本實驗利用兩種不同的噬菌體胜肽庫，12 胜肽隨機胜肽庫 (Ph.D.-12)以及七胜肽隨機胜肽庫 (Ph.D.-C7C) 來進行篩選對牛肝中 氧化鯊烯環化酵素具有親和力的胜肽序列。將純化出牛肝中的氧化鯊 烯環化酵素直接吸附固定在ELISA盤上，取 10 µL 的 1012 pfu/mL噬菌 體加入well中與蛋白質進行反應，每次篩選過程中洗滌的次數增加，
以及洗滌緩衝液Tween 20 含量從 0.1 ％增加至 0.5 ％，這是為了能篩 選得到更具有親和力的噬菌體。經過了三次親和性篩選後，得到七胜 肽隨機胜肽庫【圖 3-3】第二次及第三次篩選利用ELISA方法得到的 親和力比較圖，正向控制組 (positive control)為單純以噬菌體直接吸 附在ELISA盤上，在經過覆蓋液覆蓋及噬菌體胜肽序列、二抗鍵結後 得到結果，可以用來說明整個過程的每個環節都是正常，沒有酵素失 活或者呈色劑無法呈色等問題。負向控制組 (negative control)是以 BSA蛋白質當作目標物，代表的意義為所篩選的噬菌體及二抗對於 BSA蛋白質不會有鍵結作用。由圖中噬菌體循環次數與負向控制組的 吸收值相比較之下，可以得知第二次及第三次的親和篩選皆得到和氧 化鯊烯環化酵素鍵結的噬菌體，而兩次篩選由於沒有因為選次數增加 得到較高的吸收值，所以以第三次的篩選的結果挑取 25 個單一菌落 株得到了數段序列【表 3-1】並進行每個單一噬菌體胜肽序列的親和 性測試。
Ph.D.-C7C v.s. OSC ELISA Data
positive negative cycle 2-1 cycle 2-2 cycle 3-1 cycle 3-2
OD 450 nm
Sequence Number Ratio
S P W H W W A 5
將單一菌落經由感染、放大及純化的步驟，得到表現單一胜肽序 列的噬菌體透過墨點法、ELISA及西方墨點法的親和性測試後，發現 其和氧化鯊烯環化酵素在墨點法及西方墨點法中沒有反應，且從 ELISA親和性測試中，負向控制組 (negative control)得到很高的吸收 值。根據Adey等人41在1995 年得知噬菌體胜肽庫和polystyrene
plates，即ELISA盤，在含有高鹽及tween 20 之下有鍵結作用。而後來 Gebhardt等人42，將噬菌體胜肽庫和ELISA盤進行篩選得到一段具有 親和性的序列：WXXWXXXW (X = 任何一種胺基酸)，而我們所用 的篩選方法使用ELISA 盤進行篩選，且得到的序列含有大量的色胺 酸 (Trp, W)，根據前面的序列和我們所得到的序列相比較之下，且在 ELISA測試中得到很高的負向控制組吸收值，推測所篩選到的胜肽序 列大部分是跟ELISA盤鍵結的序列。因此在實驗的設計上，進行每次 親和篩選前先加入一負向篩選 (Negative selection)，步驟即每次進行 親和性篩選前都要先作ELISA盤的負向篩選，確保之後得到的單一胜 肽序列對BSA蛋白質及ELISA盤不會有鍵結作用。
在篩選的過程中先經由負向篩選，去除掉部分和ELISA盤及BSA 蛋白質鍵結的片段，進而和氧化鯊烯環化酵素進行親和性篩選，經過 五次的篩選過程，每次篩選下來噬菌體數目都大約104~105 pfu/µL，
噬菌體經放大後的數目也約1012~1014 pfu/µL，利用ELISA測試其反應 性【圖 3-4】。由ELISA的結果得知，對篩選出的二組胜肽庫作一連串 稀釋，和氧化鯊烯環化酵素作用後，測其吸收值發現有明顯的反應，
且將每個篩選到的噬菌體作一個負向控制組，得到結果發現其吸收值 都比氧化鯊烯環化酵素反應結果低，跟之前的實驗相比較，可以推測 在整個篩選過程中，加入負向篩選確實篩選掉跟ELISA盤及BSA蛋白 質鍵結的序列，只留下和氧化鯊烯環化酵素鍵結的噬菌體。針對第五 次篩選得到的噬菌體挑選其中 10 個噬菌體單一菌落進行序列及親和 力分析。
(A)
7 mer peptide phage display
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
Positive 3.5*10^8 3.5*10^7 3.5*10^6 phage titre
A450
(B)
12 mer peptide phage library
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
Positive 5*10^8 5*10^7 5*10^6 phage titre
A450
【圖3-4】 (A)噬菌體 Ph.D.-C7C 胜肽庫和氧化鯊烯環化酵素 ELISA 反應結果。(B)噬菌體 Ph.D.-12 胜肽庫和氧化鯊烯環化酵素 ELISA 反 應結果。 代表正向控制組， 代表噬菌體對氧化鯊烯環化酵素的 反應， 代表負向控制組。