除了利用墨點、ELISA 來偵測鍵結作用外，藉由西方墨點法可以 更確認蛋白質跟單一胜肽序列之間的鍵結【圖 3-7】。以 SDS-PAGE 分析氧化鯊烯環化酵素，接著將膠片上的蛋白質藉由轉印槽轉印至膜 上，再利用 ELISA 的原理，以單一噬菌體作為一抗，anti-M13 作為 二抗，經由 ECL 呈色得到。這個實驗重複三次以上所得到的結果。
對於轉印膜的選用起初使用PVDF 膜，因為其吸附力較好且較不易擴 散，但經過幾次的實驗結果發現，其背景值較深常導致無法判斷結 果，所以後來改用硝化纖維 (Nitrocellulose, NC)作為轉印膜，解決背 景值問題。所以圖中的結果皆以NC 作為轉印膜。由結果很清楚可以 得知這些單一噬菌體胜肽序列對於氧化鯊烯環化酵素具有鍵結作 用，對照組 (control)為將蛋白質轉印至 NC 轉印膜上後，以未重組的 噬菌體，即沒有表現胜肽序列的噬菌體作為一抗，和氧化鯊烯環化酵 素進行反應得到的結果。對照組沒有反應代表噬菌體外殼上的蛋白質
不會和氧化鯊烯環化酵素進行鍵結。結果中α3、ε7 及α5 對酵素具 有親和力，但其背景值較高且相當均勻，因此推測其對脫脂奶粉中的 蛋白質或轉印膜具有鍵結作用，進而影響到背景值。以下提出幾個解 決的方法，在噬菌體胜肽序列反應的時候加入少量的脫脂奶粉，不要 單純只用緩衝液；另一方面使用其他的覆蓋液來取代脫脂奶粉，這些 需要進一步的測試。
66 kDa 45 kDa
30 kDa
20 kDa 96 kDa
OSC
α8 α5 α2
C
OSC
ε7 ε6 α3
21
【圖3-7】西方墨點法測定單一噬菌體對氧化鯊烯環化酵素的親和性 結果。
除了圖中的七個樣品外，還針對ε5 及α6 進行西方墨點法的測 試，確定其有反應但由於所用的為PVDF 轉印膜，導致背景值太高所 以無法經由掃瞄後看到反應位置，所以圖上沒有放。
樣品 21 由西方墨點法的圖上沒有看到反應產生，但從前面墨點 法及ELISA 測定中都可以看到樣品 21 對氧化鯊烯環化酵素具有反應 性，三個測定方法的差別性在於氧化鯊烯環化酵素在西方墨點法中，
利用SDS 及加熱方式將其 denature，使蛋白質不具構形，而墨點法跟 ELISA 則是直接將純化出具有活性的蛋白質吸附在膜及 ELISA 盤 上，較有機會保持蛋白質本身的構形。因此推論樣品 21 對於非具結 構性的氧化鯊烯環化酵素沒有親和作用，而具有結構上的選擇性。進 一步探討樣品 21 可以藉由 native 蛋白質膠片進行西方墨點法分析，
測定樣品是否對於氧化鯊烯環化酵素具有結構選擇性。
綜合墨點法、ELISA 及西方墨點法的測試結果，得到八個噬菌體 對於氧化鯊烯環化酵素均具有反應，其餘二個序列需在進行 ELISA 及西方墨點法的測試。由墨點法可以明顯看到噬菌體胜肽序列對於 BSA 蛋白質及氧化鯊烯環化酵素的反應性，但由於不能定量所以無 法互相比較，其中α6 明顯有和 BSA 蛋白質反應但在後來 ELISA 上，
負向控制組卻很低的反應性，這一部份將需要在作進一步的確認。
ELISA 方法可以解決定量的問題，將蛋白質及噬菌體控制在固定的反 應槽中，藉由吸收值相互比較反應性，結果發現α6 及 21 的反應性 較低。藉由西方墨點法可以測其專一性，由於以單一蛋白質作反應，
所以沒有測定噬菌體胜肽序列對於牛肝中其他蛋白質是否也具有親 和作用，所以未來可以針對這些序列作專一性的探討。