利用噬菌體胜肽庫篩選對牛肝氧化鯊烯酵素有專一性的胜肽序列

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(1)國立交通大學生物科技研究所碩士論文. 利用噬菌體胜肽庫篩選對牛肝氧化鯊烯酵素有專一性的胜肽序列 Peptide Aptamer Selection for Bovine Liver Oxidosqualene-Lanosterol Cyclase from Phage Display 研究生 : 葉佳宜指導教授 : 吳東昆博士. 中華民國九十四年七月.

(2) 利用噬菌體胜肽庫篩選對牛肝氧化鯊烯酵素有專一性的胜肽序列 Peptide Aptamer Selection for Bovine Liver Oxidosqualene-Lanosterol Cyclase from Phage Display 研究生：葉佳宜. Student：Chia-Yi Yeh. 指導教授：吳東昆博士. Advisor：Dr. Tung-Kung Wu. 國立交通大學生物科技學系碩士論文. A Thesis Submitted to Department of Biological Science and Technology College of Science National Chiao Tung University in partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master in Biological Science and Technology July, 2005 Hsinchu, Taiwan, Republic of China. 中華民國九十四年七月.

(3) 利用噬菌體胜肽庫篩選對牛肝氧化鯊烯酵素有專一性的胜肽序列研究生：葉佳宜. 指導教授：吳東昆. 博士. 國立交通大學生物科技學系. 摘要氧化鯊烯環化酵素（OSC）在固醇類和三萜類產物的生合成中，扮演重要的角色，可以催化受質鯊烯或者氧化鯊烯進行環化/重組反應，轉變成多環結構的羊毛硬脂醇及環阿屯醇。由於氧化鯊烯環化酵素催化的複雜產物膽固醇及麥角脂醇是構成細胞膜的重要要素，且在細胞生長過程中產生此酵素，所以氧化鯊烯環化酵素作為目標物設計抗菌劑及降低膽固醇藥物是相當重要的課題。我們對於篩選氧化鯊烯環化酵素有親合力作用的胜肽序列感到興趣，希望未來發展成為藥物。用兩種噬菌體胜肽庫，七個及十二個隨機胜肽的胜肽庫，對氧化鯊烯環化酵素進行配位基的篩選。將噬菌體胜肽庫和覆蓋滿目標物的盤子反應，洗去為鍵結的噬菌體，並且將有鍵結的噬菌體洗滌下來，依照這樣的過程進行五次對氧化鯊烯環化酵素的親和篩選，得到具有鍵結力的噬菌體胜肽序列，並且進行 DNA 定序，得到八個對氧化鯊烯環化酵素具有親和性的噬菌體胜肽序列，由西方墨點法測定得到 1 個七胜肽序列和 6 個十二胜肽序列具有反應。結果中，其中 1 個表現十二胜肽序列的樣品在點墨法中清楚看到反應，但在 ELISA 測試中反應較弱，利用西方墨點法測試時，卻沒有反應。. I.

(4) Peptide Aptamer Selection for Bovine Liver Oxidosqualene-Lanosterol Cyclase from Phage Display Student: Chia-Yi Yeh. Advisor: Dr. Tung-Kung Wu. Department of Biological Science and Technology National Chiao Tung University. Abstract Oxidosqualene cyclase (OSC), a remarkable enzyme catalyzing cyclization/rearrangement reaction of a acyclic squalene or oxidosqualene into polycyclic lanosterol or cycloartenol, plays important role in the biosynthesis of sterols and triterpenoids. The important role of cholesterol and ergosterol involved in the membrane function and cell growth has made the OSC enzyme design a unique target for designing antifungal and. hypocholesteremic. drugs.. We. are. interested. in. screening. OSC-binding peptide aptamer for future drug development. Two phage display libraries, one heptapeptide and one dodecapeptide library, were subjected to biopanning for OSC binding ligand identification. Following five biopanning process of OSC-binding selection and DNA sequencing of selected phages, eight OSC-bound phages were selected. Among them, one heptapeptide and six dodecapeptides, showing OSC-binding affinity were identified from Western blotting experiments. On the other hand, one dodecapeptides showed clear binding affinity to OSC on dot blotting, weak affinity on ELISA, but not on Western blotting assay.. II.

(5) 謝誌兩年的研究生活，充滿喜怒哀樂，在實驗上遇到挫折困難的時候，心裡總會感到難過；當實驗有所突破，就會開心很久。兩年就在這樣交錯的心情中度過，過程中有著許多人的支持陪伴，以及他們的幫忙，讓我能順利畢業，所以把這份喜悅分享給他們。首先是我的指導教授吳東昆博士，感謝他在實驗關念、實驗設計和生活上給予我的指導，讓我從化學界能順利的踏入生物領域，並且培養我實驗上思考、判斷與觀察的能力。感謝應化系李耀坤教授與淡江化學系鄭建中教授，忙碌之餘抽空對於我的論文修改及審閱，並且在實驗上提供了寶貴的意見讓論文更為完整。實驗室的程翔、裕國、媛婷、幸如、小宇與宏城學長姐，在我最無助最無奈的時候給予我很大的鼓勵及支持，尤其是程翔學長，在實驗及純化上幫忙我很多，此外裕國學長也在實驗上指導我，讓我學到很多技術。另外特別提到嬌小的媛婷學姐，常聽我訴苦，並且關心我，安慰我，解決我很多生活上的困難。當然還有一起同甘共苦的伙伴們，單純的妍希、活潑的阿美、四千金豪哥與愛講冷笑話的文鴻，是他們讓我這兩年不寂寞，陪著我奮戰到最後，和他們一起修課，一起成長，一起分享心情，短暫的兩年卻建立我們深厚的友誼。實驗室其他學弟妹，憨厚的宗哥、搞笑的宏明、帥帥的庭翊、調皮的晉源、開心果駿哥、乖巧的大景、俏皮的文暄、可愛的怡親、任真的皓宇、搞怪的聖傑等，在我最後衝刺及寫論文的階段，幫忙很多，讓我能無後顧之憂。感謝所有的人，沒有你們我的論文不會精彩，沒有你們我的論文不會如期完成。最後，我要謝謝最愛我的爸爸媽媽、我最愛的弟弟佳俊及默默陪著我的庭翊，對我的支持與鼓勵，沒有你們就沒有現在的我，這份論文獻給你們。. III.

(6) 目錄. 頁次中文摘要………………………………………………...……Ⅰ 英文摘要…………………………………………...………....Ⅱ 目錄…………………………………………………...………Ⅲ 圖目錄……………………………………………………...…Ⅳ 表目錄…………………………………………………...……Ⅸ 第一章緒論 1-1 膽固醇的重要性…………………………………………...………1 1-2 膽固醇生合成…………………………………………...…………3 1-3 氧化鯊烯環化酵素之簡介……………………………………...…5 1-3-1 氧化鯊烯環化酵素的酵素學…………………………...…….7 1-3-2 氧化鯊烯環化酵素的反應機制……………………...……….9 1-4 噬菌體表現系統之簡介…………………………………………..15 1-5 噬菌體表現系統的型式…………………………………………..18 1-6 噬菌體胜肽庫(peptide library)及抗體庫(antibody library)…20 1-7 噬菌體表現系統篩選方式………………………………………...21 1-8 研究動機與目的…………………………………………………...22. 第二章實驗材料及方法實驗材料 2-1 藥品………………………………………………………………..24 2-2 緩衝液及溶液配置………………………………………...………27 2-3 實驗儀器…………………………………………………………..31 2-4 菌株及質體………………………………………………………..32 實驗方法 2-5 牛肝中氧化鯊烯環酵素之純化…………………………………..33 2-5-1 溶解微粒體…………………………………………...……...34 IV.

(7) 2-5-2 粗萃取液……………………………………………………..34 2-5-3 Q-Sepharose 陰離子交換管柱層析………………………….34 2-5-4 Hydroxyapatite Gel 管柱層析………………………………..35 2-5-5 HiTrap Heparin 管柱層析…………………………………...35 2-5-6 酵素的分子量及純度分析………………………………….35 2-5-7 酵素活性測試……………………………………………….37 2-5-8 酵素濃度分析……………………………………………….38 2-6 Ph.D.-C7C 及 Ph.D.-12 對牛肝鯊烯環化酵素的親和篩選……..39 2-6-1 牛肝鯊烯環化酵素之製備………………………………….40 2-6-2 負向親和篩選………………………………………………..41 2-6-3 第一次親和篩選…………………………………………….41 2-6-4 將噬菌體培養放大………………………….……………….41 2-6-5 第二次親和篩選…………………………………………….42 2-7 噬菌體效價之測定………………………………………………43 2-7-1 方法一：培養盤菌落數計………………………………….43 2-7-2 方法二：光譜吸收測定…….……………………………….43 2-8 噬菌體胜肽庫對氧化鯊烯環化酵素之親和力測定……….44 2-8-1 酵素連結免疫吸附分析法 (ELISA)之反應測試……….44 2-8-2 墨點法 (Dot blot)之反應測試……………………………...45 2-8-3 西方墨點法 (Western blotting)之反應測試………………..45 2-9 單股 DNA 模版之純化…………………………………………..47 2-10 DNA 定序………………………………………………………..47 2-11 單株抗體的製備………………………………………………...49 2-11-1 免疫動物……………….……………….…………………...49 2-11-2 骨髓癌細胞 (myeloma cell) …………………….……...49 2-11-3 細胞融合……………………………………………………51 2-11-4 細胞增殖及取樣篩檢………………………………………51 2-11-5 融合細胞之單株化………….………………………………52 2-11-6 單株抗體之產生………….…………………………………52 2-12 利用酵母菌系統表現牛肝氧化鯊烯環化酵素…………………53 V.

