丹參葉培植體試管內形態發生及多倍體之誘導

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(1)國立高雄大學生物科技研究所碩士論文. 丹參葉培植體試管內形態發生及多倍體之誘導 In Vitro Morphogenesis from Leaf Explants and Induction of Polyploids of Salvia miltiorrhiza Bunge.. 研究生：蔡岡倫撰指導教授：陳彥澄博士. 中華民國一百年七月.

(2) 謝誌 Acknowledgement 本論文的完成，首先要感謝指導教授陳彥澄博士孜孜不倦的教導，使論文得以成型乃至完成。初稿完成後，感謝口試委員李金龍老師與王恆隆老師的批閱指正。另外要感謝昀保科技有限公司提供丹參種苗、以及鄧博士澄欣、同學伯倫、學妹以航、學弟世揚在平日實驗上的幫忙與照顧，讓原本對於植物實驗一竅不通的我，也能獨力進行實驗，並學習到許多知識與技術。最後感謝父母在背後默默支持，在我徬徨焦慮時作為精神支柱帶我渡過難關，在此一併致上深深的謝意。. 學生蔡岡倫謹誌中華民國一百年七月. i.

(3) 縮寫表 Abbreviations 2, 4-D. 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. BA. N6-benzyladenine / 6-benzylaminopurine. IAA. indole-3-acetic acid. IBA. indole-3-butyric acid. MS. Murashige and Skoog medium (1962). NAA. α-naphthaleneacetic acid. PGRs. plant growth regulators. TDZ. N-phenyl-N’-1,2,3-thiadiazol-5-yl urea. ii.

(4) 目錄 Contents 頁次謝誌 ………………………………………………………………………... i 縮寫表 ……………………………………………………………………... ii 目錄 ……………………………………………………………………….. iii 表目錄 …………………………………………………………………….. v 圖目錄 …………………………………………………………………….. vi. 中文摘要 …………………………………………………………………... 1 英文摘要 …………………………………………………………………… 3. 第一章緒論 ……………………………………………………………….. 5 1.1 丹參的植物學特性 ……………………………………………………. 5 1.2 丹參的組織培養 ………………………………………………………. 6 1.3 丹參的藥用價值 ………………………………………………………. 7. 第二章葉培植體器官形成及植株再生 ……………………………….. 10 2.1 丹參組織培養之研究進展………………………………………. 10 2.2 材料與方法 …………………………………………………………. 11. iii.

(5) 2.3 結果 …………………………………………………………………... 13 2.4 討論 …………………………………………………………………... 14. 第三章癒傷組織誘導、形態發生與植株再生 …………………………. 22 3.1 前人研究 ……………………………………………………………... 22 3.2 材料與方法 …………………………………………………………... 23 3.3 結果 …………………………………………………………………... 25 3.4 討論 …………………………………………………………………... 28. 第四章多倍體之誘導 ……………..…………..………………………… 39 4.1 多倍體之研究進展………………………..…………………………… 39 4.2 材料與方法 …………………………………………………………… 41 4.3 結果 …………………………………………………………………… 43 4.4 討論 …………………………………………………………………… 44. 第五章參考文獻 ………………………………………………………… 50. iv.

(6) 表目錄頁次表 1.1 丹參組織培養之前人研究 ………………………………………… 9 表 2.1 2,4-D 與 TDZ 誘導丹參葉培植體之芽體數 ……………………… 18 表 3.1 丹參葉培植體癒傷組織的增殖率 ……………………………….. 30 表 3.2 癒傷組織器官發生之不定根誘導數 ………………………..…… 31 表 3.3 癒傷組織器官發生之不定芽誘導數 …………………………..… 32 表 3.4 BA 與 NAA 對癒傷組織形態發生的影響 ……………………..… 33 表 3.5 BA 與 IBA 對不定芽發根的影響……………………………………34 表 4.1 秋水仙鹼對誘導丹參葉培植體芽體的影響 …………………..... 46 表 4.2 秋水仙鹼誘導葉培植體形成多倍體的結果………………………47. v.

(7) 圖目錄頁次圖 2.1 2,4-D 與 TDZ 對丹參葉片培植體的影響 ……………………….… 19 圖 2.2 2,4-D 與 TDZ 對丹參葉片培植體的影響 ………………………… 20 圖 2.3 TDZ 誘導丹參葉培植體之芽體形成 ……………………..……… 21 圖 3.1 丹參葉培植體癒傷組織的增殖率 ……………………………..… 35 圖 3.2 癒傷組織之形態發生 …………………………………………..… 36 圖 3.3 BA 與 NAA 對癒傷組織形態發生的影響 ………………..……… 37 圖 3.4 BA 與 IBA 對不定芽發根的影響……………………………………38 圖 4.1 秋水仙鹼誘導丹參葉培植體芽體 ……………………………..… 48 圖 4.2 流式細胞儀直方圖………………………………………………….49. vi.

(8) 丹參葉培植體試管內形態發生及多倍體之誘導指導教授：陳彥澄博士國立高雄大學生物科技研究所學生：蔡岡倫國立高雄大學生物科技研究所摘要本試驗以丹參葉片作為培植體，培養於含不同濃度的植物生長調節劑（PGR）的改良式 MS 培養基。結果顯示，在 PGR-free 的對照組，培養四週後從葉緣長出根。葉培植體培養在添加不同濃度 TDZ 的培養基四週後，從葉緣及葉柄傷口處長出芽體。此外，其他濃度的 2,4-D 及 TDZ 的處理，在三到四週後長出不同程度的癒傷組織。在形成芽體的處理中，濃度 0.5 mg/l TDZ 的培養基誘導最多芽體，平均每個葉培植體有 44.4 個芽體。將其所誘導的芽體移至發根培養基，可繼續發育為完整植株。在形成癒傷組織的處理中，濃度 5 mg/l 2,4-D + 0.1 mg/l TDZ 之處理其癒傷組織增殖率最高，平均達 27.73 倍。將各癒傷組織品系置入含 0、0.1、1 mg/l TDZ 之培養基觀察其試管內形態發生，結果顯示，置於 PGR-free 的各癒傷組織品系生成不定根。置於 TDZ 培養基之癒傷組織則會生成叢生芽，其中以 10.0 mg/l 2,4-D + 1.0 mg/l TDZ 品系的癒傷組織置於 1.0 mg/l TDZ 的 MS 培養基生成最多不定芽，平均每個培植體生成 28.4 個芽體。在 BA 與 NAA 對癒傷組織形態發生的影響方面，NAA 濃度越高則癒傷組織傾向發根、BA 濃度越高則傾向生成不定芽。癒傷組織所誘導的不定芽其最佳發根培養基是 0.25 mg/l BA+ 0.25 mg/l IBA 的培養基，平均發根數為每培植體 13.0 條根。在秋水仙鹼誘導葉培植體發芽方面，以原濃度 2 mg/l 秋水仙鹼+ 0.5 mg/l TDZ 的培養基處理組芽體數最多，平均每片葉培植體有 10.33 個芽體。在誘導多倍體方面，. 1.

(9) 濃度 0.5 mg/l ~ 2 mg/l 秋水仙鹼 + 0.5 mg/l TDZ 的處理組皆從原葉培植體各誘導出一株四倍體植株。. 關鍵字：癒傷組織、形態發生、多倍體、組織培養、丹參. 2.

