2.1 三棕櫚酸甘油酯的合成
2.1.1 化學法合成三酸甘油酯(TG)
Wheeler et al. (1940)以 p-Toluenesulfonic Acid 所催化的酯化反應，有效地合成含單元 不飽和脂肪酸的 TG，此法會有少量的異構化副產物生成。Mattson and Volpenhein (1962)以 脂肪酸氯化物與甘油反應來合成甘油酯，沒有異構化副產物產生，但缺點是總產率只有 60-70%，且未反應的脂肪酸不易回收。Adlof and Emken (1984)以甲醇鈉(Sodium Methoxide) 於 65℃下催化三醋酸甘油酯(Triacetin)與脂肪酸的甲基酯進行轉酯化反應，以合成含 PUFA 的 TG；此法的產物含有脂肪酸甲基酯、TG 及微量的二酸甘油酯，不易以一般方法如液-液萃取法或矽膠層析法(Silica Gel Chromatography)來純化產物，需以含銀離子的層析管柱 (Silver Resin Chromatography)方能分離得到所要的 TG。
工業上合成 TG 是以 FFA 與甘油做為基質，於高溫高壓下反應，此方法需要多個純化 步驟(Captex, 1986)，且反應的溫度高，僅適合用來合成含飽和脂肪酸的 TG，例如 MCT (Medium Chain Triglycerides)，不適合於含 PUFA 的 TG 之合成。
2.1.2 脂解酵素催化合成 TG 的反應 Novozym 435、Lipozyme IM 及 PS-30 等三種脂解酵素的酯化能力，結果發現不論是酯化程 度或 TG 產率，Novozym 435 都有最好的效果。他們並指出 Log P 值較高的溶劑如正己烷與 異辛烷反應性較高，其中又以使用正己烷可得到最高的 TG 產率。
Medina et al. (1999)以脂解酵素 Novozym 435 在正己烷中催化由魚油或海藻油所得的 PUFA 濃縮液與甘油進行酯化反應，以合成 TG。在最適的條件下，從鱈魚肝油得到的 PUFA 濃縮液之反應可得 93.5%的 TG 產率，酯化程度則為 95.7%；從海藻油 Phaeodactylum tricornutum 得到的 PUFA 濃縮液之反應可得 96.5%的 TG 產率， 酯化程度有 98.3%；從 Porphyridium cruentum 得到的 PUFA 濃縮液的反應可得 89.3%的 TG 產率，酯化程度有 99.4%。
Janssen et al. (1993)探討在有機溶劑中，以脂解酵素催化 FFA 與甘油進行酯化反應合成 甘油酯時，脂肪酸鏈長及溶劑極性對產物中甘油酯組成的影響。他們指出在極性溶劑中反
應，對單酸甘油酯的產生速率有利，且在有溶劑的系統中反應，飽和及不飽和的 C18 脂肪
Kawashima et al. (2001)在無溶劑與低壓(15 mm-Hg)的系統下，以 PUFA 與甘油在 Novozym 435 的催化下合成 TG。此反應對 GLA, AA, EPA 及 DHA 而言，皆可得到高的酯 化程度及 TG 產率。他們並指出 Novozym 435 對上述 PUFA 有較強的作用力。
綜合以上所述，本研究選擇以甘油與棕櫚酸在無溶劑系統中反應，利用真空幫浦去除 水來合成三棕櫚酸甘油酯，探討酵素(Lipozyme IM 與 Novozym 435)對酯化反應的影響。
2.2 油酸的濃縮 橄欖油、Virgin 橄欖原油、Pure 一般純橄欖油、橄欖渣油，其中最大的差別在於酸度，Extra Virgin 特級橄欖油酸度在百分之一以下，Virgin 橄欖原油酸度在百分之一至百分之二之間，
Pure 一般純橄欖油則是以酸度百分之三的原油再調和特級橄欖油而成。
橄欖果實經採收、清洗、壓榨，再以離心方式將油、水分開，即可得到橄欖原油，而 此原油可分三種，Extra Virgin 特級橄欖油最為天然，其次為 Virgin 橄欖原油，酸度較高的 則經精製(Refine)後再加入少許特級橄欖油添加風味而成為 Pure 一般純橄欖油，台灣市面上 銷售的主要為 Extra Virgin 特級橄欖油與 Pure 純橄欖油兩種。