(8) 2-11-1 聚合酶連鎖反應…………………………………….……..54 2-11-2 質體的建構………………………………………………...55 2-11-3 功能性互補…….…………………………………………...55 2-11-4 酵母菌株 TKW14C2 的質體轉化作用…………………...56 2-11-5 質體交換………………………………………...…………...56 2-11-6 酵母菌株 pichia strain (GS115)的質體轉化作用………58 2-11-7 聚合酶連鎖反應分析重組 DNA…………………………..58 2-11-8 利用酵母菌系統表現蛋白質………...…………………...59. 第三章實驗結果與討論 3-1 氧化鯊烯環化酵素之純化………………………….………….…60 3-2 氧化鯊烯環化酵素的單株抗體…………………….…………….61 3-3 噬菌體胜肽庫親合篩選…………………….……………………62 3-3-1 噬菌體效價測定…………………………….…………….67 3-3-2 利用墨點法作親和力測試………………………..………67 3-3-3 利用酵素連結免疫吸附分析法作親和力測試…..………68 3-3-4 利用西方墨點法作親和力測試………………….………….69 3-3-5 噬菌體胜肽庫之定序…………………….….…………….72 3-4 利用酵母菌系統表現牛肝中氧化鯊烯環化酵素…………….74. 第四章結論與未來展望……………………………………..……75 第五章參考資料………………………………………...……….…76 附錄…………………………………………………………………….79 附錄一 Pichia pastoris 表現牛肝氧化鯊烯環化酵素…………..,……79. VI.

(9) 圖目錄圖 1-1 膽固醇的化學結構…………………………………………..…1 圖 1-2 膽固醇在動物體內的代謝途徑………………………………..4 圖 1-3 動物體內氧化鯊烯環化酵素的催化反應…………………..5 圖 1-4 自然界各物種間的(氧化)鯊烯環化酵素作用途徑….………6 圖 1-5 (氧化)鯊烯環化酵素產生的相異結構產物……………………9 圖 1-6 (氧化)鯊烯環化酵素環化反應機制及產物多樣性…………...11 圖 1-7 Johnson Model 示意圖…………...……….………………….12 圖 1-8 Q-W motif 理論的模型示意圖…….………...………………13 圖 1-9 噬菌體感染大腸桿菌的生命週期…………………………….15 圖 1-10 絲狀噬菌體 pⅢ感染大腸桿菌過程…………………………16 圖 1-11 絲狀噬菌體結構示意圖……………………………………...17 圖 1-12 噬菌體表現外來蛋白質的兩種型式………………………...18 圖 1-13 SIP 技術示意圖……………….………….………………….19 圖 1-14 在 ELISA 盤子上篩選過程的示意圖………………..……..21 圖 2-1 TLC 活性測試示意圖………………………………………..37 圖 2-2 噬菌體胜肽庫篩選示意圖…………………………………..40 圖 2-3 噬菌體光譜吸收圖…………………………………………..43 圖 2-4 抗原抗體測定示意圖………………………………………..44 圖 2-5 西方墨點法三明治疊法……………………………………..46 圖 2-6 PCR 定序條件………………………………………………48 圖 2-7 骨髓癌細胞正規合成路徑及旁支輔助路徑……………….50 圖 2-8 酵母菌中 DNA 重組………………………………………..54 圖 2-9 PCR 反應條件………………………………………………..54 圖 2-10 功能性互補示意圖………………………………………..…57 圖 3-1 牛肝氧化鯊烯環化酵素 SDS-PAGE…………………………60 圖 3-2 西方墨點法測定單株抗體對氧化鯊烯環化酵素之專一性…61 圖 3-3 七個隨機胺基酸序列胜肽庫對氧化鯊烯環化酵素第二次及第三次親和篩選 ELISA 鍵結力測試結果………………………………63 VII.

(10) 圖 3-4 (A)噬菌體 Ph.D.-C7C 胜肽庫和氧化鯊烯環化酵素 ELISA 反應結果 (B)噬菌體 Ph.D.-12 胜肽庫和氧化鯊烯環化酵素 ELISA 反應結果………………………………………………………………………65 圖 3-5 墨點法測定單一噬菌體對氧化鯊烯環化酵素親和性結果…67 圖 3-6 ELISA 方法測定單一噬菌體對氧化鯊烯環化酵素親和性結果………………………………………………………………………68 圖 3-7 西方墨點法測定單一噬菌體對氧化鯊烯環化酵素的親和性結果………………………………………………………………………70 圖 3-8 功能性互補的篩選結果示意圖……………………………74. VIII.

(11) 表目錄表 1-1 自然界中不同物種氧化鯊烯環化酵素的純化效果及特性……7 表 1-2 絲狀噬菌體的基因、蛋白質及功能介紹………………………17 表 2-1 牛肝中氧化鯊烯環化酵素的純化流程簡圖…………………..33 表 2-2 12 ％及 4 ％蛋白質電泳膠片配方……………………………36 表 2-3 rTth polymerase PCR 反應試劑的量…………………………...55 表 2-4 Taq polymerase PCR 反應試劑的量……………………………60 表 3-1 噬菌體七個胜肽庫對氧化鯊烯環化酵素第三次親和篩選得到的序列…………………………………………………………………..63 表 3-2 噬菌體胜肽庫對氧化鯊烯環化酵素進行篩選得到的序列…..72. IX.

(12) 第一章緒論 1-1 固醇類的重要性固醇類 (sterols)是環狀大分子醇類之統稱，位在大多數真核細胞中，是構成細胞膜以及生理調控上重要的脂質1。固醇類存在於動物、植物及細菌中，而且其彼此的構造十分相似，皆以四或五個環相連為主要架構，差別在於支鏈上的官能基不同。膽固醇 (cholesterol)【圖 1-1】是哺乳動物體內主要的固醇類，在 18 世紀人們已從膽石中發現了膽固醇，1816 年化學家歇爾本將這種具脂類性質的物質命名為膽固醇。膽固醇廣泛存在於動物體內，尤以腦及神經組織中最為豐富，在腎、脾、皮膚、肝和膽汁中含量也高2。在高等動物中是生物膜的重要成分，對於調節生物膜的流動性有一定意義。溫度高時，它能阻止雙分子層的無序化；溫度低時又可干擾其有序化，阻止液晶的形成，保持其流動中性。生物體內膽固醇的合成主要來自肝臟，其次在腸、腎上腺皮質及動脈管壁上產生，同時也可經由食物中攝取獲得3。膽固醇是構成細胞膜、膽汁、維生素D3、紅血球、神經組織及各種荷爾蒙的重要前趨物，也是血液中與細胞膜內運送脂肪的重要物質。膽固醇經由細胞利用後，代謝成膽酸 (cholic acid)及膽鹽，可幫助食物中脂質類的消化。所以人體內每天必須要有一定含量的膽固醇才能維持正常機能的進行4。. HO. 【圖 1-1】膽固醇的化學結構. 1.

(13) 過去的研究得知，膽固醇的運送需要與脂蛋白結合才能被送到身體各部份。輸送膽固醇脂蛋白主要有兩種，低密度脂蛋白 (low density lipoprotein, LDL)和高密度脂蛋白 (high density lipoprotein, HDL)。低密度脂蛋白膽固醇是釀成血管栓塞的罪魁禍首，被認為是“不良”的膽固醇。至於高密度脂蛋白膽固醇，因能清除血管內的膽固醇，所以被認為是“良性”膽固醇。隨著飲食習慣的改變，過量攝取的膽固醇沈積在血管中會引起動脈粥狀硬化. (Aterosclerosis) 和膽結石. (Cholelithiasis)，提高心血管疾病 (Cardioascular diseases)的發生率 5,6. ，所以目前對於如何降低體內膽固醇或者避免過多的膽固醇攝取. 量，是大家關心的課題。. 2.

(14) 1-2 膽固醇生合成在動物體內，膽固醇合成的部位在胞液及內質網，以三個乙醯輔酶 A (Acetyl-Co A)作為起始物。乙醯輔酶 A 是葡萄糖、脂肪酸及某些胺基酸等在粒線體內的分解代謝產物，經由檸檬酸循環進入胞液，當作膽固醇合成原料。經硫解酶及乙醯輔酶 A 還原酶催化，縮合成 3羥基-3-甲基戊二醯輔酶 A (beta-Hydroxy-beta-methylglutaryl coenzyme A, HMG-CoA)，生成的 3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶則在 3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶還原酶催化下，由 NADH 供氫還原生成甲羥戊酸 (Mevalonicacid, MVA)。甲羥戊酸由 ATP 提供能量，在胞液中一系列酶的作用下生成異戊烯焦磷酸酯 (3-isopenteryl pyrophosphate, IPP)。六個五碳化合物分子經一系列反應聚合生成三十碳的鯊烯 (Squalene)，鯊烯經內質網加上環化酶等的作用，環化生成羊毛硬脂醇，再經氧化、脫羧、還原等最後生成含二十七碳的膽固醇【圖 1-2】。在膽固醇的生合成中，我們所研究探討的氧化鯊烯環化酵素酵素位於在整個合成途徑中的下游，扮演著重要的角色，以下的章節將簡介此酵素的特性及重要性。. 3.

(15) 3 Acetyl-CoA. HMG-CoA. C2. C6. HMG-CoA reductase Mevalonate C6. Isoprenoid intermediate. C5. Ubiquinone. Farnesyl pyrophosphate. C15. Heme. Dolichol. Squalene C30. Squalene epoxidase 2,3-Oxidosqualene C30 Oxidosqualene Cyclase Lanosterol C30. Cholesterol. C27. plasma membrane lipoprotein. steroid hormones. bile acids. 【圖 1-2】膽固醇在動物體內的代謝途徑. 4.

