多倍體之研究進展

多倍體 (polyploid) 是指擁有兩套或以上染色體組的個體。多倍體有 兩類：一類是同源多倍體 (autopolyploid)，是指擁有多套完全相同染色 體組的個體；另一類則是異源多倍體 (allopolyploid)，是由於雜交而擁有 兩種或兩種以上不同染色體組的個體 (Grosser and Gmitter, 2011; Pignatta

et al., 2010; Yang et al., 2011; Ochatt et al., 2011)。

多倍體雖然不具繁殖能力，但許多的多倍體農作物和二倍體比較起 來，有植株較壯碩、高產量、抗病性較強等優良的性狀 (Lewis, 1980;

Predieri, 2001)。除此之外，許多多倍體農作物具有著較大的葉、莖、根 等 (Zhang et al., 2008; Leitch and Leitch, 2008; Dubcovsky and Dvorak, 2007)，對於藥用植物來說，較大的生物量也可能代表著較多的有效成 份。因此，發展藥用植物的多倍體有其商業價值。

秋水仙鹼 (Colchicine) 是一種從秋水仙 (Colchicum autumnale) 所提 煉而來的生物鹼，適當濃度的秋水仙鹼可以用來治療痛風關節炎。1937 年 時Blakeslee and Avery 發 現 秋 水 仙 鹼 可 用 來 誘 導 曼 陀 羅 (Datura

stramonium) 從二倍體加倍成為四倍體，從此以後秋水仙鹼便被廣泛應用

於多種植物多倍體的誘導。秋水仙鹼可以抑制紡錘體的形成、干擾細胞 有絲分裂 (Nebel and Ruttle, 1938)，細胞分裂不正常的結果導致染色體的

多倍化。

et al., 2007; Ochatt et al., 2011; Lema-Ruminska, 2011)。

4.2 材料與方法

4.3.1 培養基、容器及環境

從第一部份實驗得知以濃度0.5 mg/l TDZ 能誘導最多芽體，因此接 下來將用這個濃度誘導芽體，並添加秋水仙素刺激染色體加倍、形成多 倍體。而在前導實驗中，以5、10、50 及 100 mg/l 的秋水仙鹼均無法誘 導葉培植體生出芽體。

第二部份的培養基成份為全量 MS 培養基、30 g/l 蔗糖、1 g/l peptone、0.5 mg/l TDZ 及 3 g/l 水晶洋菜，經高溫高壓殺菌 20 分鐘。培 養容器為塑膠培養皿 (60 x 15 mm petri dish)。於無菌操作台在每個容器

倒入10 ml 的培養基，用無菌過濾的方法在約 70℃左右的以滅菌培養基 添加不同濃度 (0、0.5、1、2、3、4 mg/l) 的秋水仙鹼。以 paraffin 封口。

置於黑暗中培養。

4.3.2 誘導葉培植體發芽與生根

以秋水仙鹼處理三週後，將培植體移到不含秋水仙鹼的培養基 (全 量MS 培養基、30 g/l 蔗糖、1 g/l peptone、0.5 mg/l TDZ) 中。再過六週 後，將培植體移到含0.5mg/l BA、0.5mg/l IBA 的全量 MS 培養基。接著

再過五週，將原葉培植體移除，移到含0.5mg/l IBA 的 1/2 MS 培養基促 進發根。

4.3.3 倍體數鑑定

4.3.3.1 流式細胞儀分析

首先將待測葉片組織與對照組放入直徑6 cm 的玻璃盤中，加入 100 μl 抽核液 (Partec CyStain® UV precise P#05-5002)，然後以刀片剁碎，混 合均勻後置於冰上。接著加入 400 μl 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)

螢光染劑，以30 μm 濾網 (Partec CellTric®) 過濾雜質，倒入樣品管進行 檢測。使用流式細胞儀 (Partec Ploidy Analyser, PAII) 進行檢測時，每樣 品管皆分析 2000 個細胞核左右。以已知 DNA 含量與倍體數的樣品作為 對照組，以此推估待側樣品的核DNA 含量 (徐，2010)。

4.3.3.2 根尖染色與染色體觀察

以解剖刀將植物的新生根尖切下，取前端1~2 cm，浸於 Carnoy’s 固 定液中，常溫下至少固定3 小時。固定液處理完後，以酒精將醋酸洗淨。

將洗淨的根尖置於載玻片上，在解剖顯微鏡下切下根尖最頂部，其餘部 份丟棄。加入一滴Aceto-carmine 染劑，可用酒精燈加熱以加速染色速度，

蓋上蓋玻片。將載玻片置於紙巾上，拿紙巾末端反摺蓋住玻片，用大拇

指將根尖壓碎，使細胞分散、染色體較容易觀察 (McClintock, 1929)。

4.3.4 植株馴化

將健康無玻璃質化的芽體移入含全量MS 培養基添加 30 g/l 蔗糖、1 g/l peptone、0.5 mg/l IBA 及 9 g/l Agar 的蘭花瓶，約兩個月後 (植株約 10 公分高左右) 移出瓶外。移入培植土前，先將植株浸於水中數分鐘。

移入培植土後，用塑膠袋或保鮮膜包覆保持濕度。約兩個星期後，可拆 開塑膠袋，將植株移往戶外。

4.4 結果

4.4.1 秋水仙素與葉培植體器官發生

在以秋水仙鹼 + 0.5 mg/l TDZ 處理三週後，將葉培植體移到不含秋 水仙鹼的培養基。秋水仙鹼明顯抑制形態發生，沒有任何芽體形成且葉 培植體開始轉黃或褐化。六週後，將培植體移到含0.5 mg/l BA、0.5 mg/l IBA 的全量 MS 培養基以誘導芽體。處理五週後，計算每片葉培植體的 芽體數，其中以原濃度2 mg/l 秋水仙鹼處理組芽體數最多，平均每片葉 培植體有10.33 個芽體，1 mg/l 秋水仙鹼次佳，平均每片葉培植體有 6.33 個芽體 (見表 4.1; 圖 4.1)。