(10) In Vitro Morphogenesis from Leaf Explants and Induction of Polyploids of Salvia miltiorrhiza Bge. Advisor: Dr. Jen-Tsung Chen Institute of Biotechnology National University of Kaohsiung Student: Kang-Lun Tsai Institute of Biotechnology National University of Kaohsiung ABSTRACT Leaves of Salvia miltiorrhiza were used as explants to culture on MS medium with different concentrations of plant growth regulators. The results showed that shoots could be induced by 0.1-1 mg/l of TDZ. The treatment of 0.5 mg/l TDZ promoted shoot induction significantly, with 44.4 shoots per explants respectively. Callus could be induced by 1-10 mg/l of 2,4-D + 0.1-1 mg/l of TDZ. Callus cultured on MS medium with 5 mg/l 2,4-D + 0.1 mg/l TDZ had highest proliferation rate, with 27.73 folds respectively. Calluses were cultured on 0-1 mg/l of TDZ to observe in vitro morphogenesis of S. miltiorrhiza. Callus line of 10.0 mg/l 2,4-D + 1.0 mg/l TDZ cultured on MS medium with 1.0 mg/l TDZ induce adventitious shoots effectively, with 28.4 shoots per explants respectively. The results suggest that higher concentration of TDZ favored induction of adventitious shoot formation. Calluses were also treated with different ratio of BA and NAA. The results showed that higher NAA/BA ratio favored root induction, and lower NAA/BA ratio favored adventitious shoot induction. The optical rooting medium for. 3.

(11) callus-induced shoots was 0.25 mg/l BA+ 0.25 mg/l IBA. 0.5-4 mg/l of Colchicine were used to induce polyploidy of S. miltiorrhiza. Colchicine inhibited morphogenesis of leaf explants of S. miltiorrhiza significantly. Leaf explants cultured on 2 mg/l colchicine + 0.5 mg/l TDZ had highest number of regenerated shoots per explants. Flow cytometry were used to determine polyploidys. The result shows that leaf explants treated with 0.5, 1.0, and 2.0 mg/l colchicine + 0.5 mg/l TDZ each gain one tetraploid plantlet respectively.. Key words: callus; morphogenesis; polyploidy; tissue culture; Salvia miltiorrhiza. 4.

(12) 第一章緒論 1.1 丹參的分佈及植物學特性目前可作為丹參的鼠尾草屬 (Salvia) 植物有 40 多種 (徐，1990; 肖 et al., 1999)，包括丹參 (S. miltiorrhiza)、甘西鼠尾草 (S. przewalskii)、南丹參 (S. bowleyana) 等，其中在傳統醫學指的丹參是丹參 (Salvia miltiorrhiza) 的乾燥根。丹參 (S. miltiorrhiza) 又名鼠尾草、赤參，是一種唇形科 (Lamiaceae) 的多年生草本植物。主要分布於中國四川、安徽、江蘇、河南、山西及日本等地的草地、山坡與溪谷中 (Clebsch and Barner, 2003; Li et al. 2008)。丹參的主根為紅色，是主要藥用部位，一般在春、秋兩季採收，除去莖葉後洗淨曬乾。冬季地上部枯萎，春夏季生長開花。開花時莖高可達約 30-60 cm，花序長約 30 cm，花色為淡紫或薰衣草藍色 (Clebsch and Barner, 2003)。丹參偏好溫暖溼潤、日照充足的環境。丹參根系發達，深可達 35-55 cm，需要栽種於深厚疏鬆、土質肥沃、通氣良好的土壤中，不適合種植於黏性不透氣的土壤中 (林等，2005)。近年來市場對於丹參的需求日漸增加，但是野生丹參資源有限、市場上的丹參品質參差不齊，且幾乎完全仰賴進口，因此發展一套丹參的試管內再生體系有其價值。. 5.

(13) 1.2 丹參的組織培養形態發生 (morphogenesis) 是指植物在發育或再生過程中，因細胞或組織的分化，而使其器官或個體形態結構形成的過程 (Taiz and Zeiger, 2006)。器官發生 (organogenesis) 則是形態發生的一種，是指由細胞或組織形成芽、根等器官的發育過程 (Taiz and Zeiger, 2006)。器官發生又分為直接器官發生與間接器官發生；直接器官發生是由培植體表面直接形成器官，而間接器官發生則是先形成癒傷組織再分化形成器官。植物生長調節劑是影響植物形態發生最重要的因子之一 (Zimmerman, 1993)。在丹參的形態發生研究中，細胞分裂素 (如 BA) 有利於丹參試管內芽體的誘導，而植物生長素 (如 2,4-D 與 NAA) 則不利於芽體的誘導 (Xie et al., 2004)。此外，溫度與光照也會影響丹參的形態發生，Zhao 等人 (2004) 對不定芽增殖的適合溫度與光照做實驗，發現在 10℃以下及 40℃以上都不會有芽體形成，而在 40℃與綠光和白光下處理增殖率最好，增殖率可達 98.5%。在丹參的器官發生研究中，以葉 (Wang and Liu, 1987)、葉柄 (Wang and Liu, 1987) 、莖節 (Shimomura and Kitazawa, 1991) 為培植體，置於含 BA 的 MS 培養基可誘導出芽體或不定芽。將這些再生芽接種於空白培養基 (Wang and Liu, 1987) 或是含 IBA 的½ MS 培養基 (Cai et al. 1991)，則可誘導發根 (見表 1.1)。. 6.

(14) 以葉 (Wang and Liu, 1987)、葉柄 (Wang and Liu, 1987)、根 (Chen et al., 1981)、葉身 (Zhao et al., 2004)、花藥 (Tian and Wang, 2003) 做培植體，置於含 2,4-D、BA 或 NAA 的 MS 培養基，則可誘導出癒傷組織。在誘導癒傷組織的最佳培養基方面：以葉柄做培植體，最佳培養基是含 0.5 mg/l 2,4-D + 1.0 mg/l BA 的 MS 培養基、且癒傷組織在光照下生長速度快於黑暗中 (Feng et al., 2004)。以莖 (stem) 為培植體，誘導癒傷組織效率最高的培養基是含 5.0 mg/l 2,4-D + 0.2 mg/l NAA + 1.0 mg/l BA 的 MS 培養基 (Ke et al., 2005)。(見表 1.1). 1.3 丹參的藥用價值丹參作為中草藥有很長的歷史，最早記載於《神農本草經》，並列為上品。在傳統中草藥學中，丹參有著活血袪瘀、調經止痛、養血安神等等功效 (呂，2002; Guo, 1992; Xiao et al., 2002; Zhou et al., 2005)。丹參的主要活性成份可分為兩大類：一類是脂溶性二萜類 (diterpenoid)，如丹參酮I (tanshinone I)、丹參酮IIA (tanshinone IIA)、隱丹參酮 (cryptotanshinone) 等，另一類則是水溶性酚酸類 (phenolic acids)，如丹參素 (salvianic acid A)、丹參酚酸A (salvianolic acid A)、丹參酚酸B (salvianolic acid B)等 (Hu et al., 2005; Li et al., 2002)。至今已經從丹參辨識出超過 30 種二萜類化合物 (Kong, 1989)。其中丹參酮是丹參. 7.

(15) 的主要活性成份，有抗氧化、消炎、抗微生物、抗腫瘤等等活性 (Zhu et al. 2004; Zhou et al., 2005; Wang et al., 2007)。酚類則是可以保護局部缺血引發的心肌、保護缺氧對神經細胞所造成的傷害、抑制血小板凝集、降低肝纖維化與HIV-1 的活性 (Ai and Li, 1992; Ai et al., 1994; Li, 1997; Abd-Elazem et al., 2002; Lay et al., 2003 )。市場上的丹參酮來源主要是從田間栽種的丹參根所萃取，其有效成份含量受到不同地區的地理、氣候等環境因素影響，而丹參的野外族群則是由於多年來的濫採而日益減少，因此利用植物組織培養是比較能夠大量生產，另一方面又能維持優良性狀的有效方法。. 8.