(16) 1-3 氧化鯊烯環化酵素之簡介目前對於(氧化)鯊烯環化酵素的研究在生合成及藥學領域相當熱烈，因為此酵素控制著整個膽固醇生合成途徑中重要的環化反應，在動物體內藉由一步環化的步驟將原直鏈的氧化鯊烯變成具有多環的羊毛硬脂醇【圖 1-3】，希望藉由氧化鯊烯環化酵素當作目標物設計抑制藥物，可以達到降低膽固醇的效果，是目前極為重要的研究課題。. Oxidosqualene cyclase. HO O. 2,3-Oxidosqualene. Lanosterol. 【圖 1-3】動物體內氧化鯊烯環化酵素的催化反應. 在不同的物種間，(氧化)鯊烯環化酵素家族負責催化鯊烯或氧化鯊烯形成不同結構的產物，保有各物種間的專一性及演化性【圖 1-4】。在動物、真菌中，氧化鯊烯環化酵素能將氧化鯊烯轉化成羊毛硬脂醇，動物體內再經 18 個步驟反應形成膽固醇，在真菌中產生麥角脂醇 (Ergosterol) ；在高等植物和海藻中，類似的環化酵素 (Cycloartenol synthase, CAS) 將氧化鯊烯催化形成環阿屯醇 (Cycloartenol)、羽扇醇 (Lupeol)和β-香桂素 (β-Amyrin)等產物。在較低等的植物、原蟲類 (Protozoa)和細菌中，以鯊烯直接當作受質，由酵素Squalene-hopene cyclase (SHC)催化生成蛇麻烯 (Hopene)7,8。. 5.

(17) Squalene- Hopene Cyclase (SHC). Squalene. Hopene. Bacteria. 2,3-Oxidosqualene Oxidosqualene-cycloartenol cycalse. Oxidosqualene-lanosraeol cycalse. (OSC). (OSC). Cycloartenol Higher plants and Algae. Lanosterol. Fungi. Ergosterol. Animals. Stigmaster. Cholester. 【圖 1-4】自然界各物種間的(氧化)鯊烯環化酵素作用途徑由直鏈鯊烯或氧化鯊烯受質形成多環固醇或三萜類產物，整個過程僅僅為單一生合成步驟，即包含了質子化 (Protonation)、環化 (Cyclization)、重組 (Rearrangement)以及消去 (Elimination)等反應，中間牽涉超過 20 個共價鍵的斷裂及生成，這樣的一個酵素作用機制相當於在有機合成上數十個反應，所以相當令人感到好奇8。. 6.

(18) 1-3-1、氧化鯊烯環化酵素的酵素學目前的氧化鯊烯環化酵素可經由牛肝、鼠肝、猪肝中直接純化得到【表 1-1】，也可藉由基因轉殖技術藉由酵母菌(yeast)、甲醇酵母系統 (pichia pastoris)以及昆蟲表現系統 (baculovirus expression system) 等不同的系統表現蛋白質。在純化過程中，氧化鯊烯環化酵素的穩定性低以及屬於膜上蛋白質 (membrane protein)的特性，所以需要藉由介面活性劑 (detergent)和適當的鹽濃度來維持酵素活性，由於不穩定的特性增加純化上的困難度，進而影響到酵素學的研究發展。物種. 參考文獻. 酵素分子量. 比活性. 猪. 9. -. 256 nmol/hr/mg. 猪. 10. 75 kDa. 2643 nmol/hr/mg. 老鼠. 10. 78 kDa. -. 狗. 10. 73 kDa. -. 人. 10. 75 kDa. -. 老鼠. 11. 75 kDa. 436 µkat/mg. 老鼠. 12. 65 kDa. 58 pmol/min/mg. 13. 83.4 kDa. -. Cycloarten. 14. 55 kDa. 167 pkat/mg. β-香樹脂醇. 15. 35 kDa. 28µkat/mg. 脊椎動物. 真菌類酵母菌高等植物豌豆. 【表 1-1】自然界中不同物種氧化鯊烯環化酵素的純化效果及特性16. 7.

(19) (氧化)鯊烯環化酵素最先是由植物中純化出三萜類環化酵素 (cycloartenol synthase and β-amyrin synthase)14,15，研究中發現添加非離子介面活性劑Triton X-100 及在一些穩定試劑的存在下，能大幅提高酵素的活性，有效地以可溶性形式被純化得到。之後，在 1991 年首次成功地從鼠肝中純化出氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素 (Oxidosqualene-lanosterol cyclase)11，純化的倍率提高且有不錯的產率，並且得知其分子量為 75 kDa，等電點 (pI)為 5.5，對於氧化鯊烯的Km值為 55 µM。將從鼠肝中純化的氧化鯊烯環化酵素相對應的基因序列，利用基因轉殖的技術，在酵母菌Saccharomyces cerevisiae中能成功表現出 ERG 7 酵素12，並且純化出氧化鯊烯環化酵素及獲得其開放解讀序列 (open reading frame, ORF)，包括終止密碼子在內含有 2196 個核苷酸，轉譯成 731 個胺基酸序列的蛋白質，其分子量為 83.7 kDa13。一般哺乳類動物中的氧化鯊烯環化酵素分子量大小約 70~80 kDa，而在實驗室過去學長姐的努力下，成功從牛肝中純化得到單一 (single band)氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素蛋白質，其分子量約 70 kDa，酵素的純度可高達 95 ％，純化產率約 5 ％，純化得到的活性倍率較細胞微粒體時的比活性顯著增加了 700 多倍。從不同的物種來源中，直接純化酵素以及利用基因轉殖技術表現氧化鯊烯環化酵素得到的結果，可加以比較這些功能相似蛋白質間的差異性，依照其蛋白質序列間的相似性比例高低，對於探討不同物種間蛋白質結構和功能關聯性有所幫助。. 8.

(20) 1-3-2 氧化鯊烯環化酵素的反應機制不論在動物、植物或真菌中，(氧化)鯊烯環化酵素扮演在固醇類生合成途徑中最重要的環化角色。透過單一酵素催化，在不同的物種間，形成結構相似但不同的產物【圖 1-5】。. SHC. Hopene. Squalene. O. 2,3-Oxidosqualene OSC. CAS. ho. HO. Cycloartenol. Lanosterol. 【圖 1-5】 (氧化)鯊烯環化酵素產生的相異結構產物. 自從氧化鯊烯環化酵素的發現，科學家們開始探討代謝途徑中產物的結構及過渡態 (transition state)的結構，例如碳陽離子。研究得知在不同的物種間受質受到酵素作用形成不同的中間過渡態，造成化學構形不一樣，而產生不同的產物8。在動物和真菌中，產物羊毛硬脂醇和環阿屯醇的生成是經由「椅形-船形-椅形」 (chair-boat-chair)的 9.

(21) 立體構形進行環化，而形成帶正電的中間過渡態Protosteryl Cation；在高等植物和海藻中，產物羽扇醇、 β- 香桂素、達馬烯醇 (Dammaradienol)及蛇麻烯等的生合成則是由「椅形-椅形-椅形」 (chair- chair-chair)的立體構形進行環化，而形成另一種帶正電的中間態Dammarenyl Cation。目前已知這兩種不同的碳陽離子中間產物，由於立體結構不同會造成兩個不同的環化途徑，導致在不同物種演化上有明顯的差異性，也造成同樣受質環化出產物結構多樣性的原因。【圖 1-6】說明了兩種環化過程機制。就羊毛硬脂醇的生成過程而言，酵素催化過程開始是由親電子 (Electrophilic)胺基酸對受質的環氧基 (Epoxide)提供一質子化 (Protonation)反應後，在C-2 上形成第一個碳陽離子中間物，之後經過一連串雙鍵多電子的轉移，分別形成不同時期的碳陽離子中間產物，最後碳陽離子停在C-20 的位置上，形成一個四環的中間產物，再藉由連續的甲基、氫離子轉移，兩個甲基轉移由C-14 轉移至C-13 和由C-8 轉移至C-14，三個氫離子首先由C-17 轉移至C-20，接著C-13 轉移至C-17，及至最後由C-9 上的氫至C-8，以及最後一個步驟進行質子消去 (Proton Elimination)反應 (C-9 上的氫)，形成最終產物羊毛硬脂醇8。由於氧化鯊烯環化酵素進行多環的環化反應，反應過程基本上為一個連續的過程。形成一系列碳陽離子中間過渡態，酵素的結構如何穩定這些過渡態，其中 1993 年Johnson等人透過酵素受質的專一性以及立體化學提出一個模型是一直備感興趣的課題。稱為 Johnson Model17【圖 1-7】。根據模型的推論，氧化鯊烯環化酵素活性位置形成特殊的構形，酵素本身帶有負電的胺基酸經軸位釋放 (Axial delivery)與正在進行環化氧化鯊烯所形成的不同階段碳陽離子中間過渡態形成離子對 (ion pair)的型式以穩定陽離子中心。此模型可以用來解釋船形的B環結構或是以不安定的反-馬可尼可夫 (anti-Markovnikov)構形環化形成的C環，透過了軸位釋放的理論，解釋了氧化鯊烯環化酵素特殊位置的離子對作用降低每個環化過程中的活化能，以利於酵素催化反應的進行。 10.

