第三章 實驗材料與方法
第二節 實驗方法
1. 夜交藤 70%乙醇粗抽物及大黃素對孔洞實驗(hole-board test) 誘發焦慮之影響：
分別口服給予大、小鼠一次不同劑量夜交藤乙醇粗抽 物（0.1, 0.5, 1.0 g/kg）及大黃素（1, 10, 15 mg/kg）；60 分鐘 後，將大鼠單獨放置於實驗箱中央，大鼠頭部背朝觀察者，
開始記錄5min 內的下述行為指標，動物兩眼消失在洞中為 一次點頭(a head-dip) ，記錄 5min 的點頭次數及點頭持續 時間，並測其水平走動之活動量的變化。。
本實驗以diazepam（1.0 mg/kg, i.p.）及 buspirone（2.0 mg/kg, i.p.）作為正對照組，於給藥 30 分鐘後進行試驗。每 隻動物測試5 分鐘，並於每隻動物測試完後將地板擦拭乾 淨。實驗進行時間從下午一點至五點。
2. 夜交藤 70%乙醇粗抽物及大黃素對舉臂型十字迷宮誘發焦慮之 影響：
分別口服給予小鼠不同劑量夜交藤乙醇水粗抽物（0.1, 0.5, 1.0 g/kg）及大黃素（1, 10, 15 mg/kg）；60 分鍾後，將小 鼠放入正方形中間，連續測定5 分鐘，以進入開放臂及封閉
臂之次數及滯留開放臂及封閉臂之時間為評估標準，並測其 水平走動之活動量的變化。本實驗以diazepam（1.0 mg/kg, i.p.）及 buspirone（2.0 mg/kg, i.p.）作為正對照組，於給藥 30 分鐘後進行試驗。實驗時間從下午一點至五點。
二、 大黃素抗焦慮作用機轉之探討：
(一) 對小鼠腦內單胺濃度及其代謝物濃度的影響 1.腦組織前處理
口服給予大黃素（10, 15 mg/kg）、buspirone 及對照組給予 vehicle，共 4 組每組 10 隻，60 分鐘後，將小鼠斷頭取腦，分 成紋狀體(striatum)、海馬迴(hippocampus)、皮質(cortex)區域，
均質離心(14000 rpm；30min；4 )℃ ；保存於-80℃的冰箱中，待 需要時解凍離心(10000 rpm ；5min；4 )℃ ，取上清液使用。
2.移動相(mobile phase)配置 分別秤取
HAS(1-庚烷磺酸納,Sodium 1-heptanesutate) 1.75 g Na4EDTA 0.1 g
TEA(三乙胺) 3.5 mL PA (磷酸) 4.0 mL
將上述試藥加水至1,000 mL，以 H3PO4校正至 pH=2.8。以 0.22μm 之 membrane filter 抽氣過濾後，即可上線使用。
3.標準品溶液配置
標準品易變質，秤取配置動作要快；一定要避光儲存，上線使 用前再行配置並小心配置。
分別秤取 NE、DA、5-HT、VMA、HVA 及 5-HIAA 0.02g 於 小燒杯中，加入 50 ml LC 級純水，混合均勻；取前述溶液上 液 2ml，加入 100 ml LC 級純水，及取得標準品溶液。
4. 單胺測定(monoamine level)
以上分離所得鼠腦單胺(NE、DA、5-HT)及其代謝物(VMA、
HVA、5-HIAA)濃度，使用高速液相層析儀(HPLC Waters)測定，
分離管柱（廠牌 MERCK，型號 LICHROCART 125-4mm LICHROSPHER RP-18e），流速為 1.0ml/min，樣品注入量為 10μl。UV Detector 之測定波長使用 280nm。實驗結果以 Waters 2487 紫外光/可見光偵測器記錄。
(二) 併用影響中樞 GABAergic 及 serotonergic system 之藥物大黃素 抗焦慮作用之影響：
大黃素（10 mg/kg）口服給予小鼠 60 分鐘後，再與影響 中樞GABAergic 及 serotonergic system 之藥物分別併用，依前 法（舉臂型十字迷宮實驗），進行實驗。
使用藥物如下：
(1) Diazepam（0.5 mg/kg, i.p.）30 分鐘前給予(109)。
(2) Buspirone（5-HT 1A receptor partial agonist(110)；0.05 mg/kg, i.p.）30 分鐘前給予。
(3) WAY-100635（5-HT1A selective antagonist；0.3 mg/kg, s.c.）30 分鐘前給予(111)。
(4) 8-OH DPAT（5-HT1A selective anonist；0.75 mg/kg, i.p.）30 分
鐘前給予(112)。
(5) P-MPPI（5-HT1A selective antagonist；0.5 mg/kg, i.p.）30 分鐘
前給予(113)。
(6) DOI（5-HT2 selective anonist；1.5 mg/kg, i.p. ）30 分鐘前給
予(114)。
(7) 對照組均給予 vehicle。
三、統計方法
本研究使用SAS for windows 統計軟體，實驗所得之數據先以 One-way ANOVA 分析其變異數，藥物組和對照組顯著性檢驗採用 Tukey test 檢定其間差異之顯著性；凡 p 值小於 0.05 以下時，則認為 有統計意義。
