丹參的藥用價值

第一章緒論

1.3 丹參的藥用價值

丹參作為中草藥有很長的歷史，最早記載於《神農本草經》，並列為上品。在傳統中草藥學中，丹參有著活血袪瘀、調經止痛、養血安神等等功效 (呂，2002; Guo, 1992; Xiao et al., 2002; Zhou et al., 2005)。

丹參的主要活性成份可分為兩大類：一類是脂溶性二萜類 (diterpenoid)，如丹參酮I (tanshinone I)、丹參酮IIA (tanshinone IIA)、隱丹參酮 (cryptotanshinone) 等，另一類則是水溶性酚酸類 (phenolic

acids)，如丹參素 (salvianic acid A)、丹參酚酸A (salvianolic acid A)、丹

參酚酸B (salvianolic acid B)等 (Hu et al., 2005; Li et al., 2002)。至今已經從丹參辨識出超過30 種二萜類化合物 (Kong, 1989)。其中丹參酮是丹參

的主要活性成份，有抗氧化、消炎、抗微生物、抗腫瘤等等活性 (Zhu et

al. 2004; Zhou et al., 2005; Wang et al., 2007)。酚類則是可以保護局部缺血

引發的心肌、保護缺氧對神經細胞所造成的傷害、抑制血小板凝集、降低肝纖維化與HIV-1 的活性 (Ai and Li, 1992; Ai et al., 1994; Li, 1997;

Abd-Elazem et al., 2002; Lay et al., 2003 )。

市場上的丹參酮來源主要是從田間栽種的丹參根所萃取，其有效成份含量受到不同地區的地理、氣候等環境因素影響，而丹參的野外族群則是由於多年來的濫採而日益減少，因此利用植物組織培養是比較能夠大量生產，另一方面又能維持優良性狀的有效方法。

表1.1 丹參組織培養研究之概況 Explant types Basal

media

IAA or NAA in combination with or without 6-BA

Adventitious

第二章丹參葉片培養及植株再生

2.1 丹參組織培養之研究進展

根據Wang 等人 (1987) 對於丹參器官發生的報告：以幼葉及葉柄為

培植體，培養於添加 ① 1 mg/l 2,4-D ②

0.2 mg/l 6-BA

(6-benzylaminopurine) + 1 mg/l 2,4-D 或 ③ 1 mg/l 6-BA + 0.2 mg/l 2,4-D 於全量 MS (Murashige and Skoog, 1962) 的培養基中，可誘導出癒傷組織。以幼葉及葉柄為培植體，培養於添加

2 mg/l 6-BA 的

MS 培養基

Shimomura 等人則是在1991年以莖節 (nodal segments) 作培植體，

培養於添加1 mg/l 6-BA 的 MS 培養基中，誘導出芽。再以組培苗作培殖體，培養於0.5 mg/l IBA 的 Gamborg B5 培養基中八週，可從組培苗的葉柄 (petiole segments) 誘導出不定根 (adventitious roots)，其丹參酮含量超過

80 mg/g 乾重，是親代植物根中丹參酮含量的六倍。

在誘導癒傷組織方面，Chen 等人 (1981) 以根做培植體，置於含1

mg/l 2,4-D + 0.1 mg/l kinetin的MS培養基，誘導出癒傷組織。Zhao 等人 (1999) 則是以葉身 (leaf blade)作培植體，接種於含0.5–1 mg/l BA的MS

培養基，誘導出癒傷組織。

Tian and Wang (2003) 則是用1 mg/l 6-BA + 0.1 mg/l NAA的MS培養基從花藥誘導出癒傷組織。

2.2 材料與方法 2.2.1 植物材料

丹參 (Salvia miltiorrhiza) 瓶苗由昀保科技有限公司（台灣屏東）所提供。

2.2.2 培養基、容器及環境

基礎培養基為全量MS (Murashige and Skoog, 1962) 培養基添加 30 g/l 蔗糖、1 g/l peptone及 3 g/l 水晶洋菜，並添加不同濃度的植物生長調節劑。pH在水晶洋菜加入前先以 1 N NaOH 或 1 N HCl 調整至 5.8。經高溫 (121℃) 高壓 (15 psi) 殺菌 20 分鐘。培養容器為塑膠培養皿 (60 x 15 mm² petri dish, Greiner Labortechnik)。於無菌操作台在每個容器倒入約 10 ml 的培養基，以paraffin封口。置於黑暗中培養。

發根培養基主要成份為全量MS培養基添加 30 g/l 蔗糖、1 g/l peptone、0.5 mg/l NAA (1-naphthaleneacetic acid) 及 3 g/l 水晶洋菜。培養

