且在真空下 反應。
3. 在不同時間取樣 3 µL，迅速加入 1 mL 氯仿及 1 mL 終止劑(乙醇/丙酮 = 50/50 v/v)於樣 品中以終止反應。
4. 以 0.005 N 氫氧化鈉水溶液滴定至 pH 9.0，記錄所需氫氧化鈉水溶液毫升數。
5. 進行空白實驗，記錄所需的 0.005 N 氫氧化鈉水溶液毫升數。
FFA 的酯化程度(%) = 100 × (空白實驗所需的氫氧化鈉水溶液毫升數–不同反應時間下 所需的氫氧化鈉水溶液毫升數)/(空白實驗所需的氫氧化鈉水溶液毫升數)
3.3.1.2 以薄層火燄離子分析儀(TLC-FID)分析產物中甘油酯組成
1. 配製展開劑 100.1 mL，展開劑組成為 1,2-二氯乙烷/氯仿/醋酸 = 92/8/0.1 (v/v/v)，取 70 mL 展開劑置於展開槽中。
2. 將 3.3.1.1 節中，步驟 4 所得 pH 9.0 的溶液加入 3 mL 氯仿。
3. 取出氯仿層並以氮氣濃縮至 300 µL 後，以注射針取 1 µL 的樣品，將其滴在分離棒上，
再將分離棒置於展開槽中。
4. 約60 min後取出分離棒，吹乾分離棒上的溶劑後置入薄層火燄離子分析儀中分析。
5. TLC-FID 的操作條件如下：空氣流量 = 2.0 L/min；氫氣流量 = 160 mL/min；掃描速度 = 30 sec/scan；記錄紙速度 = 10 cm/min；積分儀 = CC-21 積分儀
3.3.1.3 以矽膠充填管柱分離甘油酯混合物
反應得到的甘油酯產物中含有TG、DG、MG及未反應的脂肪酸，利用對展開劑的 極性差異將產物分離以得到TG。
1. 將棉花置入管柱底部並以玻璃棒抵住，加入正己烷約至管柱的1/3高度。
2. 取80 g的矽膠置入燒杯中，加入適量的正己烷並以玻璃棒攪拌。
3. 將潤溼後的矽膠倒入管柱中，並由管柱口通入空氣使矽膠堆積更緊密。洩漏部份正 己烷至其液面稍低於矽膠頂部。
4. 取約3 g的樣品加在管柱上端，再放出正己烷使樣品液面稍低於矽膠表面。
5. 緩慢加入沖提液(正己烷/乙酸乙酯=95/5 v/v)，並開始收集流出管柱的液體。
6. 首先收集約250 mL的沖提液，在旋轉濃縮機中濃縮(通常無產品)，收集之溶劑可重 複使用。再次沖提重新收集500 mL的沖提液，將第二次收集的沖提液，置入旋轉濃 縮機中濃縮，即可得到高純度TG。取出適量TG一部份以氯仿稀釋，稀釋液以TLC-FID 鑑定TG純度，一部份將其甲酯化後以GC分析脂肪酸組成。
3.3.2 油酸的濃縮
3.3.2.1 橄欖油的皂化：依據 Wanasundara and Shahidi (1999)所使用的方法略作修改而得。
1. 取橄欖油50 g置於血清瓶中，加入氫氧化鉀11.5 g，蒸餾水22 mL及99 %乙醇126 mL。
2. 通入氮氣，在60℃水浴下反應1 h，反應結束後加入蒸餾水100 mL。
3. 以100 mL正己烷萃取2次，取出水層，以3 N鹽酸水溶液調至pH1.0。
4. 加入正己烷100 mL萃取出有機層
5. 加入適量無水硫酸鎂，攪拌30 min後過濾。
6. 以旋轉濃縮機去除有機溶劑後，取出50 µL產物加入100 µL三氟化硼-甲醇溶液混合均勻，
置於50℃恆溫水槽甲酯化30 min後，以GC分析脂肪酸組成。
7. 將得到脂肪酸置於4℃以下冷藏。
3.3.2.2 氣相層析儀(GC)的分析條件
脂肪酸由於有沸點高及具極性之特性，分析時若直接注入氣相層析儀中，不僅需極高 的溫度，得到的波峰亦有寬廣(Broad)或拖尾(Tailing)之現象，造成定量及定性上的困擾，是 以一般都先將脂肪酸酯化，再分析其組成及含量。本研究將脂肪酸以三氟化硼-甲醇溶液 轉變成脂肪酸甲基酯，再注入氣相層析儀分析組成。
氣相層析儀(GC)操作條件如下：注射器溫度: 250℃；管柱溫度: 160℃；偵測器溫度: 260
℃； 溫度梯度: 在160℃保持2 min後，以15 ℃/min之速率升溫至235℃，然後在235℃
下保持4 min；偵測器: 火燄離子偵測器。
