中藥材及其製劑中所含的甘草酸及薑辣素定量方法，有用薄層層析 法(Thin Layer Chromatography)及分光光度法，和近年的高效液相層 析法(High Performance Liquid Chromatography) ，其中高效液相層 析法，因所需檢品少，準確性高，是目前測定藥品含量常用的方法(47)。 目前文獻報告中，尚未有 HPLC 分析法同時定量四逆湯中之甘草酸 及薑辣素等二種標準品，而根據行政院衛生署藥物食品檢驗局中藥檢驗 方法專輯中所載有分別以甘草酸及薑辣素為指標成分。
衛生署規定，申請中藥藥品查驗登記應檢附薄層層析檢驗資料(48)， 因此薄層層析法是台灣目前中藥定性定量試驗最常使用的方法。為提高 中藥製劑的質量，需要制定有關產品的定量及檢驗方法。因此，本研究 將探討一種靈敏度高且具專一可行性之 HPLC 方法，適合於分析錠劑中 指標成分甘草酸及薑辣素，作為錠片含量測定的標準。文獻上曾經發表 過個別分析定量甘草酸及薑辣素的含量，分別整理於 Table 1、Table 2 中：
Table 1 Glycyrrhizic acid 之 HPLC 定量法文獻整理
phosphoric acid 調 pH=3.45-3.50）
248 1
Table 2 6-Gingerol 之 HPLC 定量法文獻整理
作者 層析管柱 移動相
(v/v)
檢測波 長(nm)
流速 (ml/mi
n.) Yamauchi Y.
（56）
ODS column Muti-step gradient elution with 10mM TAA（磷 酸，pH4.0）-乙晴
275 1
衛生署（57） μ-Bondapak C18 水-甲醇-氰甲烷 (50:45:12)
214 1
衛生署（58） Lichrospher RP18 水-甲醇-氰甲烷 (55:45:12)
270 1
衛生署（59） Inertsil ODS-2 水-氰甲烷(50:50) 280 1
第七節 研究動機與目的
1.研究動機
本研究室一向致力於探討藥物之生體可用率及製劑配方的研究。在 錠劑生產中，同樣的藥味，同樣的劑型，若因配方不同或因製備過程不 同，常會影響主成分的溶離度，對療效會有非常大的影響。而中藥製劑 的品質更會因藥材來源及製程因素的影響而產生不同的變化。今欲借此 研究過程，了解四逆湯在不同比例的配方組成中之溶離情形，提供四逆 湯錠製劑學研究模式，並探討其配方變因對四逆湯錠片的品質影響，經 由所建立之中藥方劑指標成分HPLC 定量方法，對甘草之 Glycyrrhizic acid 及乾薑之 6-Gingerol 的含量進行測定，來評估四逆湯錠劑之配方。
希望藉此研究過程，建立中藥方劑同時定量多重指標成分之 HPLC 分析方法；瞭解四逆湯中 Glycyrrhizic acid 及 6-Gingerol 的溶離情 形，試著找出一種具備有快速釋放的配方，並且又具備有錠劑保存容 易、服用方便的特性。提供一種製劑學的研究模式，為日後在人體進行 生體可用率試驗建立研究方法基礎。
2.研究目的
A.建立甘草指標成分 Glycyrrhizic acid 及乾薑指標成分 6-Gingerol 之高效液相層析方法：
對於四逆湯產品建立一種簡單、快速、靈敏度高且具專一性的 HPLC 定量分析方法，以兩個指標成分進行分析探討，作為製劑品管評 估之基準。
B.四逆湯之配方研究：
利用三種不同賦型劑starch、lactose 及 avicel，試驗七種不同濃度配 方組成，探討各配方之指標成分與溶離速率之間的關係，找出最快速釋 放之配方。
C. 四逆湯錠劑之研究：
本篇論文希望能從四逆湯錠片之七種處方設計始至錠片製程變因 及成品特性的評估，找出一種具有快速釋放的錠劑配方，並藉定量成品 中指標成分之含量，進行品管控制，希望能獲得四逆湯錠片製造之最適 宜條件，以供業界參考。
第三章 實驗材料及方法
第一節 實驗材料
一、藥材
本實驗所使用之中藥材係購自台中欣隆藥材行:
炙甘草為豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.的乾燥根及根莖。
乾薑為薑科植物薑 Zingiber officinalis Rosc. 的乾燥根莖。
附子為毛茛科植物烏頭 Aconitum carmichaeli Debx.的子根加工品。
二、藥品及試劑
甘草酸(glycyrrhizic acid) TCI Chemical Co.