第四章 實 驗 結 果
Table 1. Effects of ethanol extract of Polygoni Multiflori Caulis
(PMCEtOH
)
on the arms entries and the time spent in the closed arms and open arms of the elevated plus-maze test during a 5-min test in mice.PMCEtOH
(g/kg )
Control Diazepam Buspirone
0.1 0.5 1.0
179.7±31.7 219.4±1 211.5±0.5 197.2±30.7 173.4±18.2 133.1±14.6***
開放臂進入
Data represented as Mean±STD (N=10).
***P-Value＜0.001 as compared with the control group.
(二) 大黃素對舉臂型十字迷宮誘發焦慮之影響：
Table 2 結果顯示，口服 10,15 mg/kg 劑量大黃素對小鼠的 舉臂型十字迷宮開放臂進入次數及時間均有增加的作用，封閉 臂進入次數及時間則有減少的作用。
Table 2. Effects of emodin on the arms entries and the time spent in the closed arms and open arms of the elevated plus-maze test during a 5-min test in mice.
Data represented as Mean±STD (N=10).
***P-Value＜0.001 as compared with the control group.
Emodin (g/kg) Control Diazepam Buspirone
1 10 15
186.6±34.1 219.4±1 211.5±0.5 196.8±33.1 168.9±24.2 156.2±14.7***
開放臂進入
二、對孔洞實驗誘發焦慮之影響：
Table 3 結果顯示，口服夜交藤乙醇水粗抽物（0.5,1.0 g/kg）及大 黃素(10,15 mg/kg)劑量下對大鼠的孔洞實驗點頭次數(Head-dip counts) 及點頭持續時間(Head-dip duration) 均有增加的作用，而第一次點頭 (Head-dip latency (s))的時間則有減少的作用。
Table 3. Effects of ethanol extract of Polygoni Multiflori Caulis (PMCEtOH
)
and emodin on the head-dip counts, head-dip duration and head-dip latency in the Hole-board test during a 5-min test in rat.Drug Dose Head-dip
latency (s) Head-dip counts Head-dip duration
Drug Dose Head-dip
latency (s)
Data represented as Mean±STD (N=10).
***P-Value＜0.001 as compared with the
control group.
三、對大、小鼠運動量之影響：
travel distance in mice. Data represented as Mean±STD (N=10).
0
2.大黃素對小鼠自發運動量之影響
由 Fig 2 結果顯示，口服不同劑量大黃素(1，10，15mg/kg) 對小鼠移動距離無明顯變化。
Fig 2. Effect of emodin on the travel distance in mice. Data represented as Mean±STD (N=10).
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000
C 1mg/kg 10 mg/kg 15 mg/kg Emodin
移動距離
( 豪公分
)
(二)、孔洞實驗
Fig 3. Effect of ethanol extract of Polygoni Multiflori Caulis (PMC
EtOH) on the
locomotor activity in rat. Data represented as Mean±STD (N=10).
***P＜0.001 as compared with the control group.
0
2.大黃素對大鼠自發運動量之影響
由Fig 4 結果顯示，口服不同劑量大黃素(10, 15mg/kg)對大 鼠運動量有增加作用。
Fig 4. Effect of emodin on the locomotor activity in rat.
Data represented as Mean±STD (N=10).