(22) Denotes site for delivery of suitable residues system. 18. 6. 10. 15. (3S)-2,3-Oxidosqualene. 3 2. O. chair - boat - chair. chair -chair - chair Enz-AH +. 22. Enz-AH +. O 3 2. 19 18. 11. 6. 15. 10. 7. 14. 1418. 23. O. 6. 3 2. 7. 22. 1. 10 15. +. 10. HO. 13. +. 10. 13. 14. 8. 23. 19. 8. HO. 14. Dammarenyl Cation. Protosteryl Cation. 20. + H 21 12 19. +. H. 26. 23. HO. 25. H. H. 13. 11. 24. 22. 20. H. 27. 1. 9. Dammaradienol. Dammarenyl Cation. HO. 16. 14. 2 10 H 5. 3. 8. 4. 15 30. 7. HO. Protosteryl Cation. 6. +. 29 28. HO. Baccharenyl Cation 21 21 20. 22. 12. 1 10 5. 8. H. 4. 3. 30. 7. HO. 9. 19. 2. 15. Lupenol. 25. +. 27. H 1. 10 5. +. 4. 7. HO. 16. 14 8. 15 30. HO. Lupenyl Cation. 6. 6. HO. 26. 13. 11. 16. 14. +. 23. 12. 25 27. 2 3. 24. 13 9. 24. 20. 23. 11. 19. 22. 29 28. 29 28. OSC. H. H. +. H 21 20 12. HO. 26. 23. 18. 9. 3. 4. 7. HO. α -Amyrin. 9. 16. 14 8. 10. 15 30. 8. 20. 3. HO. 12. 6 29 28. HO. 19. 2 10 5. Oleanyl Cation. 25 27. 19. H. 20. 24. 13. 11 1. 22. Lanosterol. Cycloartenol. 13. H HO. β -Amyrin. 【圖 1-6】 (氧化)鯊烯環化酵素環化反應機制及產物多樣性. 11.

(23) 【圖 1-7】 Johnson Model。Johnson 等人提出 C-4，C-10，C-8，C-13， C-20 等碳陽離子，可以透過適當的軸位負電荷胺基酸使其穩定。. 12.

(24) 1994 年Poralla等人利用Poteolysis和溴化氰 (Cyanogen bromide, CNBr)等蛋白質消化方法，成功的對鼠肝作一級結構的定序，發現酵素Q-W motif區域對於氧化鯊烯環化酵素催化功能上具有重要影響 13. ，由於Q-W motif為疏水性 (hydrophobic)的芳香環胺基酸 (aromatic. amino group)所組成，因此推斷Q-W motif主要是利用碳陽離子與高電子密度雙鍵之間的作用力 (π-cation interaction)來達到穩定碳陽離子過渡態的效果，而非透過正負電子離子對的形成，稱為Q-W motif理論或芳香環理論 (Aromatic Hypothesis)【圖 1-8】。其中氧化鯊烯環化酵素上的芳香環及帶有負電的側鏈，可以穩定帶正電性的過渡態中間產物；另一方面，這些非極性的芳香環氨基酸 (Trp、Phe、Tyr)，對於受質疏水性結構有很合理的解釋，這是目前大家共同認同的理論。. AH. +. N H. O. 6. 3. 2. 7. 22 11 10. 15. 14. 19 18. 【圖 1-8】 Q-W motif 理論的模型示意圖. 13. 23.

(25) 由前面的簡介，得知氧化鯊烯環化酵素的重要性及其扮演的角色，加上先前實驗室的研究，對於氧化鯊烯環化酵素不同的胺基酸進行改變之後，其酵素功能或者結構上具有重大的影響，所以氧化鯊烯環化酵素進行環化過程和酵素本身的結構具有很大的關係。綜合以上，以生物的觀點而言，在不同的物種之間氧化鯊烯環化酵素家族催化同樣的受質鯊烯或者氧化鯊烯，循不同的反應路徑，形成許多相似卻不相同的中間產物，最後造成代謝產物的不同，這在生物體間的演化上具有一定的意義；以化學的觀點而言，要將一個直鏈狀的反應物環化成四或五個環的產物，需要許多的步驟。對於這類具有複雜性 (Complexity)、效率 (Efficiency)，以及立體選擇性 (Stereo-selectivity) 的環化酵素，值得我們去探討研究。. 14.

(26) 1-4 噬菌體表現系統之簡介絲狀噬菌體展示系統 (filamentous phage display system)是由 George Smith等人於 1985 年所發展的一套基因表現系統18。將目標基因連接於絲狀噬菌體f1 外殼蛋白pⅢ 或pⅧ 基因 (gⅢ或gⅧ)的N 端或C端，藉由噬菌體感染大腸桿菌 (Escherichia coli)開始進行複製，使目標基因以融合蛋白 (fusion protein)的形式表現於重組噬菌體 (recombinant phage)表面。發明此項技術最大的特點就是將基因以及其蛋白質產物集中在一個重組噬菌體上，並且可以透過感染大腸桿菌的過程輕易的複製目標基因以及蛋白質。絲狀噬菌體包括M13 、fd 、f1 等，屬於潛溶性 (lysogenic)的病毒，在複製的過程中，不會分解或殺死宿主，因此可以複製大量的噬菌體，其生命週期如【圖 1-9】19。. 【圖 1-9】噬菌體感染大腸桿菌的生命週期. 15.

(27) 這類的噬菌體只會感染帶有Fertility因子 (F factor)的大腸桿菌，其pⅢ 蛋白質上的N2 區域和宿主上的F纖毛 (F pilus)鍵結之後，可以增加pⅢ 蛋白質上N1 區域跟宿主的Tol A蛋白質作用，進而感染宿主，但當N2 缺乏時噬菌體則無法感染宿主【圖 1-10】20-23。感染後，噬菌體將其單股DNA導入E. coil細胞中，單股DNA利用宿主的酵素作用合成雙股 DNA ，而形成具有複製能力且能表現的雙股 DNA (replicative form, RF)，然後以滾環模式複製 (rolling circle replication) 出子代單股DNA，此單股DNA會和pⅤ蛋白質先形成複合物之後，在突破寄主時，pⅤ蛋白質將被其他的外殼蛋白所取代，各種外殼膜蛋白質跟單股DNA組合起來產生新的噬菌體。. 【圖 1-10】絲狀噬菌體 pⅢ感染大腸桿菌過程絲狀噬菌體的直徑約 6.5 nm，長約 930 nm，分子量約 16.3 MD24。噬菌體的複製過程中包含十種蛋白質，擔任組成、DNA複製以及外殼形成的工作。外殼蛋白主要由 2700 個pⅧ蛋白質所組成，其次由pⅢ、 pⅥ、pⅦ、pⅨ的蛋白質構成【圖 1-11】。. 16.

(28) pⅧ. pⅢ pⅥ. pⅦ pⅨ. 【圖 1-11】絲狀噬菌體結構示意圖. 絲狀噬菌體表現系統用來表現外來蛋白質的主要有pⅢ 與pⅧ兩種。在不影響噬菌體組裝及感染的情況下，pⅢ 蛋白質可以表現約 50 kDa的融合蛋白質而pⅧ 只能負載 8-9 個氨基酸25。由於pⅢ 蛋白質的分子較少，表現出來的融合蛋白質相對也較少，所以適合篩選出與目標物具有親和力 (affinify) 的片段；相對的，pⅧ 蛋白質的分子數量較多，所以適合用來篩選較具有結合力 (avidity)的片段。其他的部位也被研究來表現出融合蛋白，但有些困難或者不可行，【表 1-2】絲狀噬菌體的基因、蛋白質及功能介紹19。. 【表 1-2】絲狀噬菌體的基因、蛋白質及功能介紹。a代表已經成熟完整蛋白19。. 17.

(29) 1-5 噬菌體表現系統的型式噬菌體表現外來蛋白的型式有兩種，如【圖 1-12】23。一種是病毒載體 (Viral vector)直接將欲表現的蛋白基因接入gⅢ 或gⅧ 的基因中，分別產生出的皆為重組過的pⅢ 或pⅧ 蛋白質。另一種系統就是噬菌質體 (phagemid)，此載體沒有辦法重新組裝噬菌體或者根本無法感染大腸桿菌，藉由透過輔助噬菌體 (helper phage)26提供正常功能的蛋白及其他組裝蛋白，才能使重新組噬菌體能夠組裝而且具有感染能力。這兩種系統表現出來的蛋白質之數量也有所不同，前者以多價 (polyvalent)的型式呈現，適合鍵結力較弱的篩選；後者以單價 (monovalent)的型式呈現，適合篩選親和力較強目標分子。. (A). (B) phagemid. Viral vector. Helper virus. Sequence of interset Sequence of P3. drug. E. coli. E. coli. 【圖 1-12】噬菌體表現外來蛋白質的兩種型式。(A)為病毒載體型式，(B)為噬菌質體型式，需要輔助噬菌體的幫忙。. 18.

(30) 另一種成功的展示噬菌體的技術為selectively infective phage，簡稱SIP23,27-29。這技術的發展是由於發現到pⅢ蛋白是由三個區域所構成的(N1、N2 以及CT)，其中N1 區域和感染力有關，N2 區域是和F-pilus 及一些增進感染力之噬菌體 (phage)的特殊辨識有關，CT區域是外套的一部份，主要和噬菌體的型態有關，如【圖 1-13】：當N1 區域及 N2 區域和抗原基因融合，以及CT區域和抗體重組融合，藉由抗體和抗原互相結合，可以使得pⅢ 的功能恢復，而利用此方式進行噬菌體展示系統時可以提高表現量，SIP不論在生物體 (in vivo)或試管中 (in vitro)都適用。SIP比傳統的噬菌體展示系統較好，第一是此方式在進行篩選時速度會比普通的快，第二是此法可以藉由修飾不同的外套蛋白來使噬菌體表現更多種不同形式的蛋白，也就是可以同時表現兩種以上的外來蛋白。. 【圖 1-13】 SIP技術示意圖23。. 19.