容器為Magenta® GA7^TM培養盒 (77 x 77 x 97 mm³)。經高溫 (121℃) 高壓 (15 psi) 殺菌 20 分鐘，以paraffin封口。置於光照 (4.2-5.5 μmol·m^-2·s^-1, 16 小時光週期) 下培養 (Chiou et al., 2004)，光源為 18W植物燈 (東亞 FL-20BR/18)，溫度為 25 ± 2 ℃。

2.2.3 植物生長調節劑

植物生長素2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 與細胞分裂素 TDZ (N-phenyl-N-123-thiadiazol-5-yl urea)。

2.2.4 植物生長調節劑對丹參葉片培植體的影響

切取2 cm²左右丹參葉片，置入含2,4-D (0、1、2、5、10 mg/l) 與TDZ (0、0.1、0.5、1 mg/l) 共 20 種組合的培養基。在每盤 (60 x 15 mm petri dish) 置入四個培植體為一重覆、每處理四重複。

2.2.5 芽體 (shoot bud) 之誘導

在前述20 組處理中，只有含 TDZ 濃度 0.1、0.5、1 mg/l 的三組處理的葉培植體生長出不同程度的芽體。將這三組處理從petri dish 移植到含發根培養基的培養盒，每個培養盒置入一個葉培植體，每種處理五重複，

並紀錄最初芽體數量 (約 0.2 cm 以下不予計算)，約一個月後計算芽體數

量變化。

2.2.6 植株馴化

將健康無玻璃質化的芽體移入含全量MS 培養基添加 30 g/l 蔗糖、1 g/l peptone、0.5 mg/l IBA 及 9 g/l Agar 的蘭花瓶，約兩個月後 (植株約 10 公分高左右) 移出瓶外。移入培植土 (泥炭土、椰糠、珍珠石，翠筠)

前，先將植株浸於水中數分鐘。移入培植土後，用塑膠袋或保鮮膜包覆保持濕度。約兩個星期後，可拆開塑膠袋，將植株移往戶外。

2.3 結果

2.3.1 植物生長調節劑對丹參葉片培植體的影響

不同的 2,4-D 與 TDZ 濃度對於丹參葉培植體主要產生三種型態：

根、芽體以及癒傷組織。

在未添加任何植物生長調節劑的對照組，約第三週左右從葉柄傷口處及葉緣開始長出根 (見圖 2.1 a; 2.2 a)。而在未添加 2,4-D，只添加不同

濃度TDZ 的培養基，在約第四週從葉緣及葉柄傷口處長出芽體 (見圖 2.1 b; 2.2 b)。處理約兩個月後，可觀察到芽體發展出明顯的幼葉，將這三組處理的葉培植體從petri dish 移植到含發根培養基的培養盒。

其他濃度的2,4-D 及 TDZ 的處理，在三到四週後長出不同程度的癒

傷組織 (見圖 2.1 c,d; 2.2 c,d)。處理約兩個月後，從葉培植體取下癒傷組織，置入含原植物生長調節劑 (Plant Growth Regulators, PGRs) 濃度培養基的試管進行繼代。

2.3.2 丹參枝芽增殖率

在三組處理中，濃度0.5 mg/l TDZ 誘導芽體最多，平均每個葉培植體有44.4 個芽體；濃度 0.1 mg/l TDZ 的處理次佳，有 31.4 個芽體；濃度 1 mg/l TDZ 的處理最差，平均每個葉培植體只有 11.4 芽體。

將葉培植體從 petri dish 移植到含發根培養基的培養盒後約一個月後，濃度0.5 mg/l TDZ 的處理仍然在每個葉培植體平均有 38.0 個芽體；

0.1 mg/l TDZ 的處理次之 (29.8 shoots per explants)，1 mg/l TDZ 的處理再次之 (10.0 shoots per explants)。(見表 2.1; 圖 2.3)

2.4 討論

葉培植體在PGR-free 的對照組培養基中，可從葉緣及葉柄傷口處生成許多不定根，這可能代表葉片本身就有一定的內生性賀爾蒙，因此即使在沒有植物生長素誘導的情況下也能自行發根。

