基因型檢定

利用萃取好的 DNA，以聚合酶鏈鎖反應及限制片段長度多型性(PCR-RFLP；

polymerase chain reaction–restriction fragment length polymorphism)之方法，進行 新生兒CYP2A6 及 NAT2 二種基因型之分析。兩種基因型所用之核酸引子序列如下 表所示。

表3-1、CYP2A6、NAT2 基因型之核酸引子(primer)序列 基因型 核酸引子序列

CYP2A6 5’-CACCGAAGTGTTCCCTATGCTG-3’

5’-CTAAGCCTCAGTTTTGTCACGTG-3’

NAT2 5’-TCTAGCATGAATCACTCTGC- 3’

5’-GGAACAAATTGGACTTGG-3’

(1) CYP2A6 基因多型性之分析

PCR 溶液總體積為 25μl，包括 2.5mM 去氧核苷三磷酸(dNTP)2.5μl、10X 聚合 酶緩衝溶液2.5μl、10uM 核酸引子【表 3-1】各 1μl、2U/μl 聚合酶 0.5μl、15mM 氯

化鎂0.8μl 及濃度約 150 ng/μl 的 DNA，接著加入滅菌水(ddH2O)使總體積達 25μl。

實驗反應條件一開始為熱開始(Hot start)，94℃反應 5 分鐘使雙股 DNA 變性，其次 是94℃反應 1 分鐘，68℃反應 30 秒，72℃反應 2 分鐘三步驟進行 5 個循環，接著 再以94℃反應 1 分鐘，64℃反應 30 秒，72℃反應 2 分鐘三步驟進行 35 個循環，最 後設定在72℃反應 6 分鐘。

將PCR 產物與 DNA loading dye 在石蠟紙上混合均勻後，以洋菜膠電泳法進行 分析。分析之條件是採用1%瓊脂膠(Agarose)於 0.5× TBE 中以固定電壓 110 伏特跑 30 分鐘後，以溴化乙錠（ethidium bromide，簡稱 EtBr）染色，在紫外燈（UV）下 觀察，PCR 產物位於 1322base pair (bp)的位置。

接著在PCR 產物內分別加入 AccII 與 Eco81I 限制酶、限制酶反應溶液及滅菌水 至總體積20μl，放置於 37℃水浴槽內 3 小時，使其反應完全，再以 2%的瓊脂膠進 行電泳分析，在紫外燈下觀察與照相，其產生片段如下圖所示⁽⁴⁶⁾。

CYP2A6 基因經由限制酶切割出三種對偶基因(1A、1B、4C)，野生型(wild-type) 為CYP2A6*1A，野生型同型合子只被 Eco81I 限制酶作用產生 789、429bp 的片斷；

而 CYP2A6*1B 為 CYP2A6 基 因 與 CYP2A7 基 因 的 3’端未轉譯區產生互換 (conversion) 所發生的部份變異，同時會被 AccII 與 Eco81I 限制酶作用，分別產生 1041、280bp 及 789、429bp 的片斷；另外，CYP2A6 基因缺失型(whole deletion) 為CYP2A6*4C，也同時會被 AccII 與 Eco81I 限制酶作用而產生 1040、280bp 與 728、

428bp 的片斷。

(2)NAT2 基因多型性之分析

NAT2 基因多型性之分析是利用 PCR-RFLP 之方法，取約 150 ng/μl 的 DNA 為 模板進行PCR 反應，PCR 溶液為濃度約 150 ng/μl 之 DNA、2.5mM 去氧核甘三磷 酸(dNTP) 5μl、10X 聚合酶緩衝溶液 5μl、10uM 核酸引子【表 3-1】各 1.8μl、2U/μl 聚合酶1μl、25mM 氯化鎂 1μl，接著加入滅菌水(ddH2O)使總體積達 50μl。PCR 反

NAT2 野生型(wild-type)為 NAT2*4，野生型同型合子之兩條對偶基因都可被 Kpn I、Taq I 與 BamH I 限制酵素作用。

NAT2*5 (M1 Allele)為 Kpn I 型，於 C481T 產生取代，此變異型(variant)的同型 合子均無Kpn I 限制酵素切點，只有一條 1093bp 的 DNA 片斷；若為野生型同型合

1 : NAT2*4/NAT2*4(野生型/野生型) 2 : NAT2*4/NAT2*5(野生型/變異型) 3 : NAT2*5/NAT2*5(變異型/變異型)

Taq I 型為 NAT2*6 (M2 allele)，在 G590A 產生取代，野生型同型合子會出現 381bp、326bp、226bp 及 169bp 的 DNA 片斷；變異型同型合子則有兩個 Taq I 酵 素之切點，產生395bp、381bp 及 326bp 的 DNA 片斷；因此變異型的異型合子會出 現395bp、381bp、326bp、226bp 及 169bp 五個 DNA 片斷。

BamH I 型為 NAT2*7 (M3 allele)，在 G857A 產生取代，變異型的同型合子均無

1 : NAT2*4/NAT2*4(野生型/野生型) 2 : NAT2*4/NAT2*6(野生型/變異型) 3 : NAT2*6/NAT2*6(變異型/變異型)

bp

(3)CYP1A1、GSTT1、GSTM1 基因多型性之分析

新生兒CYP1A1、GSTT1、GSTM1 三個代謝基因多型性之資料由本實驗室先前 已完成之國健局計畫所提供。