本研究以口腔黏膜細胞來進行分析，在口腔內壁取下一些黏膜細胞，
做為檢測之用，為非侵入式，一般受試者比較能接受。收集後先進行 DNA 萃取，ACTN3、ACE 與 PPARD 基因型的分析是採 PCR-RFLP 與電泳的方 法來判斷。
（一）DNA 萃取
本研究使用傳統 Phenol/chloroform/isoamylalcohol 方法進行 DNA 萃取
（邱麗玲、謝玲玲、顏克典、謝伸裕，2007）：
1. 將自口腔黏膜取下的細胞，加入 20 μl 的 K 蛋白酶（Proteinase K）完全 水解。
2. 之後加入各500 μl 的 Phenol/chloroform/isoamylalcohol 混合溶液將 DNA 萃取出來。
3. 加入 1000 μl 的 99.5％酒精沉澱 DNA，放入-20°Ｃ中冰箱 12 小時，離心 後移除 99.5 %的酒精，再加入 1000 μl 的 75 %酒精放入。
4. 之後將 75 %酒精移除，DNA 離心烘乾後加入適量的 TE buffer 約 15 μl，
放置於-4°Ｃ的冰箱中保存。
（二）ACTN3 基因多形性分析
取出處理完保存於 -4°Ｃ的檢體，採用Ｍill 等(2001)所使用
PCR-RFLP 的方式，正向引子（forward primer）序列為 5’-CTG TTG CCT GTG GTA ACT GGG-3’，和反向引子（reverse primer）5’-TGG TCA CAG TAT GCA GGA GGG-3’ （附錄二）。
1. 取出 DNA 0.1 μl、10 X buffer 2.5 μl、Taq 0.2 μl、dNTP 2 μl、primer-a
（50 ng）0.025 μl、primer-b（50 ng）0.025 μl、dH2O 20.15 μl，總體積
為 25 μl，來進行 PCR 反應。
2. PCR 的反應步驟為 95°Ｃ的 1 分鐘變性、60°Ｃ的 30 秒黏合，及 72°Ｃ
的 40 秒展延，重複 35 個循環。
3. 將 PCR 所得的產物加入 Dde I 限制酶放入 60°Ｃ的水浴槽內，反應 16 小時。
4. 以 8 % 聚丙烯醯胺膠進行電泳分析，並使用溴化乙錠染色後，使用 UV 照相，分析其 ACTN3 基因型。577 RR 型的基因呈現 205 及 85 bp 二個片段，577 RX 的基因呈現 205、108、97 及 85 bp 四個片段，而
RR 型 XX 型 RX 型
577 XX 的基因呈現 108、97 及 85 bp 三片段（圖 3-3）。
圖3-3 ACTN3 基因型
（三）ACE 基因多形性分析
取出處理完保存於 -4°Ｃ的檢體，採用 Alvarez 等（1998）所使用的 方式，正向引子序列為5’-CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3’，反 向引子 5’-GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGAT -3’（附錄二）。
1. 取出 DNA 0.1 μl、10 X buffer 2.5 μl、Taq 0.2 μl、dNTP 2 μl、primer-a 0.05 μl、primer-b 0.05 μl、dH2O 20.1 μl，總體積約為 25 μl，來進行 PCR 反應。
2. PCR 的反應步驟為 95°Ｃ的 1 分鐘變性、58°Ｃ的 30 秒黏合，及 72°Ｃ
的40 秒展延，重複 30 個循環。
3. 以 6 % 聚丙烯醯胺膠進行電泳分析，並使用溴化乙錠染色後，使用 UV 照相，分析其 ACE 基因型。ACE II 的基因型呈現 490 bp 一個片段，
ACE ID 的基因型呈現 490 bp 及 190 bp 二個片段，而 ACE DD 的基因型 呈現190 bp 一個片段（圖 3-4）。
圖3-4 ACE 基因型
（四）PPARD 基因多形性分析
取出處理完保存於 -4°Ｃ的檢體，採用 Ahmetov, Astratenkova, and Rogozkin (2007) 所使用 PCR-RFLP 的方式，正向引子序列為 5’-CAT GGT ATA GCA CTG CAG GAA-3’，和反向引子 5’-CTT CCT CCT GTG GCT GCTC -3’（附錄三）。
1. 取出 DNA 0.1 μl、Bioman buffer 2.5 μl、Taq 0.2 μl、dNTP 2 μl、primer-a 0.01 μl、primer-b 0.01 μl、dH2O 20.18 μl，總體積為 25 μl，來進行 PCR 反應。
2. PCR 的反應步驟為 95°Ｃ的 1 分鐘變性、60°Ｃ的 30 秒黏合，及 72°Ｃ
的 40 秒展延，重複 35 個循環。
3. 將 PCR 所得的產物加入 Bsc4I 限制酶放入 55°Ｃ的水浴槽內，反應 16 小時。
4. 以 3 % 洋菜凝膠進行電泳分析，並使用溴化乙錠染色後，使用 UV 照
相，分析其 PPARD 基因型。PPARD TT 型的基因呈現 269 bp 一個片段，
PPARD TC 的基因呈現 269 bp、167 bp、102 bp 三個片段，而 PPARD CC DD 型 ID 型 II 型
的基因呈現 167 bp 及 102 bp 二片段(圖 3-5)。
圖 3-5 PPARD 基因型