表 2-1 食用油的脂肪酸組成(台灣地區食品營養成分資料庫，1998)
加進 Extra Virgin 油調配的則標示為 Pure；經過五榨或五榨以上的油在製作過程中會產生毒 性副產品，有致癌的可能，因此不能成為食用油等級。但值得注意的是，植物油中的單元 不飽和脂肪酸比例越高，油質越穩定；而多元不飽和脂肪酸越高則在高溫下越容易產生氧 化作用，油質越不安定。
2.2.3 低溫溶劑結晶法
低溫溶劑結晶法(Low Temperature Solvent Crystallization)是一種古典分離脂肪酸的方 法，主要係利用脂肪酸或脂肪酸甲基酯於低溫溶劑中溶解度之差異，來濃縮特定的脂肪酸。
通常脂肪酸在極性有機溶劑中的溶解度會因碳鏈愈長則溶解度愈低，雙鍵數目愈多則溶解 度愈高(Schlenk, 1961)。此方法之結晶程序於低溫下進行，能降低脂肪酸氧化的機率，同時 具有操作簡單及溶劑容易回收重覆使用的優點。
Brown and Shinowara (1937)以丙酮做為溶劑，濃縮皂化橄欖油中的油酸。在不同的溫 度下部份結晶(Fractional Crystallization)，在-35℃的濾液中，可得到碘值(Iodine Value)為 89.71 的油酸混合物。
野口泰久(1983)利用低溫溶劑結晶法，將沙丁魚等魚油溶於丙酮中，在-80℃下攪拌過 分別將 EPA, DHA 與 n-3 PUFAs 從原來之 15.45%、9.67%與 32.63%提昇到 28.94%、18.36%
與 60.92%，且 n-3 PUFAs 回收率 90.26%。在第二階段濃縮時以丙酮-氰化甲烷混合液(70/30, v/v)與脂肪酸在 60:1 (mL:g)的比例，-80℃，24 h 之條件下，可分別再將 EPA, DHA 與 n-3 PUFAs 提昇到 33.85%、21.35%與 70.77%，且 n-3 PUFAs 回收率 89.03%，總回收率達 80.36%。
陳(2002)將棕櫚油皂化後之 FFA 以一階段低溫溶劑結晶法分離所得脂肪酸(含 69.5%油
SL可以不同的反應方式得到。例如：(1)TG與TG間的交酯化反應(Lee and Akoh, 1998)；
(2)TG與FFA間的酸解反應(Akoh and Huang, 1995)；(3)TG與FFA酯間的轉酯化反應(Huang and Akoh, 1996)。通常方法(1)雖可得到SL，但得到的產物中甘油酯的組成通常較為複雜(Lee and Akoh, 1997)，甘油酯中所希望得到的SL含量也較低，產物的分離純化也不容易。要得 到SL以方法(2)及(3)，並以具有sn-1,3位置特異性的脂解酵素做為催化劑是較可行的方法。
Bloomer et al. (1992)指出以羧酸的乙基酯(Carboxylic Acid Ethyl Ester)做為醯基捐贈 者，雖然比羧酸做為醯基捐贈者有更高的反應速率，但會導致較多的二酸甘油酯(Diglyceride, DG)生成。所以本研究選擇以油酸做為酸解反應的醯基捐贈者。
2.3.2 脂解酵素催化合成結構脂質
對於催化 TG 與 FFA 進行酸解反應以合成 SL 所使用之脂解酵素，文獻中常用的有源 自 Rhizopus delemar 與 Mucor miehei 之兩種脂解酵素。此兩種脂解酵素對甘油酯具有 sn-1 及 sn-3 之位置特異性。
Lee and Akoh (1998) 在 正 己 烷 中 以 無 特 異 性 Novozym 435 催 化 三 辛 酸 甘 油 酯
(Tricaprylin)及含 EPA 33.8%與 DHA 26.0%的 FFA 間之酸解反應，期望將 EPA 及 DHA 混入 甘油酯的 sn-2 位置。最終產物 SL 中，sn-2 位置僅含 17.8%的 EPA 及 15.0%的 DHA，表示 因使用無位置特異性酵素造成 EPA 與 DHA 於甘油酯中隨意分佈，所以效果不佳。