(16) 表 1.1 丹參組織培養研究之概況 Explant types. Basal media. PGRs. In vitro morphogenesis. References. Leaf and petiole. MS. 2.0 mg/l BA. Buds and complete shoots. Wang and Liu, 1987. 1.0 mg/l 2,4-D 0.2 mg/l BA + 1.0 mg/l 2,4-D. Callus. 1.0 mg/l BA + 0.2 mg/l 2,4-D. Regenerated shoot. ½ MS. PGR-free. Roots. Leaf Regenerated bud. MS ½ MS. 0.5 ~ 1.0 mg/l BA 0.2 mg/l IBA. Buds Roots. Cai et al., 1991. Leaf. MS. 1.0 mg/l BA. Callus and clustered buds. Xie et al., 2004. Stem tip. 0.5 ~ 1.0 mg/l BA. Shoots. Shoot. 1.0 mg/l IBA + 1.0 mg/l KT. Roots. Leaf blade. MS. 0.5–1 mg/L 6-BA. Callus. Zhao et al., 2004. Nodal segment. MS. 1.0 mg/L 6-BA. Shoots. Shimomura and Kitazawa 1991. Petiole segments of shoot. Gamborg B5 solid medium. IAA or NAA in combination with or without 6-BA. Adventitious roots. Nodal segment. MS. 1.0 mg/L BA + 0.1 mg/L NAA. Shoots. Chen et al., 2005. Stem. MS. 5.0 mg/L 2,4-D + 0.2 mg/L NAA + 1.0 mg/L 6-BA. Callus. Ke et al., 2005. Root. MS. 1 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L kinetin. Callus. Chen et al., 1981. Anther. MS. 1 mg/l 6-BA + 0.1 mg/l NAA. Callus. Tian and Wang, 2003. 9.

(17) 第二章丹參葉片培養及植株再生 2.1 丹參組織培養之研究進展根據Wang 等人 (1987) 對於丹參器官發生的報告：以幼葉及葉柄為培植體，培養於添加①. 1 mg/l 2,4-D ②. 0.2 mg/l 6-BA. (6-benzylaminopurine) + 1 mg/l 2,4-D 或 ③ 1 mg/l 6-BA + 0.2 mg/l 2,4-D 於全量 MS (Murashige and Skoog, 1962) 的培養基中，可誘導出癒傷組織。以幼葉及葉柄為培植體，培養於添加 2 mg/l 6-BA 的 MS 培養基中，可誘導出芽。組培苗培養於不含任何植物生長調節劑的 ½ MS 培養基中，可誘導生根。根據 Cai 等人 (1991) 對於丹參組織培養的實驗：以葉片為培植體，培養於添加 0.5-1 mg/l 的 6-BA 的 MS 培養基出芽效果最好，發根培養基則是以 ½ MS 培養基添加 0.2 mg/l 的 IBA (indole-3-butyric acid) 生根效果最好。 Shimomura 等人則是在1991年以莖節 (nodal segments) 作培植體，培養於添加1 mg/l 6-BA 的 MS 培養基中，誘導出芽。再以組培苗作培殖體，培養於0.5 mg/l IBA 的 Gamborg B5 培養基中八週，可從組培苗的葉柄 (petiole segments) 誘導出不定根 (adventitious roots)，其丹參酮含量超過 80 mg/g 乾重，是親代植物根中丹參酮含量的六倍。在誘導癒傷組織方面，Chen 等人 (1981) 以根做培植體，置於含1. 10.

(18) mg/l 2,4-D + 0.1 mg/l kinetin的MS培養基，誘導出癒傷組織。Zhao 等人 (1999) 則是以葉身 (leaf blade)作培植體，接種於含0.5–1 mg/l BA的MS 培養基，誘導出癒傷組織。Tian and Wang (2003) 則是用1 mg/l 6-BA + 0.1 mg/l NAA的MS培養基從花藥誘導出癒傷組織。. 2.2 材料與方法 2.2.1 植物材料丹參 (Salvia miltiorrhiza) 瓶苗由昀保科技有限公司（台灣屏東）所提供。. 2.2.2 培養基、容器及環境基礎培養基為全量MS (Murashige and Skoog, 1962) 培養基添加 30 g/l 蔗糖、1 g/l peptone及 3 g/l 水晶洋菜，並添加不同濃度的植物生長調節劑。pH在水晶洋菜加入前先以 1 N NaOH 或 1 N HCl 調整至 5.8。經高溫 (121℃) 高壓 (15 psi) 殺菌 20 分鐘。培養容器為塑膠培養皿 (60 x 15 mm2 petri dish, Greiner Labortechnik)。於無菌操作台在每個容器倒入約 10 ml 的培養基，以paraffin封口。置於黑暗中培養。發根培養基主要成份為全量MS培養基添加 30 g/l 蔗糖、1 g/l peptone、0.5 mg/l NAA (1-naphthaleneacetic acid) 及 3 g/l 水晶洋菜。培養. 11.

(19) 容器為Magenta® GA7TM培養盒 (77 x 77 x 97 mm3)。經高溫 (121℃) 高壓 (15 psi) 殺菌 20 分鐘，以paraffin封口。置於光照 (4.2-5.5 μmol·m-2·s-1, 16 小時光週期) 下培養 (Chiou et al., 2004)，光源為 18W植物燈 (東亞 FL-20BR/18)，溫度為 25 ± 2 ℃。. 2.2.3 植物生長調節劑植物生長素 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 與細胞分裂素 TDZ (N-phenyl-N-123-thiadiazol-5-yl urea)。. 2.2.4 植物生長調節劑對丹參葉片培植體的影響切取 2 cm2左右丹參葉片，置入含 2,4-D (0、1、2、5、10 mg/l) 與TDZ (0、0.1、0.5、1 mg/l) 共 20 種組合的培養基。在每盤 (60 x 15 mm petri dish) 置入四個培植體為一重覆、每處理四重複。. 2.2.5 芽體 (shoot bud) 之誘導在前述 20 組處理中，只有含 TDZ 濃度 0.1、0.5、1 mg/l 的三組處理的葉培植體生長出不同程度的芽體。將這三組處理從 petri dish 移植到含發根培養基的培養盒，每個培養盒置入一個葉培植體，每種處理五重複，並紀錄最初芽體數量 (約 0.2 cm 以下不予計算)，約一個月後計算芽體數. 12.

(20) 量變化。. 2.2.6 植株馴化將健康無玻璃質化的芽體移入含全量 MS 培養基添加 30 g/l 蔗糖、1 g/l peptone、0.5 mg/l IBA 及 9 g/l Agar 的蘭花瓶，約兩個月後 (植株約 10 公分高左右) 移出瓶外。移入培植土 (泥炭土、椰糠、珍珠石，翠筠) 前，先將植株浸於水中數分鐘。移入培植土後，用塑膠袋或保鮮膜包覆保持濕度。約兩個星期後，可拆開塑膠袋，將植株移往戶外。. 2.3 結果 2.3.1 植物生長調節劑對丹參葉片培植體的影響不同的 2,4-D 與 TDZ 濃度對於丹參葉培植體主要產生三種型態：根、芽體以及癒傷組織。在未添加任何植物生長調節劑的對照組，約第三週左右從葉柄傷口處及葉緣開始長出根 (見圖 2.1 a; 2.2 a)。而在未添加 2,4-D，只添加不同濃度 TDZ 的培養基，在約第四週從葉緣及葉柄傷口處長出芽體 (見圖 2.1 b; 2.2 b)。處理約兩個月後，可觀察到芽體發展出明顯的幼葉，將這三組處理的葉培植體從 petri dish 移植到含發根培養基的培養盒。其他濃度的 2,4-D 及 TDZ 的處理，在三到四週後長出不同程度的癒. 13.