(31) 1-6 噬菌體胜肽庫 (peptide library)及抗體庫 (antibody library) 噬菌體表現胜肽庫 (peptide library)及抗體庫 (antibody library)為目前最常被廣泛使用的兩種基因庫 30 。噬菌體抗體庫是 1990 年 McCafferty等人31利用單株抗體的基因以RT-PCR方式選殖出來，藉由噬菌體展示技術，將 anti-lysozyme 抗體的重鏈及輕鏈變異區 (VH/VL)，用具有彎曲性的連接片段 (flexible linker)接到載體上，以單鏈變異區片段的方式 (single chain Fv, scFv) 表現於噬菌體上，由於這是模擬抗體的結構，所以稱為噬菌體抗體 (phage antibody)。隨後在 1991 年Hoogenboom等人32也發表了以同樣的方法在噬菌體上表現抗體變異區片段 (Fab)。而第一個噬菌體表現的抗體基因庫是由 Clackson等人建構33，他們利用抗原免疫小鼠，設計引子將小鼠中所有的抗體基因以RT-PCR的方式選殖出來，再藉由噬菌體抗體技術表現成噬菌體抗體庫。根據這樣的技術目前已成功的製造出人類噬菌體抗體庫，並且從中篩選出對人類腫瘤細胞具有專一性的抗體應用於腫瘤治療上。此項技術不但能夠找出單株抗體或是多株抗體在抗原分子上的結合位置，很多人也應用在辨認醣類或是核酸序列，也能夠模擬出抗原特殊結構來被抗體所辨認，稱之為類比位 (mimotope)。另一種常用的表現系統為噬菌體胜肽庫 (peptide library)，1990 年Devlin等人34，他利用十五胜肽隨機的序列，將其表現在噬菌體M13 7. pⅢ外殼蛋白上。噬菌體胜肽庫的多樣性約 2 × 10 ，並且利用在篩選 streptavidin 蛋白質上，篩選出 His-Pro-Gln 的胜肽序列是會和 streptavidin蛋白質有很好的親和力，讓篩選的應用更廣，除了抗體篩選外多了一種篩選的選擇。噬菌體基因庫可以用來篩選和蛋白質、核酸、小分子化合物、細胞或者是組織器官等有親合性的胜肽序列。胜肽序列的大小範圍很大，表現較少胜肽可以用來篩選抗原鍵結的活性區域，而表現較多胜肽則提供構形上的變化，作為結構辨識的篩選。. 20.

(32) 1-7 噬菌體表現系統篩選方式噬菌體表現系統的篩選方式也分兩種，一種是試管篩選 (in vitro selection)，利用將目標物固定在特殊管柱或是酵素連接免疫吸附分析法 (ELISA)專用盤子中35，然後加入噬菌體基因庫，讓具有親和力的噬菌體結合到目標物上，洗去多餘的部分後再從目標物上回收具有親和力的噬菌體【圖 1-14】，這樣的篩選過程叫做Biopanning。事先將目標物固定在ELISA盤子上，再將固定量噬菌體胜肽庫放入盤中和目標物進行鍵結作用，經過數次洗滌將不具鍵結作用的噬菌體洗去，再將具有鍵結作用的噬菌體利用緩衝液沖洗下來進行感染放大的過程，這樣重複的篩選可以得到鍵結力較強胜肽序列。此外，在 1996 年Pasqualini等人將噬菌體基因庫，以靜脈注射的方式打到小鼠體內，再從身體各處回收相關的噬菌體，這種在生物體內篩選的方式稱為體內篩選 (in vivo selection)36，開創了另一種噬菌體篩選的方式。 Phage Target. Washing. Binding. Biopanning. Elution Infection and Amplification 【圖 1-14】在 ELISA 盤子上篩選過程的示意圖. 21.

(33) 1-8 研究動機與目的近年來膽固醇一直是心臟病、血管動脈硬化的主要元凶，除了控制飲食，可以降低膽固醇的攝取外，針對血液中過高的膽固醇含量，就目前而言主要是 statins 類藥物，這一類藥物的機制為抑制乙醯輔酶 A 還原酵素 (HMG-CoA Reductase)，使內生性膽固醇減少，達到抑制膽固醇的效果。但這一類的藥物並不適合所有病人使用，且降低心臟病風險的比率只有 20 ％～40 ％。此外，一些遺傳原因導致的高膽固醇病變以及其他特殊的病人皆不能使用。而且在膽固醇的生合成途徑中，statin 這類的藥物也影響了其他非固醇類物質的生合成，如攜帶鐵離子的血基質 (Heme)，為體內氧氣來源，以及和糖類分解有關多萜醇 (Dolichol)和電子轉移有關的泛醌 (Ubiquinone)等，導致體內缺乏影響其他生理功能。因此，實驗目標是想設計同樣具有效用且安全的新型藥物，藉由抑制氧化鯊烯環化酵素的活性來降低膽固醇的生成，另一方面，由於氧化鯊烯環化酵素位於整個膽固醇生合成途徑中的下游，對於其他的二級代謝產物的產生較不造成影響，可降低其副作用。且氧化鯊烯環化酵素亦存在於真菌中，已經有很多的研究指出氧化鯊烯環化酵素的抑制劑，對於真菌生長也具有抑制效果，這類的抑制劑可發展成抗真菌. (antifungal)的藥物37。過去的研究成功利用噬菌體胜肽庫作體內篩選 (in vivo selection). 方式，篩選出對腫瘤細胞有作用的胜肽序列38：Asn-Gly-Arg (NGR)38 能專一性的結合到人類乳癌腫瘤 (human breast carcinoma)、卡波西氏瘤 (Kaposi’s sarcoma) 與老鼠黑色素瘤 (mouse melanoma) ；而 Gly-Ser-Leu (GSL)則是由乳癌腫瘤、卡波西氏瘤和惡性黑色宿瘤 (malignant melanoma)得到的胜肽序列。Wadih Arap等人38在1998年發表在Science期刊上，利用上述篩選到的序列作為抗癌藥物的攜帶者，能有效的將藥物帶到腫瘤細胞上達到治療的效果。這樣的胜肽藥物正 22.

(34) 被大量開發，由於其分子量小，不但能有效的躲過體內免疫反應的攻擊，也可以達到好的穿透效果，以達到最佳的療效。因此我們希望利用噬菌體胜肽庫篩選對氧化鯊烯環化酵素有專一性的胜肽序列，可發展成為抑制膽固醇的藥物或者抗菌劑，另一方面也能作為各種藥物的攜帶者，能提高藥物的專一性達到更好的治療效果。除了藥物治療外，有文獻指出39利用噬菌體抗體庫篩選出專一性抗體去穩定蛋白質的結構，透過co-crystallizing的方法解出膜蛋白的結構。若能篩選出穩定蛋白質結構之胜肽序列，就能如法炮製培養牛肝氧化鯊烯環化酵素的單晶，透過X光繞射技術，解析出牛肝中氧化鯊烯環化酵素的晶體結構，對於反應機制及環化功能可有更進一步的直接證明。文獻指出，利用噬菌體胜肽庫對Rhizomucor miehei lipase蛋白質進行篩選所得到的專一性胜肽序列，做成純化蛋白質的親和性管柱，藉由管柱層析純化大量蛋白質40。由於目前實驗室純化此酵素的方法較為複雜且耗時，而所得到的產率不高，得到的純度不定，所以如果可以藉由具有專一性胜肽序列做成親和性管柱，將可達到快速純化並且提高產率。除了用此方法解決純化問題外，經由基因轉殖的技術，過去本實驗室將牛肝得到的酵素基因殖入酵母菌內，並且能成功的表現出活性並建立一套篩選方式。藉由這樣的酵母菌表現系統 (yeast expression system)表現接有 6 個Histidine的氧化鯊烯環化酵素，解決純化問題。本論文的研究目的希望透過噬菌體胜肽庫，在酵素連接免疫吸附分析法專用盤進行試管篩選 (in vitro selection)，挑選出跟牛肝氧化鯊烯環化酵素具有親和力的胜肽序列，對於酵素具有抑制性，未來可以當作藥物，並且透過墨點法 (dot blot)、西方墨點法 (western blotting) 及酵素連接免疫吸附分析法 (ELISA)監測其鍵結力及測定其專一性。. 23.

(35) 第二章實驗材料及方法實驗材料 2-1 實驗藥品 Ph.D.-C7C 以及 Ph.D.-12 Phage Display Peptide Library Kit 限制酶酵素以上皆購自於 New England Biolabs ABTS Benzamidine Bovine Serum Albumin (BSA) N-bromosuccinimide (NBS) Diaminobenzidene (DAB) Lanosterol (LA) Phenylmethylsufonyl fluoride (PMSF) Silver nitrate Triton X-100 (TX-100) 以上皆購自於 Sigma。 Acetic acid Coomassie Billiant R250 Dichloromethane Di-potassium hydrogen phosphate (KPi) EDTA·Na2 Ethanol (95% and 99%) Ether Ethyl acetate (EA) Hydrochloric acid 37% 24.

(36) Hexane Hydroxylamine 50% (HA) Isobutanol Methanol Nitrobenzene N,N-dimethylacetamide Potassium chloride Potassium carbonate Sodium carbonate Sodium sulfate 以上皆購自於 Merck。 Glycerol Tris-(hydroxymethyl) methylamine 以上皆購自於 BDH。 Acrylamide Dithiothreitol (DTT) ECL western blotting detection reagent N,N’-Methylene-bis-acrylamide Millipore polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Nitrocellulose (NC) membrane Q-Sepharose Fast Flow Gel HiTrap Heparin column 以上皆購自於 Amersham Pharmacia Biotech。 Hydroxyapatite HT Gel 以上購自於 Bio-Rad。 Ammonium persulfate (APS) 25.