薑辣素(6-gingerol) WAKO Chemical Co.
羥苯丙酯(Propyl paraben) Sigma(St.Louis, MO, U.S.A.) 磷酸(Phosphoric acid) Merck Co.
甲醇(Methanol) Merck Co.
氰甲烷(Acetonitrile) Merck Co.
鹽酸 (Hydrochloric acid) Merck Co.
氫氧化鈉(Sodium hydroxide) 德國 R.D.H. Co.
磷酸二氫鉀(Potassium dihydrogen phosphate) Merck Co.
＊ 使用於高效液相層析儀之試劑均為HPLC 級
＊ 使用於高效液相層析儀之水均經Millipore 公司之 Milli-RO60 製造之純水，再經 Millipore 0.45μm 過濾膜過濾
三、儀器及材料
1.高效液相層析儀之裝備
幫浦(Pump)： Jasco Model PU-980
偵測器(Detector)： Jasco Model UV-970 Intelligent UV/VIS 積分儀(Integrator)： Scientific Information Service
Corporation Integrator 自動取樣機(Auto Sampler)：
Jasco Model AS-950
印表機(Printer)： Heweltt Packard Deskjet 695C 層析管(Column)： Merck Lichrospher 100 RP-18e 保護管柱(Pre-column)： Merck Lichrocart 4-4 guard column Induction Motor：41K25RGK-A2 Shang Yang Motor（Taiwan）
Hardness Tester：AE-30 capacity 30Kg model Aikoh（Taiwan）
Moisture Determination Balance：FD-600 Kett（Japan）
Friabilator：40J10GA-A Oriental（Japan）
Dissolution Tester：DT-610 Jasco（Japan）
Oven Dryer：KS-21AC Kwang Shan（Taiwan）
Thickness Tester：PC-440 Teclock（Japan）
Disintegration Tester：SK30202 新光精機公司（Taiwan）
振盪過篩機：AS200 digit Retsch（Japan）
2.實驗室裝備
電子天平： Sartorius Type 1801
減壓抽氣機： Eyela, Aspirator A-2S, Tokyo, Rikak Co.
微量移液管(Micropipette)：
Socorex Transferpette： l - 10 µl 20 - 200 µl
100 - 1000
µl
試管振盪器： Maxi Mix II Thermolyne Type 37600 Mixer 高速離心機： Hettich Zentrifugen D-7200 Tuttlingen,
Germany (5000 rpm)
酸鹼測定儀(pH meter)： Suntex Microprocessor pH meter Model-2200 純水製造裝置： Operting and Maintenance manual For RiOsTM and ElixTM Water purification
system, Millipore Co. Operting and Maintenance manual Milli-Q, Millipore Co.
超音波振盪器： BRANSON 5510, BRANSON ULTRASONIC Co. , USA 過濾膜： Millipore Type HV, 0.45µm, Millipore Co.