Senanayake and Shahidi (1999)以脂解酵素催化琉璃苣油與富含 DHA 的脂肪酸間之酸解 反應，目的是合成同時富含 n-3 與 n-6 PUFA 的結構脂質，並探討酵素量、溫度及不同溶劑 對反應的影響。結果指出甘油酯中 DHA 含量隨酵素量增加而上升；當以正己烷為溶劑時，
可達到最好的效果，在反應二十四小時後，n-3 與 n-6 PUFA 於甘油酯中所佔比例分別為 27.6%及 44.0%。
Miura et al. (1999)以 sn-1,3 位置特異性脂解酵素 Lipozyme IM 催化三油精(Triolein)與月 桂酸之酸解反應，在產物中所要得到之結構脂質(1,3-dilauroyl-2-oleoyl-glycerol)佔 70%，經 由管柱層析純化，可得所要之 SL 達 95%以上。最終產物 SL 中，sn-2 位置上油酸佔 96.2%，
而月桂酸僅含 3.8%。
Shimada et al. (1999)以琉璃苣油與辛酸在 Rhizopus delemar 脂解酵素(Ta-lipase, Osaka, Japan)的催化下合成 SL。結果發現若無添加水，可抑制水解反應的發生，辛酸混入甘油的 比例有 50-55%，所合成的 SL 於 sn-2 位置的 GLA 含量為 16.4 mol%，與原來琉璃苣油 sn-2 位置 GLA 含量相同。
Yankah and Akoh (2000)在正己烷中以脂解酵素 Lipozyme IM 催化三硬脂酸甘油酯 (Tristearin)與油酸或辛酸反應以合成 SL。他們指出添加超過 10 wt%的水會導致油酸與辛酸 混入 TG 的比例降低，由分析 TG 的 sn-2 位置脂肪酸組成，顯示並未有醯基轉移發生。
Jennings et al. (2000)在正己烷中以 Lipozyme IM 催化癸酸(Capric Acid)與芝麻油間之酸 解反應以合成 SL。他們發現在不添加水且於溶劑的系統下反應，辛酸於甘油酯產物中有較 高的混入率。脂解酵素通常於疏水性有機溶劑中(如正己烷)能保持良好的活性。
Schmid et al. (1998) 以 兩 階 段 反 應 的 方 式 合 成 嬰 兒 營 養 中 重 要 的 結 構 脂 質 1,3-dioleoyl-2-palmitoyl-glycerol(OPO)，先將三棕櫚酸甘油酯溶於 MTBE (Methyl Tert-butyl Ether) 中 ， 以 sn-1,3 位 置 特 異 性 的 脂 解 酵 素 催 化 與 乙 醇 間 之 醇 解 反 應 ， 產 生 2-MP (2-Monopalmitin)，以結晶法分離後可得純度高於 95%、產率達 88%，再以 sn-1,3 位置特異 性的脂解酵素催化此 2-MP 與油酸進行酸解反應，目的是合成結構脂質 OPO，其產率可達 72%，於 sn-2 位置棕櫚酸的含量佔 94%。Schmid et al. (1999)同上述之反應，可得 2-MP 純 度高於 95%、產率 85%，合成的結構脂質 OPO 中，其產率可達 78%，於 sn-2 位置棕櫚酸 的含量佔 96%。
Nagao et al. (2001)利用新開發的 sn-1,3 位置特異性且具耐熱性的脂解酵素 Fusarium heterosporum(named R275A lipase)固定在 Dowex WBA 上，催化三棕櫚酸甘油酯與油酸間之 酸解反應，當酸解程度達 50%時，分析產物甘油酯組成其中 OPO 佔 36 mol%。
Lipozyme IM 是將由 Mucor miehei 而得之脂解酵素固定在陰離子交換樹脂的固定化酵 素，由於有高的酵素穩定性(Stability)與轉酯化活性，近來常用以做為催化脂肪酸與甘油酯 進行酸解反應以合成 SL (Iwasaki et. al., 1999; Shimada et. al., 1999; Jennings et al., 2000;
Jennings and Akoh, 2000)。
綜合前述文獻，本研究將以正己烷為溶劑，以固定化脂解酵素 Lipozyme IM 催化三棕 櫚酸甘油酯與油酸之酸解反應，期望得到 sn-1,3 位置為油酸，sn-2 為棕櫚酸之結構脂質 OPO。