(37) Sodium dodecylsulfate (SDS) 以上皆購自於 Gibco BRL。 BCA Proteins Assay Kit 以上購自於 Pierce。牛肝 (Bovine Liver) 取自台中肉品屠宰場，並保存於 -80 °C 冰箱中。. 26.

(38) 2-2 緩衝液及溶液配置 Homogenization Buffer I (HB I)，pH 7.4：含有100 mM Tris-base、1 mM EDTA-Na2、1 mM DTT、1 mM Benzamidine及40 µg /mL PMSF。 Homogenization Buffer II (HB II)，pH 7.4：含有20 mM Tris-base、1 mM EDTA-Na2、1 mM DTT、1 mM Benzamidine及40 µg /mL PMSF。 Ion Exchange Buffer (IEB)，pH 7.4：含有20 mM Tris-base、1 mM EDTA-Na2、1 mM DTT、1 mM Benzamidine，40 µg /mL PMSF及0.5% TX-100。 Hydroxyapatite Buffer (HAB)與 Heparin Buffer (HB)，4 L，pH 7.4，含有 5 mM KPi (磷酸氫二鉀)、1 mM DTT 及 0.5% Triton X-100。膠片染色液(0.1% Coomassie blue R-250 Stain Solution)：取 1 g 的 Coomassie brilliant blue R-250，溶於 400 mL 的甲醇中，再加入 100 mL 的醋酸，加二次水至體積為 1 L。脫色溶液 I (Destain Solution I)：將甲醇 400 mL 與醋酸 100 mL 混合後，加二次水至體積為 1 L。脫色溶液 II (Destain Solution II)：將甲醇 50 mL 與醋酸 70 mL 混合後，加二次水至體積為 1 L。 TLC 染劑 (酵素活性測試用)，500 mL：含有 5% 濃硫酸 (H2SO4)、5% p-Anisaldehyde及 90% 酒精。. 27.

(39) LB 培養液每升加入 10 g Bacto-Tryptone、5 g yeast extract 以及 5 g NaCl IPTG/Xgal 取 1.25 g IPTG (isopropyl β-D-thiogalactoside) 及 1 g Xgal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside)溶於 25 ml Dimethyl formamide 避光存於-20 ℃ LB/IPTG/Xgal 培養基每升 LB 培養液加入 15 g agar 高溫滅菌後等到溫度低於 70 °C 再加入 1 mL IPTG/Xgal，避光存放於 4 °C Top Agarose 每升加入 10 g Bacto-Tryptone、5 g yeast extract、5 g NaCl、1 g MgCl2‧6H2O以及 7 g agarose高溫滅菌 Tetracycline 每毫升取 Tetracycline 20 mg 以 Ethanol 溶解，避光存於–20°C LB-Tet 培養基每升 LB 培養液加入 15 g Agar 經過高溫滅菌後等冷卻至 70 °C 以下再加入 1 mL Tetracycline 避光存放於 4°C 覆蓋液 (Blocking buffer) 配置 5 mM KPi buffer，5 mg/ml BSA以及 0.02% NaN3過 0.22 µm filter並存放於 4°C TBS 緩衝液 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)， 150 mM NaCl 滅菌置於室溫 PEG/NaCl 20% (w/v) polyethylene glycol–8000，2.5 M NaCl 滅菌置於室溫 28.

(40) ABTS 呈色劑取 22 mg ABTS溶於 100 mL的 50 mM sodium citrate (pH 4.0)中過 0.22 µm的filter置於 4 ℃。每次反應取 21 mL的ABTS溶液加入 36 µL 30％的H2O2 DAB 呈色劑取 2.5 mg DAB溶於 50 µL DMSO中，加入 3 mL的TBS緩衝液以及 5 µL的 30％ H2O2 Potassium phosphate 緩衝液 (pH 6.0) 取 132 mL 1 M 132 mL of 1 M K2HPO4及 868 ml of 1 M KH2PO4 調製pH為 6.0 存於室溫 Ampicillin (100 mg/mL) 將 Ampicillin 溶於二次去離子水，再用 0.2 µm 濾膜過濾，儲存於 -20 ℃。 SD 培養液 0.17% yeast nitrogen base，0.5% ammonium sulfate，2% glucose ALTHMU 培養基 0.17% yeast nitrogen base，0.5% ammonium sulfate，1.5% agar (固體培養基)，經高壓滅菌後加入 2% 50X ALTHMU，2% glucose， 1M sorbitol (於進行電穿透作用時使用) YPD 培養基 1％ yeast extract，2％ peptone，2％ dextrose (glucose)經高壓滅菌存於 4 ℃. 29.

(41) MGYH 培養基 1.34％ YNB，1％ glycerol，4 × 10-5％ biotin，0.004％ histidine 高溫滅菌後存放於 4 ℃ BMGY 培養基 1％ yeast extract，2％ peptone，100 mM potassium phosphate (pH 6.0)，1.34 ％ YNB，4 × 10-5％ biotin，1％ glycerol高溫滅菌後存放於 4 ℃ Transfer 緩衝液 25 mM Tris-HCl, pH 8.3、192 mM glycine、0.1％ SDS、 20％ methanol. 30.

(42) 2-3 實驗儀器均質機 (Brinkmann) 高速離心機 (Allegra 21 Series, Beckman) 超高速離心機 (Sorvall RC 5C) 微量旋轉式真空濃縮機 (Spin Vaccum, SAVANT) 紫外光/可見光光譜儀 (Amersham Pharmacia) 超過濾裝置 (Ultrafiltration System, Amicon) 微盤光譜分析儀 (Fusion Universal Microplate Analyzer, Packard) PCR (Perkin Elmer, GeneAmp PCR System 9700) 電泳槽 (Amersham Pharmacia) 西方墨點法轉印槽 (TE 70, Amersham Pharmacia). 31.

(43) 2-4 菌株及質體菌株 XL1-Blue 大腸桿菌之一株，購自於 Stratagene 公司。 TKW14C2 為實驗室所研究出不含有 OSC 功能的酵母菌，其 erg 7 基因被剔除。生長條件除了要給予 ALTHMU 外還需要 Erg 及 Heme。 GS115 購自於Invitrogen生物科技公司。Pichia pastoris的一種，基因型＋. 態為his4，表現型為Mut ，其生長條件需要額外加入Histidine 載體 pPICZαA 購自於 Invitrogen 生物科技公司。載體 pPICZαA 是一種可於 Pichia pastoris 菌株中表現重組或突變之真菌基因的載體。此載體可將表現的蛋白質外吐於細胞外。 pRS314 購自於 New England BioLabs 公司。載體 RS313 是一可穿梭於酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae)和大腸桿菌 (E.coli)間之穿梭載體 (Shuttle Vector)。 96gⅢ 引子購自於 New England BioLabs 公司。序列 5´- CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG –3. 32.

(44) 實驗方法 2-5 牛肝中氧化鯊烯環化酵素之純化取約 500 克的牛肝，加入緩衝液後攪碎 ↓ 高速離心 (12,000 rpm)去除組織及雜質 ↓ 超高速離心 (40,000 rpm)分離得到細胞微粒體 (microsomes) ↓ 加入緩衝液後進行均質化 (Homogenize) ↓ 利用介面活性劑 (Triton X-100)將細胞膜上蛋白質溶解至溶液中 ↓ 超高速離心得到蛋白質粗萃取液 (crude extract) ↓ 依序進行管柱層析法 (Column Chromatography)純化 (1) Q-Sepharose Fast Flow 管柱層析 (2) Hydroxyapatite 管柱層析 (3) HiTrap Heparin 管柱層析 ↓ 進行蛋白質 SDS-PAGE 及 BCA Assay 分析酵素的分子量大小與濃度 ↓ 分裝成 400 µL，置於 -80°C 下保存. 【表 2-1】牛肝中氧化鯊烯環化酵素的純化流程簡圖. 33.

(45) 2-5-1 溶解微粒體 (Microsome) 由 -80 °C 冰箱中取出牛肝約 500 克，置於 4 °C 冰箱中解凍隔夜；以 HB I 緩衝液清洗，將肝切成小方塊狀後，以牛肝與 HB I 緩衝液為 1 : 2 的體積比例打碎，每攪打 30 秒鐘即冰浴冷卻 10 秒鐘，持續直到溶液中無塊狀物存在；之後在 4 °C 下以轉速 12,000 rpm 離心 35 分鐘，取出上清液 (supernatant)後將沈澱物丟棄，在 4 °C 下以轉速 40,000 rpm 超高速離心 1 小時 10 分鐘，收集細胞微粒體 (microsomal pellets) 【表 2-1】。. 2-5-2 粗萃取液 (Crude Extract) 將所有細胞微粒體沈澱物溶於 100mL 的 HB II 緩衝液，並置於冰浴中；以均質機轉速 20,000 rpm 將微粒體沈澱打散；再加入總濃度為 0.5 % 的 Triton X-100 和 1 mM DTT，在 4 °C 下以磁石攪動至少 1 小時；最後在 4 °C 下以 40,000 rpm 超高速離心 1 小時 10 分鐘，收集上清液。. 2-5-3 Q-Sepharose 陰離子交換管柱層析將上清液通入體積為 80 mL Q-Sepharose Fast Flow 陰離子交換樹脂管柱中。先以 300 mL 的 IEB 緩衝液來平衡管柱中的 Q-Sepharose 陰離子交換樹脂；再將粗萃取液導入，同時開始收集流出物 (Flowthrough)；之後利用 IEB 緩衝液沖洗，將無法與樹脂結合的蛋白質沖洗出。接著分別以含有 20 mM、50 mM 、70 mM 和 100 mM 等四種鹽梯度氯化鉀 (KCl)濃度緩衝液沖提，以每管 10 mL (約 800 滴) 收集。收集完畢後分別取樣做酵素活性測試和蛋白質濃度測量，將具有活性且蛋白質濃度較高的部分收集起來。經由透析 (Dialysis)方式除去鹽類並且進行緩衝溶液的交換 (HAB 緩衝液, pH 7.4)，第一次透析約 4 ~ 6 小時，第二次則放置隔夜；之後利用超過濾法 (Ultrafiltration) 34.