(21) 傷組織 (見圖 2.1 c,d; 2.2 c,d)。處理約兩個月後，從葉培植體取下癒傷組織，置入含原植物生長調節劑 (Plant Growth Regulators, PGRs) 濃度培養基的試管進行繼代。. 2.3.2 丹參枝芽增殖率在三組處理中，濃度 0.5 mg/l TDZ 誘導芽體最多，平均每個葉培植體有 44.4 個芽體；濃度 0.1 mg/l TDZ 的處理次佳，有 31.4 個芽體；濃度 1 mg/l TDZ 的處理最差，平均每個葉培植體只有 11.4 芽體。將葉培植體從 petri dish 移植到含發根培養基的培養盒後約一個月後，濃度 0.5 mg/l TDZ 的處理仍然在每個葉培植體平均有 38.0 個芽體； 0.1 mg/l TDZ 的處理次之 (29.8 shoots per explants)，1 mg/l TDZ 的處理再次之 (10.0 shoots per explants)。(見表 2.1; 圖 2.3). 2.4 討論葉培植體在 PGR-free 的對照組培養基中，可從葉緣及葉柄傷口處生成許多不定根，這可能代表葉片本身就有一定的內生性賀爾蒙，因此即使在沒有植物生長素誘導的情況下也能自行發根。而在只有 TDZ、沒有 2,4-D 的培養基中，葉培植體可從葉緣長出不定芽。而在其他有 2,4-D 存在的培養基中，則都沒有芽體形成，這表示. 14.

(22) 像 2,4-D 這樣的植物生長素會抑制不定芽的形成。其他不同濃度 2,4-D 及 TDZ 培養基處理中，葉培植體大多生成癒傷組織。值得注意的是在沒有 TDZ、而 2,4-D 濃度為 1 mg/l 的處理中，可以同時觀察到癒傷組織和少量極短的不定根。而其它處理 (除對照組外) 都沒有觀察到不定根的形成，由此可以推論像 TDZ 這樣的細胞分裂素不利於丹參根的形成。 Thidiazuron (TDZ) 是一種人工合成的苯基脲類 (phenylurea) 化合物，被廣泛用為棉花的落葉劑，近年來被使用於多種植物的組織培養與形態發生上 (Murthy et al., 1998)。相較於其他腺嘌呤類 (adenine) 細胞分裂素，TDZ在誘導木本植物的芽體器官形成方面有特別顯著的效果 (Briggs et al., 1988; Preece et al., 1991; Baker and Bhatia, 1993)。 Mišić 等人 (2006) 的報導指出，在Salvia brachyodon的試管內微體繁殖中，BA誘導莖節 (nodal segments) 培植體生成腋芽 (axillary buds) 的效率要比TDZ來得好，此外作者還發現高濃度的TDZ會顯著抑制芽體抽長 (shoot elongation) ，在 S. fruticosa 也發現類似的情形 (Arikat et al., 2004)。 Feng (2004)以 0.3 cm × 0.3 cm 的葉片做培植體，接種於含不同植物激素的培養基，25 日後計算不定芽數量，結果顯示，誘導不定芽的最佳培養基為 MS + 0.5~2 mg/l BA。接著再將誘導的不定芽接種到含不同植物. 15.

(23) 激素的培養基，30 日後計算芽總數，按增殖芽總數(個) / 轉移芽數(個) 的公式計算增殖倍數。結果顯示，最佳不定芽增殖培養基是 MS + 1.0 mg/l BA，其不定芽增殖倍率可達 24.1 倍。而由本實驗可知，以 0.5 mg/l TDZ 為培養基處理兩個月，可從單一葉片誘導出平均 44.4 個芽體，移至發根培養基一個月後每個葉培植體平均仍有 38.0 個芽體，增殖倍率也相當高。本實驗以 TDZ 來誘導葉培植體在不經過癒傷組織的階段下直接從葉緣處產生叢生芽，之後將健康無玻璃質化的芽體移入發根培養基，約兩個月後移出瓶外進行馴化，如此建立了一套完整的試管內微體繁殖體系。值得注意的是，TDZ 濃度並不是越高就能誘導越多芽體。當 TDZ 濃度為 1 mg/l 時，葉培植體產生了許多畸形發育不良的叢生芽。將培植體移入含 0.5 mg/l NAA 的發根培養基後，幼苗除了發根以外，還產生了許多癒傷組織。之後將發根培養基改為 0.5 mg/l IBA 後，癒傷組織生成率大幅降低。另外在進行丹參繼代時，原先採用 PGR-free 的 MS 水晶洋菜培養基進行繼代，結果繼代出來的丹參大多玻璃質化。後來改用含 0.5 mg/l IBA 的½ MS 洋菜培養基進行繼代，原先繼代玻璃質化嚴重的問題大幅改善。雖然以 TDZ 能從葉片培植體誘導出大量芽體，然而大多數芽體均有玻璃質化 (hyperhydricity) 現象。植株間的競爭、瓶內的濕度、透氣度、植株本身產生的廢氣環境因素等可能是造成玻璃質化的原因 (Tsay,. 16.

(24) 2011)。因此在置入發根培養基之前，應該先將健康無玻璃質化的植株挑出，各別置於發根培養基中，降低密度、減少競爭。另外有關瓶內環境問題，Tsay (2011) 以玄蔘 (Scrophularia yoshimurae) 莖節為培植體以誘導芽體，在密封瓶內發現累積高濃度的乙烯與二氧化碳，作者認為瓶內氣體交換與否會影響瓶內植物的玻璃質化現象，因此將原來的密封瓶口的兩層鋁箔紙改為以四層藥包紙用石蠟膜 (parafilm) 加以固定，並在四週後移除石蠟膜進行氣體交換，此條件可以得到最多健康植株。. 17.

(25) 表 2.1 2,4-D 與 TDZ 誘導丹參葉培植體之芽體數 Treatments (mg/l) 2,4-D TDZ 0 0 0 0.1 0 0.5 0 1.0. Number of shoot buds 60 days 120 days 0 0 c 31.4 29.8 a 44.4 38.0 a 11.4 10.0 b. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法 (Duncan’s Multiple Range Test)進行平均值的差異比較 (P﹤0.05)。. 18.

(26) 圖 2.1 2,4-D 與 TDZ 對丹參葉片培植體的影響 (bar) a. PGR-free 的對照組在第三週的情況 (0.50 cm) b. 0.1 mg/l TDZ 的處理組在第三週的情況 (0.50 cm) c. 1 mg/l 2,4-D 的處理組在第三週的情況 (0.50 cm) d. 2mg/l 2,4-D + 1mg/l TDZ 的處理組在第三週的情況 (0.50 cm). 19.

(27) 圖 2.2 2,4-D 與 TDZ 對丹參葉片培植體的影響 (bar) a. PGR-free 的對照組在第四週的情況 (0.50 cm) b. 0.1 mg/l TDZ 的處理組在第四週的情況 (0.50 cm) c. 1 mg/l 2,4-D 的處理組在第四週的情況 (0.50 cm) d. 2mg/l 2,4-D + 1mg/l TDZ 的處理組在第四週的情況 (0.50 cm). 20.

(28) 圖 2.3 TDZ 誘導丹參葉培植體之芽體形成 (bar) a. 0.1 mg/l TDZ 的處理組在第八週的情況 (0.50 cm) b. 0.1 mg/l TDZ 的處理組在第八週的情況 (0.50 cm) c. 0.1 mg/l TDZ 的處理組在第十六週的情況 (1.4 cm) d. 1.0 mg/l TDZ 的處理組在第十六週的情況 (1.2 cm). 21.

(29) 第三章癒傷組織誘導、形態發生與植株再生 3.1 前人研究 Karam 等人 (2002) 指出，若沒有 TDZ 或 IAA 的誘導，則 Salvia fruticosa的葉培植體在PGR-free的MS培養基完全不會產生任何癒傷組織，這代表外源性生長調節劑對於細胞分裂與癒傷組織形成有相當大的影響。 Feng 等人 (2004) 以丹參葉柄做培植體誘導癒傷組織，實驗結果顯示最適培養基是含0.5 mg/l 2,4-D + 1.0 mg/l BA的MS培養基，而且癒傷組織在光照下生長速度快於黑暗中。Ke 等人 (2005) 則是使用莖 (stem) 作為培植體，置於含各種不同濃度植物生長調節劑的 MS 培養基誘導癒傷組織，結果發現濃度 5.0 mg/l 2,4-D + 0.2 mg/l NAA + 1.0 mg/l BA的組合可有效快速形成癒傷組織。 Kintzios 等人 (1999) 則是報導了Salvia officinalis 與 S. fruticosa 葉癒傷組織的體胚形成。體胚形成 (somatic embryogenesis) 是指體細胞未經受精作用，直接或間接形態發育為具形態雙極性與發芽能力的擬胚 (Hopkins, 1995; Taiz and Zeiger, 2006)。Kintzios等人 (1999)指出，不管培養基植物生長調節劑成份為何，癒傷組織的誘導皆伴隨著球形胚的形成，但是只有在特定濃度的植物生長調節劑下，原胚與球形胚才會進一步發展成為心形胚與魚雷形胚。S. officinalis的球形胚需要10.5 μM (1.96. 22.