***P＜0.001 as compared with the control group.
0 5 10 15 20 25
C
1mg/kg 10mg/kg 15mg/kg Emodin
運動量
( 次數 )
四、與影響中樞GABAergic 及 serotonergic system 之藥物分別併用，
進行舉臂型十字迷宮實驗來探討大黃素抗焦慮作用之機轉：
如Table 4 結果所示，口服大黃素在 15mg/kg 劑量時，顯著減少 小鼠在封閉臂進入次數與滯留時間及增加開放臂進入次數及滯留時 間； diazepam 在 0.5mg/kg 劑量下並不影響小鼠在封閉臂及開放臂 之進入次數與滯留時間，於並用大黃素後亦不影響diazepam 誘發之 封閉臂及開放臂之進入次數與滯留時間。
5-HT1A 之部份致效劑 buspirone 於 0.05mg/kg 劑量下並不影響 小鼠在封閉臂及開放臂之進入次數與滯留時間，但併用大黃素後則可 縮短誘發之封閉臂進入次數與滯留時間、延長誘發之開放臂進入次數 與滯留時間。並且縮短5-HT1A selective antagonist WAY-100635 於 0.3mg/kg 所增加之封閉臂進入次數與滯留時間及延長所減少之開放 臂進入次數與滯留時間。
5-HT1A selective antagonist P-MPPI 於 0.5mg/kg 劑量下並不影響 小鼠在封閉臂及開放臂之進入次數與滯留時間，但並用大黃素後則可 縮短誘發之封閉臂進入次數與滯留時間及延長誘發之開放臂進入次 數與滯留時間、並且縮短5-HT1A selective antagonist 8-OH DPAT 於 0.75mg/kg 所增加之封閉臂進入次數與滯留時間及延長所減少之開放 臂進入次數與滯留時間。
5-HT2 拮抗劑 ritanserin 於 0.01mg/kg 劑量下並不影響小鼠在封 閉臂及開放臂之進入次數與滯留時間，但併用大黃素後則可縮短誘發 之封閉臂進入次數與滯留時間及延長誘發之開放臂進入次數與滯留 時間。而5-HT2A 致效劑DOI 於 1.5mg/kg 劑量下，可增加小鼠在封閉 臂之進入次數與滯留時間並減少小鼠在開放臂進入次數與滯留時 間，但併用大黃素後則可縮短所增加之封閉臂進入次數與滯留時間及 延長所減少之開放臂進入次數與滯留時間。
Table 4. Effect of emodin(EMO) on DIZ-, BUS-, WAY-100635-, 8-OHDPAT-, P-MPPI-, DOI-, RIT-induced time spent ,arm entries in the plus-maze during a 5-min test.
Closed arms Open arms
Arm entries Time spent(sec) Arm entries Time spent(sec)
Control 30.2±0.2 226.2±0.5 3.1±0.2 3.9±0.1
EMO 15mg/kg 17.5±0.2 198.4±0.4 14.0±0.1 20.0±0.2 DIZ 23.4±0.6 219.4±1.0 5.0±0.5 3.7±0.7 DIZ+EMO 23.6±0.5 230.9±1.1 16.0±0.7
***16.5±0.5
***BUS 20.3±1.1 211.5±0.5 4.7±0.4 3.5±0.5 with the DIZ-, BUS-, WAY-100635, 8-OHDPAT-,P-MPPI-,DOI-,RIT- group
respectively.
五、對小鼠腦內單胺濃度及其代謝物濃度的影響
(一) 大黃素對小鼠腦內紋狀體單胺及其代謝物濃度之影響︰
由Table.5.結果顯示，口服大黃素(10 與 15 mg/kg)對小鼠紋 狀體中NE、DA、5-HT 的濃度有減少之作用，對 VMA、HVA 及5-HIAA 的濃度有增加之作用。
Table. 5. The effect of emodin on the concertration of monoamines and their metabolites in the striatum of mice.
Group 紋狀體 (ng/g tissue)
NE DA 5-HT VMA HVA 5-HIAA
Control 113.50±1.80 8280.25±326.35 685.71±9.03 24.43±2.18 812.42±29.66 189.56±8.26 Buspirone 41.75±2.40*** 3357.36±59.45*** 221.69±4.75*** 81.61±2.02*** 1951.87±13.59*** 621.92±6.79***
Emodin 10mg
102.33±6.32 3631.36±61.02*** 467.45±9.61*** 73.6±5.19*** 2029.63±24.28*** 566.41±4.63***
Emodin 15mg
39.87±2.04*** 3301.24±59.02*** 211.21±4.94*** 79.22±2.73*** 2116.37±14.18*** 611.29±7.86***
Data represented as Mean±STD (N=10).