而在只有 TDZ、沒有 2,4-D 的培養基中，葉培植體可從葉緣長出不定芽。而在其他有 2,4-D 存在的培養基中，則都沒有芽體形成，這表示

像2,4-D 這樣的植物生長素會抑制不定芽的形成。

Thidiazuron (TDZ) 是一種人工合成的苯基脲類 (phenylurea) 化合

物，被廣泛用為棉花的落葉劑，近年來被使用於多種植物的組織培養與形態發生上 (Murthy et al., 1998)。相較於其他腺嘌呤類 (adenine) 細胞分裂素，TDZ在誘導木本植物的芽體器官形成方面有特別顯著的效果 (Briggs et al., 1988; Preece et al., 1991; Baker and Bhatia, 1993)。

Mišić 等人 (2006) 的報導指出，在Salvia brachyodon的試管內微體繁殖 中，BA誘導莖節 (nodal segments) 培植體生成腋芽 (axillary buds) 的效

激素的培養基，30 日後計算芽總數，按增殖芽總數(個) / 轉移芽數(個)

2011)。因此在置入發根培養基之前，應該先將健康無玻璃質化的植株挑

出，各別置於發根培養基中，降低密度、減少競爭。另外有關瓶內環境問題，Tsay (2011) 以玄蔘 (Scrophularia yoshimurae) 莖節為培植體以誘導芽體，在密封瓶內發現累積高濃度的乙烯與二氧化碳，作者認為瓶內氣體交換與否會影響瓶內植物的玻璃質化現象，因此將原來的密封瓶口的兩層鋁箔紙改為以四層藥包紙用石蠟膜 (parafilm) 加以固定，並在四週後移除石蠟膜進行氣體交換，此條件可以得到最多健康植株。

表2.1 2,4-D 與 TDZ 誘導丹參葉培植體之芽體數 Treatments (mg/l) Number of shoot buds 2,4-D TDZ 60 days 120 days

0 0 0 0 c

0 0.1 31.4 29.8 a

0 0.5 44.4 38.0 a

0 1.0 11.4 10.0 b

試驗結果以鄧肯氏多變域分析法 (Duncan’s Multiple Range Test)進行平均值的差異比較 (P﹤0.05)。

圖2.1 2,4-D 與 TDZ 對丹參葉片培植體的影響 (bar) a. PGR-free 的對照組在第三週的情況 (0.50 cm) b. 0.1 mg/l TDZ 的處理組在第三週的情況 (0.50 cm) c. 1 mg/l 2,4-D 的處理組在第三週的情況 (0.50 cm)

d. 2mg/l 2,4-D + 1mg/l TDZ 的處理組在第三週的情況 (0.50 cm)

圖2.2 2,4-D 與 TDZ 對丹參葉片培植體的影響 (bar) a. PGR-free 的對照組在第四週的情況 (0.50 cm) b. 0.1 mg/l TDZ 的處理組在第四週的情況 (0.50 cm) c. 1 mg/l 2,4-D 的處理組在第四週的情況 (0.50 cm)

d. 2mg/l 2,4-D + 1mg/l TDZ 的處理組在第四週的情況 (0.50 cm)

圖2.3 TDZ 誘導丹參葉培植體之芽體形成 (bar) a. 0.1 mg/l TDZ 的處理組在第八週的情況 (0.50 cm) b. 0.1 mg/l TDZ 的處理組在第八週的情況 (0.50 cm) c. 0.1 mg/l TDZ 的處理組在第十六週的情況 (1.4 cm) d. 1.0 mg/l TDZ 的處理組在第十六週的情況 (1.2 cm)

第三章癒傷組織誘導、形態發生與植株再生

Kintzios 等人 (1999) 則是報導了Salvia officinalis 與 S. fruticosa 葉癒傷組織的體胚形成。體胚形成 (somatic embryogenesis) 是指體細胞未經受精作用，直接或間接形態發育為具形態雙極性與發芽能力的擬胚 (Hopkins, 1995; Taiz and Zeiger, 2006)。Kintzios等人 (1999)指出，不管培養基植物生長調節劑成份為何，癒傷組織的誘導皆伴隨著球形胚的形成，但是只有在特定濃度的植物生長調節劑下，原胚與球形胚才會進一 步發展成為心形胚與魚雷形胚。S. officinalis的球形胚需要10.5 μM (1.96

mg/l) NAA + 10.5 μM (2.37 mg/l) BA的培養基、S. fruticosa的球形胚則是 需要10.5 μM (1.96 mg/l) NAA + 21.0 μM (4.73 mg/l) BA的培養基才會繼續發展成為成熟體胚。

