三.高效液相層析儀定量分析方法:
層析管 VERCOPAK INERTSIL 5 ODS-80A(4.6×150mm) 保護管柱 VERCOPAK ODS-80A
偵測波長 UV 302nm 流速 0.65ml/min
移動相 Acetonitrle:Phosphate Buffer( pH =7.5)=30:70 注入量 20μl
分析時間 18min
四.血漿中 omeprazole 之 HPLC 定量分析:
1. 血漿檢品之前處理
用微量移液管精確稱取血漿檢品 200μl 置入試管中，加入 含 100 μ g/ml coumarin 內 標 準 溶 液 20 μ l ， 再 加 入 600 μ l acetonitrile，以振盪器振盪 20 秒,使蛋白沉澱，再以 5000 rpm 離 心 20 分鐘用巴斯特管吸取上清液置於另一試管，以氮氣噴吹至 acetonitrile 完全逸離後，以移動相 200 μl 溶解之，再以 HPLC 分析(圖 2)。
2. 檢量線之製作
用微量移液管精確稱取空白血漿 180.0 μl 加入不同濃度 omeprazole 之標準溶液，配製成濃度為 10 至 1500 ng/ml 之標準 血漿檢品液(見下表)，再加入 100 μg/ml coumarin 內標準溶液 20 ul 及 acetonitrile 600 μl，以振盪器振盪 30 秒，使蛋白沉澱，離 心 20 分鐘，用巴斯特管取上清液至另一試管中，以氮氣吹至
acetonitrile 完全逸離後，以移動相 200 μl 溶解之，接著以 HPLC 分析，由所得之 omeprazole 與 coumarin 之面積比與標準濃度作 線性回歸以製作檢量線(表 2、圖 3)。
Omeprazole 標準濃度血漿檢品溶液之製備
標準溶液濃度 空白血漿取量 標準血漿溶液濃度
(ng/ml, 取量 20μl) (μl) (μg/ml)
同濃度之含 omeprazole 標準濃度血漿檢品，分別於同一日每 4 小時各建立一次檢量線，計算各個校正液濃度之平均值(Mean)、
標準偏差(S.D.)及變異係數(C.V.)，若於不同天以同法操作則可得 到間日內的精確性比較(表 3-1、3-2)。
5. 靈敏度試驗
檢測限度( Limit of Detection， LOD)
檢測限度為分析標定物在檢品中，能夠被檢測出來的最低濃度, 但在該試驗條件下不需要能被定量分析。檢測限度之決定方法為分 析標的物濃度為已知之溶液予以分析，使標定物之訊號對雜訊之比 值(即 S/N ratio)為 3:1 為準，所建立該分析標的物能可靠的被檢測 出來的最低濃度，即為 LOD 值。
定量限度( Limit of Quantitation， LOQ)
定量限度為分析標的物在檢品中，以所述分析條件下分析時，
具有準確度及精密度之最低可定量濃度，定量限度之決定方法為可
先將已之濃度分析標的物溶液作依序列稀釋以標的物之訊號對雜 訊之比值(即 S/N)為 10:1 為準，比值高於 10 之最低標的物。
6. 安定性試驗
(1) Omeprazole 在空白血漿中於室溫(25℃)下之安定性試驗
取濃度為 15000、10000、100 ng/ml 之標準溶液 500.0 μl, 加入 4500.0 μl 之空白血漿中,振盪一分鐘混合均勻,即得濃度 1500、1000、10 ng/ml 之血漿檢品，分裝後置於室溫中，於第 0、
3、6、9、12、 18、24、36、48 小時分別取出檢品後，依<血漿 檢品之前處理方法>處理後,紀錄濃度變化之情形(表 3-5)。
(2) Omeprazole 在空白血漿中於-30℃下之安定性試驗
取濃度為 15000、10000、100 ng/ml 之標準溶液 500.0 μl，
加入 4500.0 μl 之空白血漿中，振盪一分鐘混合均勻，即得濃度 1500、1000、10 ng/ml 之血漿檢品，分裝後置於-30℃冷凍櫃中，
於第 0、3、6、9、12、15、30、60、90 天分別取出檢品解凍後, 依<血漿檢品之前處理方法>處理後，紀錄濃度變化之情形(表 3-6)。