其它GC分析條件如下：流動相=高純度氮氣(99.995%)；補充(Make Up)氣體流量= 30 mL/min；冷分流比(Cold Split Ratio)=1/50；氮氣壓力=1.0 Kgf/cm2；氫氣壓力=0.5 Kgf/cm2 3.3.2.3 一階段低溫溶劑結晶法濃縮油酸之步驟
1. 將 1 g FFA 加入含適量丙酮的玻璃瓶中，在 40℃水浴下搖動至 FFA 完全溶解，若無法完 全溶解則昇高水浴溫度至完全溶解為止。
2. 將此澄清液冷卻至室溫後，靜置於低溫冰箱-25℃中 24 h 後，以布克納漏斗快速過濾分 離固、液相。得到的液相以真空旋轉濃縮機於 40℃水浴下去除溶劑後，取出 50 µL 甲酯 化後，再以 GC 分析脂肪酸組成。
3. 將濃縮後脂肪酸置於4℃以下冷藏
3.3.2.4 兩階段低溫溶劑結晶法濃縮油酸之步驟
1. 取 1 g 經一階段低溫溶劑結晶法所得富含油酸的 FFA 做為基質，加入含適量氰化甲烷的 玻璃瓶中，置於-25℃低溫冰箱下 24 h。
2. 其餘步驟同 3.3.2.3 節所述，但目的為收集固相。
3.3.3 酸解反應
本研究在正己烷中以Lipozyme IM催化三棕櫚酸甘油酯與油酸間之酸解反應，探討 各種操作變數包括基質莫耳比、酵素量、溫度、基質濃度及含水量對酸解反應的影響。
3.3.3.1 基質莫耳比對反應的影響
1. 取三棕櫚酸甘油酯0.1 mmol，與適量的油酸混合，並加入正己烷形成3 mL溶液，置於12 mL 的玻璃瓶中，置於50℃恆溫水槽中預熱攪拌(150 rpm)30 min後，加入Lipozyme IM 20 mg開 始反應。
2. 在不同的反應時間，自反應溶液中取出0.1 mL的樣品，加入0.6 mL的正己烷及0.8 mL 1 N 的KOH 甲醇/水溶液(含30%甲醇)，以Vortex振盪後離心(1250 g, 3 min)。
3. 取出0.6 mL的上層液並蒸乾溶劑，加入1 mL的10% HCl in methanol甲酯化試劑，於80℃
水浴下反應2 h後以GC分析脂肪酸組成。
4. 反應 24 h 後，取 0.1 mL 反應溶液，加入 0.6 mL 的正己烷及 0.8 mL 1 N 的 KOH 甲醇/水 溶液(含 30%甲醇)，以 Vortex 振盪後離心(1250 g, 3 min)。取適量上層液以氮氣吹乾部份溶 劑後，以 TLC-FID 分析甘油酯組成。
3.3.3.2 其他因素對酸解反應的影響
其餘探討的變數還包括有：酵素量、反應溫度、基質濃度、含水量，步驟均類似 3.3.3.1 所述。
3.3.3.3 酸解產物三酸甘油酯的 sn-2 位置組成分析 3.3.3.3.1 以猪胰臟脂解酵素分析
依據 Liu et al. (1998)所使用的方法略做修改而得，步驟如下：
1. 酸解反應產物先以 1 N 的 KOH 甲醇/水溶液(含 30%甲醇)除酸後，再以 TLC 片展開純化 TG。展開液組成為正己烷/乙醚/醋酸 = 90/10/0.5 (v/v/v)。以碘蒸氣顯色後，刮下顯示 TG 位置的矽膠，以乙醚溶出 TG。
2. 將 100 mg 的 TG 溶於 0.2 mL 的 DMSO (Dimethyl Sulfoxide)中，再加入 3 mL Tris Buffer (1M, pH 7.7)、0.1 mL 0.2% (wt/v)膽鹽(Bile Salts)。混合後再加入 0.2 mL 22% (wt/v)的氯 化鈣。
3. 於 40℃水浴下預熱 5 min。
4. 加入 100 mg 猪胰臟脂解酵素。
5. 於 37℃水浴下反應 10 min。
6. 以 3 mL 乙醚萃取產物兩次。
7. 取出乙醚層，並以氮氣濃縮至 0.5 mL 後，將產物以 TLC 片展開。展開液組成為正己烷/
乙醚/醋酸 = 70/30/1 (v/v/v)。
8. 以碘蒸氣顯色後，刮下顯示 2-MG 位置的矽膠。以乙醚溶出 2-MG，經甲酯化後以 GC 分析其脂肪酸組成。
3.3.3.3.2 以 Candida Antarctica lipase (Novozym 435)分析