四、溶液製備
1. 薑辣素及甘草酸的標準溶液(6-Gingerol and Glycyrrhizic acid stock standard solution)
精稱薑辣素及甘草酸標準品各10.0 mg 分別置入一個 20 ml 的容 量瓶中，添加甲醇至刻度，即得濃度為0.5 mg/ml 的薑辣素及甘草酸 的標準溶液。使用時再以甲醇稀釋成所需濃度之標準溶液。
2.內部標準溶液(internal standard solution)
精稱羥苯丙酯(Propylparaben) 50 mg 置於 100 ml 定量瓶中，先加 入適量甲醇(Methanol )使之溶解，再加入甲醇至刻度，可得濃度為 500 µg/ml 對羥苯丙酯儲備液；取 1.0 ml 之儲備液置於 10 ml 容量瓶，加 入甲醇至刻度並混合均勻，即得濃度為50 µg/ml 的內部標準溶液。
3.人工胃液、人工腸液之配製：
人工胃液：量取濃鹽酸21ml 加水稀釋至 3000ml，經標化為 1N HCL，作為溶離試驗用之人工胃液（pH1.2）。（不加pepsin）。
人工腸液：量取磷酸氫鉀20.5 克，加 1N NaOH 67.2 ml，再 加水稀釋至 3000ml，經標化為 pH6.8，作為溶離試驗用之人 工腸液。
4.四逆湯濃縮液之製備：
依四逆湯方中各藥材用量比例 4：3：4，秤取飲片炙甘草 400g、
乾薑 300g、炮附子 400g，將藥材放入二重鍋中加入 6 倍水量，煮 沸1 小時，收集濾液，藥渣再加入 6 倍水量，煮沸 1 小時，收集濾 液。合併二次濾液，經減壓濃縮成流浸膏狀備用。
操作流程如下：
四逆湯：炙甘草400g、乾薑 300g、炮附子 400g（4：3：4）
加入 6 倍水量煎煮 1 小時
濾液 藥渣
加入 6 倍水量煎煮 1 小時
濾液 藥渣
合併
濾液 沉澱
減壓濃縮
流浸膏
冷凍乾燥
加入賦型劑 製錠
第二節 實驗方法
一.四逆湯製劑之含量測定分析方法
1.HPLC 分析條件
層析管(Column) Merck Lichrospher 100 RP-18e
保護管柱(Pre-column)： Merck Lichrocart 4-4 guard column
移動相 A：Acetonitrile
B：Water（以 85%Phosphoric acid 調 pH 3.2-3.25）
50，25，10，5，2.5，1，0.5，0.1 µg/ml 的標準溶液，各取 180 µl 不同濃度的標準溶液，加入 20 µl 之內標羥苯丙酯
(Propylparaben，50 µg/ml)，取 20 µl 注入 HPLC 分析，由所得 之薑辣素與羥苯丙酯之面積比與各已知濃度作線性迴歸以製作檢 量線。
（2）Glycyrrhizic acid 標準曲線之製作：精確量取甘草酸
(Glycyrrhizic acid)標準溶液（1 mg/ml），分別加適量甲醇稀釋 成濃度為 500，250，125，50，25，10，5，2.5，1，0.5，0.1 µg/ml 的標準溶液，各取 180 µl 不同濃度的標準溶液，加入 20 µl 之內 標羥苯丙酯(Propylparaben，50 µg/ml)，取 20 µl 注入 HPLC 分 析，由所得之薑辣素與羥苯丙酯之面積比與各已知濃度作線性迴歸 品標準溶液，即 Glycyrrhizic acid 的高、中、低三種濃度分別為 50,5,0.5 µg/ml。6-gingerol 的高、中、低三種濃度分別為 50,5,0.5 µg/ml。各分析兩次，計算各個校正液濃度之平均值(Mean)、標準偏差 (S.D.)及變異係數(C.V.)。並於不同天以同法操作則可得到間日內的結 果與同日內作精確性比較。
4.靈敏度試驗
分析過程中，欲找出能被檢定出之最低濃度，但不需要能夠被定量，故 做偵測極限試驗(Limit of detection, LOD)，經使用指標成分標準品 溶液甘草酸、薑辣素逐步稀釋後，溶液以 HPLC 法分析，由 Signal 對 Noise 比 3：1 而得。而偵測極量(Limit of quantitation, LOQ），將依前述