(30) mg/l) NAA + 10.5 μM (2.37 mg/l) BA的培養基、S. fruticosa的球形胚則是需要10.5 μM (1.96 mg/l) NAA + 21.0 μM (4.73 mg/l) BA的培養基才會繼續發展成為成熟體胚。. 3.2 材料與方法 3.2.1 培養基、容器及環境癒傷組織的繼代培養基，植物生長調節劑與原來濃度相同 (1、2、5、 10 mg/l 2,4-D x 0、0.1、0.5、1 mg/l TDZ)。但培養容器由塑膠培養皿 (60 x 15 mm petri dish) 換為 150 x 20 mm 的試管。每個試管裝 10 ml 的培養基。單層鋁箔紙封口。經高溫 (121℃) 高壓 (15 psi) 殺菌 20 分鐘，置成斜面。置於黑暗中培養。. 3.2.2 丹參癒傷組織增殖率從第 2 章實驗結果可以得知，除了控制組長出根、三組TDZ處理長出芽體之外，其他處理皆長出不同程度的癒傷組織。將長出癒傷組織的葉片培植體處理，取下約 2 x 2 x 2 mm3 的癒傷組織，置入含原植物生長調節劑 (見第 2 章 2.4 節) 組成培養基的試管 (150 x 20 mm) 進行繼代培養，每種處理五重複。癒傷組織增殖率之計算以癒傷組織的最終重量除以初始重量，一個月後將癒傷組織取出秤重，計算癒傷組織重量變化。. 23.

(31) 3.2.3 丹參癒傷組織之試管內形態發生將繼代處理的癒傷組織取下約 2 x 2 x 2 mm3 作為培植體，分別置入含 0、0.1、1 mg/l TDZ之培養基的試管 (150 x 20 mm)，置於光照下，每種處理五重複。一個月後觀察其試管內形態發生，並誘導植株再生。. 3.2.4. BA 與 NAA 對丹參癒傷組織形態發生的影響. 為了觀察不同比例植物生長素 (如NAA) 與細胞分裂素 (如BA) 對癒傷組織形態發生的影響，因此將癒傷組織置於含不同濃度BA與NAA培養基，以觀察植物生長素與細胞分裂素比例高低對其形態發生的影響。將 1.0 mg/l 2,4-D + 0.1 mg/l TDZ之品系的癒傷組織作為培植體，取下約 2 x 2 x 2 mm3置入含不同濃度BA (0、0.01、0.1、1、10 mg/l)與NAA (0、0.01、 0.1、1、10 mg/l) 之培養基的試管 (150 x 20 mm)，置於光照下，每種處理五重複。一個月後觀察其試管內形態發生。. 3.2.5 BA 與 IBA 對不定芽發根的影響為了測試從癒傷組織所誘導而來的不定芽之最佳發根培養基，將不定芽置於含不同濃度的 BA 與 IBA 培養基促進發根。以 10.0 mg/l 2,4-D + 1.0 mg/l TDZ 之品系的癒傷組織以 1 mg/l TDZ 所誘導生成的不定芽作為培植. 24.

(32) 體，置於含不同濃度 BA (0、0.05、0.25 mg/l) 與 IBA (0、0.05、0.25 mg/l) 之培養基的試管 (150 x 20 mm)，置於光照下，每種處理五重複。一個半月後觀察其發根情況。. 3.2.6 植株馴化將健康無玻璃質化的芽體移入含全量 MS 培養基添加 30 g/l 蔗糖、1 g/l peptone、0.5 mg/l IBA 及 9 g/l Agar 的蘭花瓶，約兩個月後 (植株約 10 公分高左右) 移出瓶外。移入培植土前，先將植株浸於水中數分鐘。移入培植土後，用塑膠袋或保鮮膜包覆保持濕度。約兩個星期後，可拆開塑膠袋，將植株移往戶外。. 3.2.7 統計分析試驗結果使用鄧肯氏多變域分析 (Duncan’s multiple range test, p < 0.05) 計算顯著差異性。. 3.3 結果 3.2.1 丹參癒傷組織增殖率癒傷組織繼續繼代的結果，有些處理褐化死亡、有些處理增殖出更多癒傷組織 (見圖 3.1)。一個月後，濃度 5 mg/l 2,4-D + 0.1 mg/l TDZ 之. 25.

(33) 處理其癒傷組織增殖率最高，平均達 26.73 倍；濃度 10 mg/l 2,4-D + 0.1 mg/l TDZ 之處理次之 (19.13 倍)，5 mg/l 2,4-D 之處理再次之 (18.70 倍)。 (見表 3.1). 3.2.2 丹參癒傷組織之試管內形態發生癒傷組織之試管內形態發生的結果，在未添加 TDZ 的控制組，在處理約一週後開始發根。第 3 週時計算每一培植體上長度大於 0.5 mm 的根數目，結果顯示：原濃度 5 mg/l 2,4-D + 0.5 mg/l TDZ 之癒傷組織在未添加 TDZ 的控制組中，發根數最多，平均每個培植體生成 24 條根；濃度 10 mg/l 2,4-D + 1.0 mg/l TDZ 之癒傷組織次之 (23.4)，濃度 10 mg/l 2,4-D + 0.5 mg/l TDZ 之癒傷組織再次之 (23.2)。(見表 3.2) 置於含 0.1 mg/l TDZ 的 MS 培養基的各癒傷組織品系，約兩週後其顏色逐漸轉綠，約三週後開始可以觀察到不定根與不定芽的形成。不定根的生成方面，以濃度 2.0 mg/l 2,4-D + 0.1 mg/l TDZ 之品系的癒傷組織發根數最多，平均每個培植體生成 19.8 條根、濃度 5 mg/l 2,4-D 之癒傷組織次之 (15.2) (見表 3.2)。在不定芽的生成方面，則是以濃度 1.0 mg/l 2,4-D + 1.0 mg/l TDZ 之品系的癒傷組織生成不定芽數最多，平均每個培植體生成 5.4 個芽體、濃度 1.0 mg/l 2,4-D + 0.5 mg/l TDZ 之品系的癒傷組織次之 (4.6) (見表 3.3)。. 26.

(34) 在置於 1.0 mg/l TDZ 的 MS 培養基的各癒傷組織品系，約兩週後其顏色逐漸轉綠，三週後可觀察到不定芽從癒傷組織直接器官形成。在發根數方面，以濃度 10.0 mg/l 2,4-D + 1.0 mg/l TDZ 之品系的癒傷組織發根數最多，平均每個培植體生成 3.4 條根 (見表 3.2)。而在不定芽生成方面，則是以濃度 10.0 mg/l 2,4-D + 1.0 mg/l TDZ 之品系的癒傷組織生成不定芽數最多，平均每個培植體生成 28.4 個芽體 (見表 3.3; 圖 3.2 i)。. 3.2.3 BA 與 NAA 對丹參癒傷組織形態發生的影響將癒傷組織置於含不同濃度 BA 與 NAA 培養基，以觀察其形態發生的結果，在 PGR-free 的對照組，約兩週後開始生成不定根，沒有不定芽的形成。發根數最高的處理組是 0.01 mg/l BA+ 10 mg/l NAA 的培養基，平均每個培植體生成 24.8 條根、0.1 mg/l BA+ 10 mg/l NAA 之處理次之 (3.6)。在不定芽的生成方面，10 mg/l BA+ 0.01 mg/l NAA 之處理生成最多不定芽，平均每個培植體生成 5.0 個芽體、10 mg/l BA+ 0.1 mg/l NAA 之處理次之 (2.6) (見表 3.4; 圖 3.3)。. 3.2.4 BA 與 IBA 對不定芽發根的影響將不定芽置於含不同濃度 BA 與 IBA 培養基促進發根的結果顯示，在 PGR-free 的對照組，不定芽沒有生成任何根。將不定芽置於 0.25 mg/l. 27.