(46) 濃縮溶液至剩餘體積約 30 mL。. 2-5-4 Hydroxyapatite Gel 管柱層析先以 50 mL Hydroxyapatite Gel 填充樹脂以 2 倍體積的 HAB 緩衝液平衡管柱。注入上述經離子交換樹脂所得的樣品，同時收集流出物 (Flowthrough)；再以 500 mL 的 HAB 沖提，每管收集 5 mL (約 400 滴) 收集。收集完後將每管取樣做酵素活性測試和蛋白質濃度測量，具有活性且蛋白質濃度較高的部分收集起來，濃縮溶液至剩餘體積約 30 mL。. 2-5-5 HiTrap Heparin 管柱層析先以 20 mL HiTrap Heparin 填充樹脂體積的 HB 平衡管柱。將上述所得 Hydroxyapatite 管柱所得的樣品導入，同時收集流出物 (Flowthrough)；以 80mL 的 HB 緩衝液沖洗，將無法與樹脂結合的蛋白質先沖出，同時收集流出物 (Wash)。之後分別以 50 mM、100 mM 和 1 M 三種不同氯化甲 (KCl)鹽梯度的緩衝液沖提，每管收集 2 mL (約 200 滴)收集。收集完畢後分別取樣做酵素活性測試、蛋白質濃度測量與 SDS-PAGE 蛋白質電泳分析。. 2-5-6 酵素的分子量及純度分析利用 SDS-PAGE 分析酵素的分子量及純度。配置 12 ％ SDS-PAGE 電泳膠片【表 2-2】，取出純化之蛋白質溶液與樣品緩衝液以 4：1 的體積比例混合，在 95 °C 水浴下加熱 10 分鐘後，注入於膠片上端的樣品凹槽內。先固定以 90 伏特的電壓進行電泳，當染劑 (Dye)到達 separating gel 層後，再將電壓增加到 120 伏特，在 running buffer 環境下通電壓約 1 ~ 1.5 小時，待染劑至膠片底端後即完成。以膠片染色液 ( 0.1 % Coomassie blue R-250)染色約 30 分鐘後，再以脫 35.

(47) 色溶液 I (Destain Solution I)去除染色約 20 分鐘之後，再改浸漬於脫色溶液 II (Destain Solution II)，直到膠片的藍色背景完全去除而呈現透明狀為止。 12 % Separating gel 30 % acrylamide / 1 % bis-acrylamide. 8 mL. 1.5M Tris-buffer (pH8.8). 5 mL. 20% SDS. 100 µL. dd H2O. 7 mL. 10% APS. 100 µL. TEMED. 10 µL. Total Amount. 20 mL. 4 % Stacking gel 30 % acrylamide / 1 % bis-acrylamide. 1.3 mL. 1M Tris-buffer (pH6.8). 1.25 mL. 20% SDS. 50 µL. dd H2O. 7.35 mL. 10% APS. 50 µL. TEMED. 10 µL. Total Amount. 10 mL. 【表 2-2】 12 ％及 4 ％蛋白質電泳膠片配方. 36.

(48) 2-5-7 酵素活性測試氧化鯊烯環化酵素的活性測試 (OSC Activity Assay)，是由觀察產物的生成與否，以判斷酵素是否具有活性的方法。取 2 µL 的 10 µM受質氧化鯊烯 (OS)至微量管 (eppendorf tube)中，加入 200 µL 蛋白質溶液，混合均勻後置於溫度 37 °C下進行反應 (Incubation) 2 小時以上。加入EtOH / H2O = 9 / 1 的酒精溶液 200 µL，於 70 °C下加熱 20 分鐘以中止反應後，再加入 400 µL (等體積)的二氯甲烷 (CH2Cl2)以萃取反應物，將混合液經劇烈振盪 30 秒鐘後，離心 5 分鐘，將其水層 (上層)轉移至新的微量管之後，再重複進行一次萃取過程。把兩次萃取所得的有機層收集在一起，以真空濃縮機乾燥溶劑；再加入 50 µL CH2Cl2 ，藉由薄層液相管柱層析 (Thin-layer liquid chromatography, TLC)，以毛細管把樣品點在TLC玻璃片上，以EA / Hexane = 1 / 4. (20. % EA , v/v) 為比例的展開液展開，浸漬於TLC染劑 (stain solution)數秒鐘，於加熱板 (hot plate)上加熱並觀察結果。如【圖 2-1】所示，具有活性的酵素溶液經過反應後，在TLC片上與標準物羊毛硬脂醇 (LA)相同的位移距離 (Rf)，會出現一明顯的紫色色點；相對地，若不具有活性的酵素反應，則僅會有受質OS的綠色色點存在。. 【圖 2-1】. TLC 活性測試示意圖. (1：OSC 無活性，2：LA 標準物，3：OSC 具有活性) 37.

(49) 2-5-8 酵素濃度分析對於蛋白質濃度測定採用的方式是 BCA. (bicinchoninic acid). Assay ， BCA Assay 類似於 Lowry 反應，但是以 BCA 試劑取代 Folin-Cocalteu 試劑，在鹼性環境下藉由蛋白質可使二價銅離子還原成為一價銅離子，而兩個BCA分子則會與一價銅離子形成錯合物，在波長 562 nm下產生明顯的紫色，以吸收值的大小判斷溶液中蛋白質濃度的多寡。取出蛋白質溶液樣品 25 µL於 96-well ELISA plate 之中，加入已混合均勻的BCA試劑 200 µL (Reagent A / B = 50 / 1 的比例)，避光置於 37 °C下反應 30 分鐘，測量溶液在波長 560 nm時的吸收值變化；同時，先配置好 2 mg/mL、1.5 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL及 0.125 mg/mL六個不同濃度的BSA標準溶液在同樣的反應條件下，得到的吸收值可定出一線性的標準曲線 (linear standard curve)，將樣品吸收值以內插法的方式，換算為對應的蛋白質濃度。. 38.

(50) 2-6 Ph.D.-C7C 及 Ph.D.-12 對牛肝鯊烯環化酵素的親和篩選 Ph.D.-C7C (E8120S)及Ph.D.-12 (E8110S)噬菌體胜肽庫由New England Biolabs (NEB)公司購入。主要將隨機合成的DNA序列表現在 M13 的非主要外殼蛋白質 pⅢ 的N端上。Ph.D.-C7C噬菌體胜肽庫的隨機 7 胜肽前後各接有 cystenine可以藉由雙硫鍵連接 (disulfide cross-link)一起，形成一個特殊環狀 (loop)構形，表現隨機胜肽多樣 9. 性約 1.28 × 10 ；Ph.D.-12 噬菌體胜肽庫表現直鏈狀的胜肽，多樣性 9. 約 2.7 × 10 。12 個胜肽序列跟 7 個胜肽序列的噬菌體基因庫相比，較長且有較高的多樣性，在鍵結篩選上較有機會篩選到具有親和力的胜肽序列；7 個胜肽的噬菌體基因庫，在隨機胜肽序列前後含有 2 個 Cysteine可以藉由雙硫鍵連接 (cross-link)在一起，形成一個特殊的環狀 (loop)結構，可以用來篩選辨認具有結構的目標物，過去的研究也發現這種具有特殊結構的噬菌體胜肽庫，可以用來分辨D-amino acid 這類具有鏡像異構物的結構。實驗利用ELISA plate作為篩選工具，進行試管中 (in vitro)篩選，篩選流程如【圖 2-2】所示，將 1012 pfu/mL的噬菌體胜肽庫先對BSA 蛋白質進行負向篩選，再將未和BSA蛋白質結合的噬菌體放入well中和氧化鯊烯環化酵素進行親和反應，經由清洗、elution及感染放大後，重複這樣的步驟循環數次，可得到對氧化鯊烯環化酵素具有鍵結力的噬菌體胜肽，過程中每次循環放大的噬菌體皆進行效價測定及親和力分析，親和力的分析主要利用墨點、，詳細步驟如下所描述。 12. 39.

(51) Phage(1011pfu/mL) BSA Negative selection Target. washing. binding. Phage titering Affinity Dot blot ELISA Assay Western blotting. elution Infection and Amplification. 【圖 2-2】噬菌體胜肽庫篩選示意圖. 2-6-1 牛肝鯊烯環化酵素之製備將牛肝中純化出來的氧化鯊烯環化酵素以 5 mM KPi buffer 配製成濃度為 100 µg/mL，另外將負向控制組(Negative control)的 BSA 蛋白質，濃度配置成 5 mg/mL 各取 150 µL 加入 ELISA plate well 中，置於 4 ℃下隔夜。. 40.