「檢量線之製作」，採標準濃度檢品製備方法，取六次檢品分析決定之。
精確量取甘草酸之標準溶液，使濃度為 1.0、5.0、50.0、250.0 µg/ml。將上述標準溶液分別置於冰箱 4℃儲存。於第 0、1、3、7、
14、21、30、60、90 天分別取出一組檢品（n=3）。回溫後，依前述 HPLC 處理方法分析，觀察甘草酸及薑辣素之濃度變化情形。
（2）薑辣素在 4℃下之安定性試驗
精確量取甘草酸及薑辣素之標準溶液，使濃度為 1.0、5.0、50.0、
250.0 µg/ml。將上述標準溶液分別置於冰箱 4℃儲存。於第 0、1、
3、7、14、21、30、60、90 天分別取出一組檢品（n=3）。回溫後，
依前述 HPLC 處理方法分析，觀察甘草酸及薑辣素之濃度變化情形。
6.含量測定
（1）四逆湯濃縮浸膏之冷凍乾燥粉末含量測定
將四逆湯濃縮浸膏之冷凍乾燥粗粉用研缽磨細，各秤取5mg 溶解 於甲醇10ml 中，以 0.45μm 過濾膜過濾後，濾液依前述 HPLC 處 理方法分析，定量甘草酸及薑辣素之濃度。
（2）四逆湯錠之含量測定
將各處方設計的四逆湯錠片一粒用研缽研磨粉碎後，溶解於甲醇 10ml 中，經超音波震盪 1 小時，以 0.45μm 過濾膜過濾後，濾液 依前述HPLC 處理方法分析，定量甘草酸及薑辣素之濃度。
7.相對回收率（relative recovery）實驗
目的在比較 Glycyrrhitic acid，6-Gingerol 溶解在人工胃液、
人工腸液和甲醇中，經處理後檢出量之差異。實驗步驟如同校正曲線製 作中對檢品之處理過程。相對回收率可從下式求得:
標準濃度與內標在模擬胃液或腸液中積分面積比 相對回收率
(%)= 標準濃度與內標在溶媒中積分面積比
× 100 %
8.殘渣分析
擬製備成每錠含四逆湯粉200mg 之錠劑。以 starch、lactose 及 avicel 的 不同濃度如Fig.11，設計成七組處方，各組處方內容如下表所示。每顆錠片以
R5 22.5 30 47.5
每批各取十顆錠劑，使用Monsanto hardness 測試儀器，具有刻紋握把之螺 旋裝置，由旋轉螺旋柱壓來壓錠，以壓碎錠劑時彈簧所承受的壓力來衡量。其
單位公斤（Kg）。
2.厚度試驗（Thickness test）：
每批各取十顆錠劑，使用Micrometer 測試儀器，測量錠劑厚度（mm）。
3.重量差異試驗（Weight variation test）：
每批各取二十顆錠劑，分別以天平秤重量，並計算其平均重量，以每一錠
之重量與平均重量的差異計之，其差異超過重量差異百分率5%的不得超過二
粒，並不能有任何錠劑有超過5%之一倍者。
4.脆度試驗（Friability test）：
每批各取十顆錠劑先秤重，放在Friabilator 內，以 25 r.p.m.旋轉，經四分鐘。
然後再取出錠劑秤重，計算脆度。
第四章 結果與討論
第一節 含量測定條件之確定
一、指標成分 HPLC 定量法
利用高效液相層析法分析四逆湯檢品中甘草酸、薑辣素之含量，其層析 圖之例參見 Fig.1。兩種指標成分的滯留時間分別為 6.49 及 17.32 分 鐘，內標為 12.01 分鐘。層析圖中波峰基線清晰穩定，亦無干擾性波峰，
可見本法用於分離甘草酸及薑辣素的效果良好。
二、檢量線之製作
本實驗的定量方法是將已配置好的各標準品濃度取 180μl 加入 20μl 濃度為 50μg/ml 羥苯丙酯(Propyl paraben)的內標，接著以 HPLC 分析。
由所得之甘草酸、薑辣素與羥苯丙酯之波峰面積比與校正濃度作線性回 歸以製作檢量線。結果甘草酸在濃度 0.1-500μg/ml 範圍內及薑辣素在 濃度 0.1-250μg/ml 範圍內均成良好線性關係，其線性回歸方程式分別
由所得之甘草酸、薑辣素與羥苯丙酯之波峰面積比與校正濃度作線性回 歸以製作檢量線。結果甘草酸在濃度 0.1-500μg/ml 範圍內及薑辣素在 濃度 0.1-250μg/ml 範圍內均成良好線性關係，其線性回歸方程式分別