依據 Irimescu et al. (2002)發表的方法略做修改而得，步驟如下：
1. 取經 TLC 片純化後之 TG 100 mg，加入 1000 mg 的乙醇在 300 rpm、25℃下混合 10 min，
使反應物呈乳化狀態。
2. 加入110 mg Novozym 435，於25℃恆溫水槽中攪拌(300rpm)，反應120 min。
3. 其餘步驟同3.3.3.3.1節步驟6-8所述。
3.3.4 以HPLC-ELSD分析酸解產物三酸甘油酯中OPO含量
1. 取經TLC片純化後之TG溶於二氯甲烷中，以0.2 µm孔徑的過濾膜過濾後，取20 µL注射量 以HPLC分析。
2. HPLC操作條件如下：
移動相(mobile phase)：
Time(min) Acetone(%) Dichloromethane(%)
0 2 98
8 2 98
10 16 84
22 28 72
28 98 2
32 2 98
35 2 98
流速(flow rate) = 0.8 mL/min。
3. ELSD偵測條件如下：Tube temperature: 50℃；Gas flow rate: 1.6 L/min；Gain: 1；Impactor:
off 。
三酸甘油酯檢量線的製作
1. 分別配置不同重量濃度(6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 mg/L)的三酸甘油酯標準品之二氯甲 烷溶液，以0.2 µm孔徑的過濾膜過濾後，取20 µL注射量以HPLC分析。
2. 繪製重量濃度與對應的波峰面積值的全對數檢量線圖。
3. 經由檢量線可計算出各成份的重量，進而得知各成份於產物中的重量百分比。
3.3.5 酵素活性的測定
3.3.5.1 脂解酵素之酯化活性測定
脂解酵素 Novozym 435 及 Lipozyme IM 之酯化活性測定如下：
1. 取 0.9 g 正丙醇及 3 g 月桂酸溶於正己烷中形成 30 mL 的混合溶液。
2. 將此溶液置於 50 mL 玻璃瓶中，於 60℃水浴下預熱 10 min 後加入 100 mg 固定化酵素，
在轉速 200 rpm 下反應 15 min。
3. 立刻加入 10 mL 終止劑(乙醇/丙酮 = 50/50 v/v)以終止反應。
4. 以 0.1 N 氫氧化鈉水溶液滴定上述溶液至 pH 9.0 並記錄所需 0.1 N 氫氧化鈉水溶液毫升 數。
5. 進行空白試驗並記錄所需 0.1 N 氫氧化鈉水溶液毫升數。
6. 將步驟 5 及 4 的氫氧化鈉水溶液滴定量相減，換算成消耗的月桂酸µmole 數。
7. 定義活性單位 1 U 為每分鐘消耗 1 µmole 月桂酸所需的酵素量。
3.3.5.2 猪胰臟脂解酵素之水解活性測定(Tietz and Fiereck, 1966)
猪胰臟脂解酵素之水解活性測定是以橄欖油乳化液做為基質，藉滴定的方式定量水解 產生的游離脂肪酸，並依此推算出酵素的水解活性，步驟如下：
1. 取 2 mL 50% v/v 的橄欖油乳化液以 0.1 N pH 7.2 磷酸鹽緩衝液稀釋成 10 mL 10% v/v 的 橄欖油乳化液。
2. 將此溶液置於 50 mL 玻璃瓶中，於 37℃水浴下預熱 20 min 後加入 100 mg 酵素，在轉 速 200 rpm 下反應 20 min。
3. 立刻加入 10 mL 終止劑(乙醇/丙酮 = 50/50 v/v)以終止反應。
4. 以 0.1 N 氫氧化鈉水溶液滴定上述溶液至 pH 9.0 並記錄所需 0.1 N 氫氧化鈉水溶液毫升 數。
5. 進行空白試驗並記錄所需 0.1 N 氫氧化鈉水溶液毫升數。
6. 將步驟 4 及 5 的氫氧化鈉水溶液滴定量相減，換算成游離脂肪酸的生成量。
7. 定義活性單位 1 U 為每分鐘水解 1 µmole 游離脂肪酸所需的酵素量。
以上所有實驗之實驗數據是由至少兩組以上獨立實驗所得數據之平均值，實驗誤差值 (Error Bar)則是以標準差(Standard Deviation)來表示。