(35) BA+ 0.25 mg/l IBA 的培養基，平均發根數最高 (13.0 roots per explants)；然而，不定芽的生成數也最高 (19.6 shoots per explants) (見表 3.5; 圖 3.4)。. 3.4 討論本實驗的癒傷組織誘導皆在黑暗下進行，所得到的癒傷組織多為淡黃色疏鬆狀。Feng 等人 (2004) 提到在光照下以葉作培植體來誘導癒傷組織，以含 0.5 mg/l 2,4-D + 1.0 mg/l BA 的 MS 培養基所得到的癒傷組織呈黃綠色、質地緊密，生長情況最好。1.5 mg/l 以上的 2,4-D 所誘導出來的癒傷組織則呈灰褐色疏鬆狀、且容易褐化死亡。在光照下，NAA 所誘導出來的癒傷組織則呈綠色緊實塊狀、黑暗下所誘導出來的癒傷組織則是淺黃色疏鬆塊狀。未來如果想得到黃綠色緊實的癒傷組織，應考慮置於光照下，並置於特定培養基中。從本實驗的試管內形態發生結果可以得知，在沒有 PGR 的培養基，癒傷組織多形成大量不定根，TDZ 濃度越高、發根數越少。與此相反的是，TDZ 濃度越高，則癒傷組織生成不定芽數越多。癒傷組織在 PGR-free 的培養基可以生成不定根，可能是由於內生性生長調節劑或者是先前從葉培植體誘導癒傷組織時所殘留的植物生長素所致。因此在不同濃度植物生長素與細胞分裂素對癒傷組織影響的實驗中，特別採用低濃度 2,4-D 所誘導的癒傷組織品系進行後續實驗。. 28.

(36) 在 BA 與 NAA 對癒傷組織形態發生的實驗中，高比例的植物生長素 (NAA) 可誘導癒傷組織生成不定根。而高比例的細胞分裂素 (BA) 除了促使癒傷組織生成不定芽以外，還可觀察到許多綠色球狀 embryo-like structures (ELS) 的結構。本實驗成功從癒傷組織誘導出不定芽，然而以 TDZ 所誘導形成的不定芽與正常植株相比大多畸形發育不良，反而不加 TDZ 的對照組癒傷組織可長出少量卻正常的植株。特別是 1.0 mg/l 2,4-D + 1.0 mg/l BA 品系的癒傷組織，在 PGR-free 的培養基長出不定根，雖然僅得到一兩株再生芽，但是所得到的再生芽看起來最健康。癒傷組織所誘導的不定芽之最佳發根培養基與預期不同。原先預期只要將這些不定芽切下置於 PGR-free 或含 0.2 ~ 0.5 mg/l IBA 的培養基一個月後便能自然發根 (Wang and Liu, 1987; Cai et al., 1991; Chen et al., 2007)。然而一個月後，PGR-free 的對照組沒有生成任何根；其它實驗組發根情況也不如預期，且在原先的不定芽上，還生成更多小不定芽。由此可知，從癒傷組織所誘導出來的不定芽與一般正常植株再生芽不同；在 BA 與 IBA 的影響下，這些由 TDZ 所誘導出來的癒傷組織再生芽容易生成更多不定芽。. 29.

(37) 表 3.1 丹參葉培植體癒傷組織的增殖率 Treatments (mg/l) 2,4-D 1.0 1.0 1.0 1.0 2.0 2.0 2.0 2.0 5.0 5.0 5.0 5.0 10.0 10.0 10.0 10.0. Proliferation rate of callus. TDZ 0 0.1 0.5 1.0 0 0.1 0.5 1.0 0 0.1 0.5 1.0 0 0.1 0.5 1.0. Proliferation rate ＝. 10.46 bcd 6.11 cd 4.76 cd 3.14 d 8.31 cd 12.97 bc 10.31 bcd 7.33 cd 18.70 ab 26.73 a 12.28 bcd 4.39 cd 8.57 cd 19.13 ab 10.77 bcd 6.42 cd Final fresh weight － initial fresh weight Initial fresh weight. × 100%. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法 (Duncan’s Multiple Range Test)進行平均值的差異比較 (P﹤0.05)。. 30.

(38) 表 3.2 癒傷組織器官發生之不定根誘導數 Callus lines 2,4-D TDZ 1.0 0 1.0 0.1 1.0 0.5 1.0 1.0 2.0 0 2.0 0.1 2.0 0.5 2.0 1.0 5.0 0 5.0 0.1 5.0 0.5 5.0 1.0 10.0 0 10.0 0.1 10.0 0.5 10.0 1.0. Average number of roots PGR-Free 0.1 mg/l TDZ 1.0 mg/l TDZ 2.2 b 3.2 cd 0 a 7.2 ab 10.2 bcd 1.6 a 4.8 ab 3.6 cd 0.8 a 3.4 b 0.8 d 0.2 a 0.8 b 1.0 d 0 a 6.0 ab 19.8 a 2.8 a 8.2 ab 6.8 bcd 0.6 a 1.2 b 3.8 cd 0.4 a 10.4 ab 15.2 ab 1.6 a 6.2 ab 5.8 bcd 0.4 a 24.0 a 5.2 bcd 1.8 a 10.8 ab 6.8 bcd 1.6 a 15.6 ab 1.0 d 0 a 12.0 ab 13.0 abc 0.8 a 23.2 a 7.2 bcd 0 a 23.4 a 14.4 ab 3.4 a. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法 (Duncan’s Multiple Range Test)進行平均值的差異比較 (P﹤0.05)。. 31.

(39) 表 3.3 癒傷組織器官發生之不定芽誘導數 Callus lines 2,4-D TDZ 1.0 0 1.0 0.1 1.0 0.5 1.0 1.0 2.0 0 2.0 0.1 2.0 0.5 2.0 1.0 5.0 0 5.0 0.1 5.0 0.5 5.0 1.0 10.0 0 10.0 0.1 10.0 0.5 10.0 1.0. PGR-Free 0 b 0.6 b 3.0 a 1.8 ab 0 b 0 b 0 b 0.2 b 0 b 0 b 0.2 b 0.6 b 0 b 0 b 0 b 0 b. Average number of shoots 0.1 mg/l TDZ 1.0 mg/l TDZ 0.6 c 4.4 bc 0.2 c 16.4 abc 4.6 ab 23.0 a 5.4 a 20.4 ab 0 c 14.2 abc 2.0 abc 25.4 a 1.6 abc 18.0 ab 0.8 bc 20.4 ab 3.2 abc 15.4 abc 1.8 abc 23.6 a 2.4 abc 15.2 abc 1.0 bc 25.4 a 0 c 0.8 c 2.6 abc 24.8 a 0.2 c 18.6 ab 0.6 c 28.4 a. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法 (Duncan’s Multiple Range Test)進行平均值的差異比較 (P﹤0.05)。. 32.

(40) 表 3.4 BA 與 NAA 對癒傷組織形態發生的影響 Treatments (mg/l) BA NAA 0 0 0.01 10 0.1 10 1 1 10 0.1 10 0.01. Average number Root 14.8 ab 24.8 a 3.6 b 1.2 b 0.2 b 0 b. Shoot 0 c 0 c 0 c 0 c 2.6 b 5.0 a. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法 (Duncan’s Multiple Range Test)進行平均值的差異比較 (P﹤0.05)。. 33.