(52) 2-6-2 負向親和篩選 (Negative selection) 將放置隔夜之BSA 蛋白質倒掉，以TBS緩衝液沖洗之後，將 ELISA plate倒置拍打將well中的水分去除，重複三次後，取 10 µL 2×1011 pfu/µL之Ph.D.-C7C/ Ph.D.-12 噬菌體胜肽庫與 90 µL的TBS緩衝液混合，加入well中進行篩選，在室溫搖動混合一小時候後，取上清液到欲篩選的蛋白質well中進行第一次親和篩選。. 2-6-3 第一次親和篩選將放置隔夜之ELISA plate中的氧化鯊烯環化酵素倒去，並以TBS 緩衝液重複上述方式沖洗 3 次後，分別加入 400 µL的覆蓋液，置於室溫下 2 個小時，倒掉覆蓋液並以TBST (含 0.1 ％ Tween-20 的TBS 緩衝液)重複上述方式沖洗 3 次。取已進行完negative親和篩選的上清液加入每個well中，在室溫搖動混合 1 小時後，同樣以TBST用力沖洗 well 20 次，去除鍵結力弱或者沒有鍵結噬菌體胜肽庫，接著加入 200 µL 洗滌緩衝液 (elution buffer)於室溫搖晃 10 分鐘。最後以微量吸管劇烈抽吸數次，取出洗滌緩衝液 (elution buffer)加入含有 15 µL 中和緩衝液 (neutralization buffer)中，快速混合後拿取 1 µL 做系列 10 倍稀釋 (稀釋倍數 10～105)計數得到的噬菌體效價，其餘保存在 4 ℃。. 2-6-4 噬菌體培養放大將培養隔夜 3 mL的ER2738 以LB培養液以 1:100 稀釋成體積 20 mL，倒入親和篩選後的噬菌體，置於 37 ℃下培養 4.5 小時，以 9,000 rpm在 4 ℃下離心 15 分鐘，取上清液加入 1/5 體積的PEG/NaCl溶液，讓噬菌體沈澱下來，置於 4 ℃隔夜。第二天，以 9,000 rpm在 4 ℃下離心 20 分鐘，倒掉上清液，盡量倒去所有的PEG/NaCl溶液，沈澱物以 1 mL TBS緩衝液回溶後，將溶液轉至於微量離心管中。已回溶好溶液用 10,000 rpm離心 5 分鐘，以去除無法回溶的多餘沈澱物，取上 41.

(53) 清液至新的微量離心管中，並加入 1/5 體積的PEG/NaCl溶液置於冰上 1 小時，作第二次的沈澱。之後以 10,000 rpm離心 10 分鐘倒掉上清液，盡量倒去所有的PEG/NaCl溶液，將沈澱物溶於含 0.02 ％ NaN3的 200 µL TBS緩衝液中，用 10,000 rpm離心 5 分鐘，以去除無法回溶的多餘沈澱物，取上清液至新的微量離心管中，放置 4 ℃至少 1 個小時，取 10 µL做系列稀釋 (稀釋倍數 1010~1015)計數得到的噬菌體的效價，其餘保存於 4 ℃。. 2-6-5 第二次親和篩選第一次所篩選所得到的噬菌體效價約 1013 pfu/µL，取 10 µL與 90 µL的TBST緩衝液混和均勻後加入每個ELISA well中進行負向親和篩選，篩選後得到的上清液加入氧化鯊烯環化酵素well中進行第二次親合篩選，其餘步驟如前面所述，沖洗、elute、中和以及放大，特別注意第二次之後的篩選所加入的tween-20 含量提高至 0.5 ％ [v/v]，並且加入噬菌體後以TBST緩衝液用力沖洗 30 次，這樣的循環重複四次後。最後一次的篩選時，不進行放大動作直接作一連串稀釋計數得到噬菌體的效價，大約有 104 pfu/µL，保存於 4 ℃。. 42.

(54) 2-7 噬菌體效價之測定 2-7-1 方法一：培養盤菌落數計培養 3 mL LB培養液的ER2738 至隔夜，第二天取 3 µL ER2738 到新的 3 mL的LB培養液中，培養至OD600～0.5，並且準備Top agarose 微波加熱溶解後分裝成 3 mL放置 45 ℃水域槽內備用。將噬菌體用 LB培養液做系列的 10 倍稀釋，已經經由培養放大的噬菌體稀釋至 1011～1015倍，若未放大的噬菌體則稀釋 101～104倍，取 10 µL 稀釋好的噬菌體加入至 200 µL OD600～0.5 的ER2738 中，室溫下反應 5 分鐘後，最後將已感染ER2738 的噬菌體加入先前準備好的top agarose 中均勻混和，倒入已含IPTG/Xgal的LB培養盤上，等凝固後倒置 37 ℃ 培養 16~18 小時，計數藍色溶菌班的數目，並決定其效價. (pfu/µL =. 藍色溶菌班數目 × 噬菌體稀釋倍數 ÷ 10)。. 2-7-2 方法二：光譜吸收測定利用光譜吸收測定噬菌效價【圖 2-3】，取 10 µL已放大完成的噬菌體用TBS緩衝液稀釋一百倍，使用紫外光光譜儀測吸收值 240 nm 到 320 nm，噬菌體在 269 nm會有最大的吸收值，藉由公式計算噬菌體效價：每毫升噬菌體個數 (pfu/mL) = 269 nm的吸收值 × 6 × 1016 ÷ 所用的噬菌體其基因大小 × 100 稀釋倍數 (例如：M13 基因大小 6407 bases)。. 【圖 2-3】噬菌體光譜吸收圖。 43.

(55) 2-8 噬菌體胜肽庫對氧化鯊烯環化酵素之親和力測定酵素連結免疫吸附分析法 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、墨點法 (dot blot)、西方墨點法 (western blotting)常用在抗原抗體的分析中【圖 2-4】，利用固相吸附原理將抗原吸附在不同的材質上再將抗體加入反應，利用接有 HRP 酵素等可藉由呈色劑呈色的二次抗體，將其加入和一次抗體反應後，藉由呈色劑中的受質受到酵素反應呈色，得到的數值為抗原和一次抗體間的作用，利用這樣的反應可測定氧化鯊烯環化酵素和噬菌體之間的親和作用。. 受質 HRP. 二次抗體呈色. 一次抗體 Ag. 【圖 2-4】抗原抗體測定示意圖. 2-8-1 酵素連結免疫吸附分析法 (ELISA)之反應測試將 150 µL牛肝鯊烯環化酵素 (100 µg/mL)、噬菌體 (1010 pfu/mL) 及BSA蛋白質 (5 mg/mL)加到ELISA plate 反應槽中，在 4 ℃下放置隔夜，隔天將反應槽中蛋白質及噬菌體倒去以TBS緩衝液沖洗 3 次，分別加入 400 µL的覆蓋液，置於室溫下 2 個小時，倒掉覆蓋液並以 TBST緩衝液 (含 0.1 ％ Tween 20 的TBS緩衝液)沖洗 3 次。取噬菌體 10 µL和 100 µL TBST緩衝液混合均勻加入well中靜置反應 1 小時後，用TBST緩衝液沖洗 3 次。將含有HRP酵素的anti-M13 抗體以覆蓋液 1:5000 倍稀釋，取 100 µL的稀釋抗體加入反應槽中，置於室溫下反應 44.

(56) 1 小時，同樣以TBST緩衝液沖洗 5 次，最後加入 100 µL的ABTS ELISA 呈色劑 (ABTS試劑加入H2O2)，放置室溫下避光反應 10～60 分鐘後測 405 nm的吸收值。. 2-8-2 墨點法 (Dot blot)之反應測試將PVDF轉印膜用甲醇浸泡 10 秒，再用二次水清洗數次，等到膜稍微乾一點，再取 10 µL (0.5 mg/mL)的蛋白質點在轉印膜上等待膜完全乾，加入 5 ％脫脂奶粉覆蓋液室溫下反應搖晃一小時，以覆蓋其他沒有蛋白的部分，倒掉覆蓋液用 0.1 ％TBST 緩衝液 (含 0.1 ％ Tween-20 的TBS緩衝液)清洗轉印模 3 次每次 5 分鐘。取約 1012效價之噬菌體用TBST緩衝液稀釋成 1 mL加到轉印模中，用密封帶密封，室溫反應搖晃一小時或更久，倒掉噬菌體稀釋液，以同樣的方式清洗轉印模 3 次，加入以覆蓋液 1 : 5000 倍稀釋的HRP酵素anti-M13 抗體，置於室溫下反應 1 小時，同樣以TBST緩衝液沖洗 5 次，最後以DAB 呈色試劑呈色。. 2-8-3 西方墨點法 (Western blotting)之反應測試取 40 µL由牛肝中純化出的氧化鯊烯環化酵素，跑 12 ％的 SDS-PAGE (方法如同前面描述)。之後將膠片以二次水清洗二次 (搖盪 30 秒)，再浸在轉印緩衝液 (transfer buffer)中 10 分鐘；同時，將 PVDF轉印膜用甲醇浸泡 10 秒，再用二次水清洗數次，並同樣以轉印緩衝液平衡轉印膜；或者直接將NC轉印膜直接用轉印緩衝液平衡。轉印槽 (Hoefer)的電極利用轉印緩衝液潤濕，且準備 4 片已事先浸濕的厚濾紙。先將一塑膠片 (mask)放在電極上，再將 2 張厚濾紙放在轉印槽上，取一些轉印緩衝液保持濾紙濕潤，再鋪上已濕潤的轉印膜，再疊上已平衡好的膠片，最後鋪上 2 張厚濾紙即完成三明治疊法【圖 2-5】。在過程中每一層都要特別注意不要有氣泡，以免影響轉印的效果。組裝完成蓋上電極的正極，並在正極上面加上 1 公斤的物 45.