3.2 材料與方法

3.2.1 培養基、容器及環境

癒傷組織的繼代培養基，植物生長調節劑與原來濃度相同 (1、2、5、

10 mg/l 2,4-D x 0、0.1、0.5、1 mg/l TDZ)。但培養容器由塑膠培養皿 (60 x 15 mm petri dish) 換為 150 x 20 mm 的試管。每個試管裝 10 ml 的培養基。單層鋁箔紙封口。經高溫 (121℃) 高壓 (15 psi) 殺菌 20 分鐘，置成斜面。置於黑暗中培養。

3.2.2 丹參癒傷組織增殖率

從第 2 章實驗結果可以得知，除了控制組長出根、三組TDZ處理長出芽體之外，其他處理皆長出不同程度的癒傷組織。將長出癒傷組織的葉片培植體處理，取下約2 x 2 x 2 mm³ 的癒傷組織，置入含原植物生長調節劑 (見第 2 章 2.4 節) 組成培養基的試管 (150 x 20 mm) 進行繼代培養，每種處理五重複。癒傷組織增殖率之計算以癒傷組織的最終重量除以初始重量，一個月後將癒傷組織取出秤重，計算癒傷組織重量變化。

3.2.3 丹參癒傷組織之試管內形態發生

將繼代處理的癒傷組織取下約2 x 2 x 2 mm³ 作為培植體，分別置入含0、0.1、1 mg/l TDZ之培養基的試管 (150 x 20 mm)，置於光照下，每種處理五重複。一個月後觀察其試管內形態發生，並誘導植株再生。

3.2.4 BA 與 NAA 對丹參癒傷組織形態發生的影響

為了觀察不同比例植物生長素 (如NAA) 與細胞分裂素 (如BA) 對癒傷組織形態發生的影響，因此將癒傷組織置於含不同濃度BA與NAA培養基，以觀察植物生長素與細胞分裂素比例高低對其形態發生的影響。

將1.0 mg/l 2,4-D + 0.1 mg/l TDZ之品系的癒傷組織作為培植體，取下約 2 x 2 x 2 mm³置入含不同濃度BA (0、0.01、0.1、1、10 mg/l)與NAA (0、0.01、

0.1、1、10 mg/l) 之培養基的試管 (150 x 20 mm)，置於光照下，每種處理五重複。一個月後觀察其試管內形態發生。

3.2.5 BA 與 IBA 對不定芽發根的影響

為了測試從癒傷組織所誘導而來的不定芽之最佳發根培養基，將不定芽置於含不同濃度的BA 與 IBA 培養基促進發根。以 10.0 mg/l 2,4-D + 1.0 mg/l TDZ 之品系的癒傷組織以 1 mg/l TDZ 所誘導生成的不定芽作為培植

體，置於含不同濃度BA (0、0.05、0.25 mg/l) 與 IBA (0、0.05、0.25 mg/l) 之培養基的試管 (150 x 20 mm)，置於光照下，每種處理五重複。一個半月後觀察其發根情況。

3.2.6 植株馴化

將健康無玻璃質化的芽體移入含全量MS 培養基添加 30 g/l 蔗糖、1 g/l peptone、0.5 mg/l IBA 及 9 g/l Agar 的蘭花瓶，約兩個月後 (植株約 10 公分高左右) 移出瓶外。移入培植土前，先將植株浸於水中數分鐘。

移入培植土後，用塑膠袋或保鮮膜包覆保持濕度。約兩個星期後，可拆開塑膠袋，將植株移往戶外。

3.2.7 統計分析

試驗結果使用鄧肯氏多變域分析 (Duncan’s multiple range test, p <

0.05) 計算顯著差異性。

3.3 結果

3.2.1 丹參癒傷組織增殖率

癒傷組織繼續繼代的結果，有些處理褐化死亡、有些處理增殖出更多癒傷組織 (見圖 3.1)。一個月後，濃度 5 mg/l 2,4-D + 0.1 mg/l TDZ 之

處理其癒傷組織增殖率最高，平均達26.73 倍；濃度 10 mg/l 2,4-D + 0.1 mg/l TDZ 之處理次之 (19.13 倍)，5 mg/l 2,4-D 之處理再次之 (18.70 倍)。

(見表 3.1)

3.2.2 丹參癒傷組織之試管內形態發生

癒傷組織之試管內形態發生的結果，在未添加TDZ 的控制組，在處理約一週後開始發根。第3 週時計算每一培植體上長度大於 0.5 mm 的根數目，結果顯示：原濃度 5 mg/l 2,4-D + 0.5 mg/l TDZ 之癒傷組織在未添

加TDZ 的控制組中，發根數最多，平均每個培植體生成 24 條根；濃度 10

在文檔中丹參葉培植體試管內形態發生及多倍體之誘導 (頁 14-0)

第一章 緒論