(41) 表 3.5 BA 與 IBA 對不定芽發根的影響 Treatments (mg/l) BA 0 0.05 0.05 0.25 0.25. IBA 0 0.05 0.25 0.05 0.25. Average number Root 0 b 0 b 0 b 4.0 ab 13.0 a. Shoot 5.0 c 12.6 ab 8.4 bc 17.2 a 19.6 a. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法 (Duncan’s Multiple Range Test)進行平均值的差異比較 (P﹤0.05)。. 34.

(42) 圖 3.1 丹參葉培植體癒傷組織的增殖率 (bar) a. 5 mg/l 2,4-D + 0.1mg/l TDZ 的處理組在第四週的情況 (0.35 cm) b. 5 mg/l 2,4-D + 1 mg/l TDZ 的處理組在第四週的情況 (0.35 cm). 35.

(43) 圖 3.2 癒傷組織之形態發生 (bar) a,b,c. 癒傷組織品系(1 mg/l 2,4-D + 0.5mg/l TDZ) 分別在 PGR-free、 0.1mg/l TDZ、1 mg/l TDZ 培養基第四週的情況 (0.30 cm) d,e,f. 癒傷組織品系(5 mg/l 2,4-D + 0.5mg/l TDZ) 分別在 PGR-free、 0.1mg/l TDZ、1 mg/l TDZ 培養基第四週的情況 (0.30 cm) g,h,i. 癒傷組織品系(10 mg/l 2,4-D + 1 mg/l TDZ) 分別在 PGR-free、 0.1mg/l TDZ、1 mg/l TDZ 培養基第四週的情況 (0.30 cm). 36.

(44) 圖 3.3 BA 與 NAA 對癒傷組織形態發生的影響 (bar) a,b,c. 癒傷組織分別在對照組、0.01 mg/l BA + 10 mg/l NAA、10 mg/l BA + 0.01 mg/l NAA 的培養基於第三週的情況 (0.30 cm) d,e,f. 癒傷組織分別在對照組、0.01 mg/l BA + 10 mg/l NAA 、10 mg/l BA + 0.01 mg/l NAA 的培養基於第五週的情況 (0.30 cm). 37.

(45) 圖 3.4 BA 與 IBA 對不定芽發根的影響 a,b,c. 不定芽分別在對照組、0.05 mg/l BA + 0.25 mg/l IBA、0.25 mg/l BA + 0.25 mg/l IBA 的培養基於第一週的情況 (0.30 cm) d,e,f. 不定芽分別在對照組、0.05 mg/l BA + 0.25 mg/l IBA、0.25 mg/l BA + 0.25 mg/l IBA 的培養基於第四週的情況 (0.30 cm) g,h,i. 不定芽分別在對照組、0.05 mg/l BA + 0.25 mg/l IBA、0.25 mg/l BA + 0.25 mg/l IBA 的培養基於第八週的情況 (0.30 cm). 38.

(46) 第四章多倍體之誘導 4.1 多倍體之研究進展多倍體 (polyploid) 是指擁有兩套或以上染色體組的個體。多倍體有兩類：一類是同源多倍體 (autopolyploid)，是指擁有多套完全相同染色體組的個體；另一類則是異源多倍體 (allopolyploid)，是由於雜交而擁有兩種或兩種以上不同染色體組的個體 (Grosser and Gmitter, 2011; Pignatta et al., 2010; Yang et al., 2011; Ochatt et al., 2011)。多倍體雖然不具繁殖能力，但許多的多倍體農作物和二倍體比較起來，有植株較壯碩、高產量、抗病性較強等優良的性狀 (Lewis, 1980; Predieri, 2001)。除此之外，許多多倍體農作物具有著較大的葉、莖、根等 (Zhang et al., 2008; Leitch and Leitch, 2008; Dubcovsky and Dvorak, 2007)，對於藥用植物來說，較大的生物量也可能代表著較多的有效成份。因此，發展藥用植物的多倍體有其商業價值。秋水仙鹼 (Colchicine) 是一種從秋水仙 (Colchicum autumnale) 所提煉而來的生物鹼，適當濃度的秋水仙鹼可以用來治療痛風關節炎。1937 年時 Blakeslee and Avery 發現秋水仙鹼可用來誘導曼陀羅 (Datura stramonium) 從二倍體加倍成為四倍體，從此以後秋水仙鹼便被廣泛應用於多種植物多倍體的誘導。秋水仙鹼可以抑制紡錘體的形成、干擾細胞有絲分裂 (Nebel and Ruttle, 1938)，細胞分裂不正常的結果導致染色體的. 39.

(47) 多倍化。 Gao 等人 (1996) 用秋水仙鹼誘導丹參的芽團 (bud clumps) 產生四倍體，結果發現 MS 培養基添加濃度 10 ppm (10 mg/l) 的秋水仙鹼處理 30 日誘導效率最好，得到 12 %的四倍體，且試管苗馴化後其主要成份丹參酮含量大多高於對照組。 Duan 等人 (2006) 則是將南丹參 (Salvia bowleyana) 的葉培植體先置於含 2 mg/l BA + 0.2 mg/l NAA 的 MS 培養基分化一週後，再轉移到含不同濃度秋水仙鹼的培養基處理一或二週，結果發現在濃度 15 mg/l 的秋水仙鹼處理一週其染色體加倍率最高，達 33.33%。丹參 (S. miltiorrhiza) 二倍體有 14 條染色體 (2n = 2x = 14)、四倍體則有 28 染色體 (2n = 4x = 28) (Gao et al., 1996)、南丹參 (S. bowleyana) 二倍體則有 16 條染色體 (2n = 2x = 16)、四倍體則有 32 條染色體 (2n = 4x = 32) (Duan et al., 2006)。Gao 等人(1996) 與Duan 等人(2006)都是用根尖細胞染色觀察染色體數目與氣孔及保衛細胞的大小與密度來判斷倍體數。鑑定多倍體的方法有很多種，包括根尖或花粉母細胞的壓碎染色、花粉粒或氣孔與保衛細胞的大小與密度、以及形態學上的不同等方法來辨認多倍體 (Doležel et al., 2007; Hodgson et al., 2010; Dhooghe et al., 2011)；然而，鑑定多倍體最方便快速的方法還是使用流式細胞儀 (Doležel. 40.

(48) et al., 2007; Ochatt et al., 2011; Lema-Ruminska, 2011)。. 4.2 材料與方法 4.3.1 培養基、容器及環境從第一部份實驗得知以濃度 0.5 mg/l TDZ 能誘導最多芽體，因此接下來將用這個濃度誘導芽體，並添加秋水仙素刺激染色體加倍、形成多倍體。而在前導實驗中，以 5、10、50 及 100 mg/l 的秋水仙鹼均無法誘導葉培植體生出芽體。第二部份的培養基成份為全量 MS 培養基、30 g/l 蔗糖、1 g/l peptone、0.5 mg/l TDZ 及 3 g/l 水晶洋菜，經高溫高壓殺菌 20 分鐘。培養容器為塑膠培養皿 (60 x 15 mm petri dish)。於無菌操作台在每個容器倒入 10 ml 的培養基，用無菌過濾的方法在約 70℃左右的以滅菌培養基添加不同濃度 (0、0.5、1、2、3、4 mg/l) 的秋水仙鹼。以 paraffin 封口。置於黑暗中培養。. 4.3.2 誘導葉培植體發芽與生根以秋水仙鹼處理三週後，將培植體移到不含秋水仙鹼的培養基 (全量 MS 培養基、30 g/l 蔗糖、1 g/l peptone、0.5 mg/l TDZ) 中。再過六週後，將培植體移到含 0.5mg/l BA、0.5mg/l IBA 的全量 MS 培養基。接著. 41.