在秋水仙鹼誘導葉培植體形成多倍體的結果方面，由上述芽體繼代

所形成的植株中，以0.5 mg/l、1 mg/l、2 mg/l 秋水仙鹼處理，以流式細 胞儀測試倍體數的結果，各成功得到一株四倍體 (見表 4.2; 圖 4.2)。

4.5 討論

以各種濃度的秋水仙鹼 (100 ~ 1000 mg/l) 誘導染色體加倍的方法處

理一至五日，對於誘導染色體加倍的效果不好，只能誘導出嵌合體 (Chimera)，無法產生四倍體 (Song et al., 1997; Roy et al., 2001; Thao et al., 2003)。與短期高濃度秋水仙鹼比較，長期秋水仙鹼的處理比較少人嘗 試。Chakraborti 等人(1998) 以 1000 mg/l 秋水仙鹼處理桑椹 (Morus alba) 一日與28 日得到同樣好的效果。然而，De Carvalho 等人 (2005) 以 10、

100 以及 500 mg/l 秋水仙鹼處理胭脂樹 (Bixa orellana) 15 或 30 日，則只 有在濃度10 mg/l 的秋水仙鹼處理 15 日得到僅有一株四倍體。

根據Gao 等人 (1996)的結果，濃度 10 ppm (10 mg/l) 的秋水仙鹼誘 導丹參芽團多倍體效率最好。然而本實驗以葉片作培植體測試的結果：

以濃度5、10、50 及 100 mg/l 的秋水仙鹼+ 0.5mg/l TDZ 處理三週均無法 誘導葉培植體生成任何芽體，可見在有秋水仙鹼存在的情況下，誘導葉 培植體形態形成相當困難。

Nilanthi 等人 (2009) 以秋水仙鹼來誘導紫錐菊 (Echinacea purpurea) 形成多倍體，並測試不同濃度與不同處理時間的秋水仙鹼誘導多倍體的

效率。結果顯示，秋水仙鹼濃度越高，芽體發生率也越低；然而處理時 間越久，多倍體的誘導比率也越高。誘導紫錐菊 (E. purpurea) 多倍體效 率最高的濃度與處理時間是以濃度120 mg/l的秋水仙鹼處理 28 日，多倍 體誘導率可達23.5%。

本實驗以0.5 mg/l、1 mg/l、2 mg/l秋水仙鹼+ 0.5mg/l TDZ處理葉培植 體三週，得到若干芽體。將這些芽體以流式細胞儀檢測多倍體，僅各得 到一株四倍體，誘導成功率偏低。Gao 等人 (1996) 是以芽團作培植體、

Duan 等人 (2006) 則是將葉片先誘導出芽體後，再以秋水仙鹼處理，分

別以10 mg/l 秋水仙鹼處理 30 日與 15 mg/l秋水仙鹼處理一週，分別得到 12 % 與 33.33% 的四倍體。由此可知，從葉培植體直接誘導四倍體芽體 比從二倍體芽體開始誘導四倍體困難。秋水仙鹼本身便干擾細胞分裂，

因此更不容易從葉培植體的形態發生得到芽體。雖然如此，本實驗流式 細胞儀檢測的結果並沒有得到混倍數體 (mixploid)，這或許代表從葉培植 體誘導多倍體的方法比較容易得到全株四倍體。

多倍體誘導效率隨秋水仙鹼的濃度與處理時間的不同而有所差異，秋 水仙鹼的濃度越高與處理時間越長，對植物的毒性越強、存活率越低、

然而相對的也得到越高比率的多倍體。如何掌握秋水仙鹼的濃度與處理 時間是成功誘導多倍體的一項重要課題。

表 4.1 秋水仙鹼對誘導丹參葉培植體芽體的影響 Treatments (mg/l)

Colchicine TDZ Average number of shoots

0 0.5 10.00 a

0.5 0.5 1.33 a

1.0 0.5 6.33 a

2.0 0.5 10.33 a

3.0 0.5 1.17 a

4.0 0.5 0.67 a

試驗結果以鄧肯氏多變域分析法 (Duncan’s Multiple Range Test)進行平 均值的差異比較 (P﹤0.05)。

表 4.2 秋水仙鹼誘導葉培植體形成多倍體的結果 Treatments (mg/l)

Colchicine TDZ

Number of plants

Diploid (2x) Tetraploid (4x)

0 0.5 8 8 0

0.5 0.5 8 7 1 1.0 0.5 27 26 1 2.0 0.5 26 25 1 3.0 0.5 17 17 0 4.0 0.5 14 14 0

圖4.1 秋水仙鹼誘導丹參葉培植體芽體 (bar)

a. 2 mg/l Colchicine 的處理組在第四週的情況 (0.50 cm) b. 2 mg/l Colchicine 的處理組在第八週的情況 (0.50 cm) c. 2 mg/l Colchicine 的處理組在第十三週的情況 (1.2 cm) d. 2 mg/l Colchicine 的處理組在第十七週的情況 (1.4 cm)

圖4.2 流式細胞儀直方圖 (Histogram) a. 對照組 (二倍體) 植株

b. 四倍體植株

在文檔中 丹參葉培植體試管內形態發生及多倍體之誘導 (頁 46-57)