(49) 再過五週，將原葉培植體移除，移到含 0.5mg/l IBA 的 1/2 MS 培養基促進發根。. 4.3.3 倍體數鑑定 4.3.3.1 流式細胞儀分析首先將待測葉片組織與對照組放入直徑 6 cm 的玻璃盤中，加入 100 μl 抽核液 (Partec CyStain® UV precise P#05-5002)，然後以刀片剁碎，混合均勻後置於冰上。接著加入 400 μl 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) 螢光染劑，以 30 μm 濾網 (Partec CellTric®) 過濾雜質，倒入樣品管進行檢測。使用流式細胞儀 (Partec Ploidy Analyser, PAII) 進行檢測時，每樣品管皆分析 2000 個細胞核左右。以已知 DNA 含量與倍體數的樣品作為對照組，以此推估待側樣品的核 DNA 含量 (徐，2010)。. 4.3.3.2 根尖染色與染色體觀察以解剖刀將植物的新生根尖切下，取前端 1~2 cm，浸於 Carnoy’s 固定液中，常溫下至少固定 3 小時。固定液處理完後，以酒精將醋酸洗淨。將洗淨的根尖置於載玻片上，在解剖顯微鏡下切下根尖最頂部，其餘部份丟棄。加入一滴 Aceto-carmine 染劑，可用酒精燈加熱以加速染色速度，蓋上蓋玻片。將載玻片置於紙巾上，拿紙巾末端反摺蓋住玻片，用大拇. 42.

(50) 指將根尖壓碎，使細胞分散、染色體較容易觀察 (McClintock, 1929)。. 4.3.4 植株馴化將健康無玻璃質化的芽體移入含全量 MS 培養基添加 30 g/l 蔗糖、1 g/l peptone、0.5 mg/l IBA 及 9 g/l Agar 的蘭花瓶，約兩個月後 (植株約 10 公分高左右) 移出瓶外。移入培植土前，先將植株浸於水中數分鐘。移入培植土後，用塑膠袋或保鮮膜包覆保持濕度。約兩個星期後，可拆開塑膠袋，將植株移往戶外。. 4.4 結果 4.4.1 秋水仙素與葉培植體器官發生在以秋水仙鹼 + 0.5 mg/l TDZ 處理三週後，將葉培植體移到不含秋水仙鹼的培養基。秋水仙鹼明顯抑制形態發生，沒有任何芽體形成且葉培植體開始轉黃或褐化。六週後，將培植體移到含 0.5 mg/l BA、0.5 mg/l IBA 的全量 MS 培養基以誘導芽體。處理五週後，計算每片葉培植體的芽體數，其中以原濃度 2 mg/l 秋水仙鹼處理組芽體數最多，平均每片葉培植體有 10.33 個芽體，1 mg/l 秋水仙鹼次佳，平均每片葉培植體有 6.33 個芽體 (見表 4.1; 圖 4.1)。在秋水仙鹼誘導葉培植體形成多倍體的結果方面，由上述芽體繼代. 43.

(51) 所形成的植株中，以 0.5 mg/l、1 mg/l、2 mg/l 秋水仙鹼處理，以流式細胞儀測試倍體數的結果，各成功得到一株四倍體 (見表 4.2; 圖 4.2)。. 4.5 討論以各種濃度的秋水仙鹼 (100 ~ 1000 mg/l) 誘導染色體加倍的方法處理一至五日，對於誘導染色體加倍的效果不好，只能誘導出嵌合體 (Chimera)，無法產生四倍體 (Song et al., 1997; Roy et al., 2001; Thao et al., 2003)。與短期高濃度秋水仙鹼比較，長期秋水仙鹼的處理比較少人嘗試。Chakraborti 等人(1998) 以 1000 mg/l 秋水仙鹼處理桑椹 (Morus alba) 一日與 28 日得到同樣好的效果。然而，De Carvalho 等人 (2005) 以 10、 100 以及 500 mg/l 秋水仙鹼處理胭脂樹 (Bixa orellana) 15 或 30 日，則只有在濃度 10 mg/l 的秋水仙鹼處理 15 日得到僅有一株四倍體。根據 Gao 等人 (1996)的結果，濃度 10 ppm (10 mg/l) 的秋水仙鹼誘導丹參芽團多倍體效率最好。然而本實驗以葉片作培植體測試的結果：以濃度 5、10、50 及 100 mg/l 的秋水仙鹼+ 0.5mg/l TDZ 處理三週均無法誘導葉培植體生成任何芽體，可見在有秋水仙鹼存在的情況下，誘導葉培植體形態形成相當困難。 Nilanthi 等人 (2009) 以秋水仙鹼來誘導紫錐菊 (Echinacea purpurea) 形成多倍體，並測試不同濃度與不同處理時間的秋水仙鹼誘導多倍體的. 44.

(52) 效率。結果顯示，秋水仙鹼濃度越高，芽體發生率也越低；然而處理時間越久，多倍體的誘導比率也越高。誘導紫錐菊 (E. purpurea) 多倍體效率最高的濃度與處理時間是以濃度 120 mg/l的秋水仙鹼處理 28 日，多倍體誘導率可達 23.5%。本實驗以 0.5 mg/l、1 mg/l、2 mg/l秋水仙鹼+ 0.5mg/l TDZ處理葉培植體三週，得到若干芽體。將這些芽體以流式細胞儀檢測多倍體，僅各得到一株四倍體，誘導成功率偏低。Gao 等人 (1996) 是以芽團作培植體、 Duan 等人 (2006) 則是將葉片先誘導出芽體後，再以秋水仙鹼處理，分別以 10 mg/l 秋水仙鹼處理 30 日與 15 mg/l秋水仙鹼處理一週，分別得到 12 % 與 33.33% 的四倍體。由此可知，從葉培植體直接誘導四倍體芽體比從二倍體芽體開始誘導四倍體困難。秋水仙鹼本身便干擾細胞分裂，因此更不容易從葉培植體的形態發生得到芽體。雖然如此，本實驗流式細胞儀檢測的結果並沒有得到混倍數體 (mixploid)，這或許代表從葉培植體誘導多倍體的方法比較容易得到全株四倍體。多倍體誘導效率隨秋水仙鹼的濃度與處理時間的不同而有所差異，秋水仙鹼的濃度越高與處理時間越長，對植物的毒性越強、存活率越低、然而相對的也得到越高比率的多倍體。如何掌握秋水仙鹼的濃度與處理時間是成功誘導多倍體的一項重要課題。. 45.

(53) 表 4.1 秋水仙鹼對誘導丹參葉培植體芽體的影響 Treatments (mg/l) Colchicine TDZ 0 0.5 0.5 0.5 1.0 0.5 2.0 0.5 3.0 0.5 4.0 0.5. Average number of shoots 10.00 a 1.33 a 6.33 a 10.33 a 1.17 a 0.67 a. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法 (Duncan’s Multiple Range Test)進行平均值的差異比較 (P﹤0.05)。. 46.

(54) 表 4.2 秋水仙鹼誘導葉培植體形成多倍體的結果 Treatments (mg/l) Colchicine TDZ 0 0.5 0.5 0.5 1.0 0.5 2.0 0.5 3.0 0.5 4.0 0.5. Number of plants 8 8 27 26 17 14. 47. Diploid (2x) 8 7 26 25 17 14. Tetraploid (4x) 0 1 1 1 0 0.

(55) 圖 4.1 秋水仙鹼誘導丹參葉培植體芽體 (bar) a. 2 mg/l Colchicine 的處理組在第四週的情況 (0.50 cm) b. 2 mg/l Colchicine 的處理組在第八週的情況 (0.50 cm) c. 2 mg/l Colchicine 的處理組在第十三週的情況 (1.2 cm) d. 2 mg/l Colchicine 的處理組在第十七週的情況 (1.4 cm). 48.

(56) 圖 4.2 流式細胞儀直方圖 (Histogram) a. 對照組 (二倍體) 植株 b. 四倍體植株. 49.

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