***P＜0.001 as compared with the control
group.
(二) 大黃素對小鼠腦內海馬迴單胺及其代謝物濃度之影響︰
由Table.6.結果顯示，口服大黃素(10 與 15 mg/kg)對小鼠海 馬回中NE、DA、5-HT 的濃度有減少之作用，對 VMA、HVA 及5-HIAA 的濃度有增加之作用。
Table.6. The effect of emodin on the concertration of monoamines and their metabolites in the hippocampus of mice.
海馬迴 (ng/g tissue) Group
NE DA 5-HT VMA HVA 5-HIAA
Control 284.48±5.71 18.79±1.81 566.83±11.62 53.01±3.23 13.92±2.01 187.09±4.99 Buspirone 109.91±5.57*** 6.56±0.75*** 170.85±8.71*** 171.39±7.59*** 33.43±2.64*** 611.10±5.32***
Emodin 10mg
254.47±4.76 7.94±1.21*** 398.23±7.23*** 159.45±4.88*** 34.25±2.13*** 560.22±7.85***
Emodin 15mg
99.65±4.52*** 7.56±1.17*** 182.35±7.28*** 166.57±8.11*** 36.78±2.41*** 595.82±6.02***
Data represented as Mean±STD (N=10).
***P＜0.001 as compared with the control
group.
(三) 大黃素對小鼠腦內皮質單胺及其代謝物濃度之影響︰
由Table.7.結果顯示，口服大黃素(10 與 15 mg/kg)小鼠皮質 中NE、DA、5-HT 的濃度有減少之作用，對 VMA、HVA 及 5-HIAA 的濃度有增加之作用。
Table.7. The effect of emodin on the concertratoin of monoamines of and their metabolites in the cortex of mice.
皮質 (ng/g tissue) Group
NE DA 5-HT VMA HVA 5-HIAA
Control 303.89±8.47 16.02±1.60 458.95±6.04 66.59±2.98 24.09±0.88 100.32±6.39
Buspirone 114.34±8.27*** 6.27±2.09*** 138.49±3.01*** 215.21±9.97*** 64.97±3.18*** 323.55±11.05***
Emodin 10mg
276.35±5.04 6.76±1.29*** 321.06±3.84*** 202.38±4.03*** 60.98±4.23*** 287.88±9.43***
Emodin 15mg
106.75±9.11** 6.35±1.31*** 146.60±4.07*** 210.36±7.29*** 64.11±3.96*** 312.22±8.22***
Data represented as Mean±STD (N=10).
***P＜0.001 as compared with the control
group.
第五章 討 論
本實驗以舉臂型十字迷宮及孔洞實驗誘發動物的焦慮模式，來探 討夜交藤及其主要成分大黃素的抗焦慮作用，並以常用的抗焦慮藥物 diazepam 及 buspirone 為正對照組，藉以評估其抗焦慮作用之療效。
孔洞實驗誘發大鼠焦慮模式為1962 年 Boissier 和 Simon 首次建 立，其後被廣泛用於藥效研究﹙115﹚。其實驗原理是利用新奇(curiosity) 和恐懼(fear)兩個因素來控制動物在新環境下的行為，用逃避(escapes) 來反應這兩個因素的作用結果而動物的反覆點頭(head-dipping)反映 出其新奇感和對逃避的渴望。
實驗裝置大鼠和小鼠是有所區別。故可利用這些行為的變化程度 作為致焦慮或抗焦慮藥物之評估指標。(116)許多研究報告指出抗焦慮 藥物benzodiazepine 類藥物(如：chlordiazepoxide 及 diazepam)及 buspirone(117)等，在此誘發大鼠焦慮的研究模式中，均可延長大鼠點 頭次數及點頭持續時間，而縮短在第一次點頭時間；此現象與本研究 的正對照組DIZ 及 BUS 實驗結果相同。而口服給予夜交藤 70%乙醇 粗抽物及大黃素於15mg/kg 劑量下點頭次數(Head-dip counts)及點頭 持續時間(Head-dip duration) 均有增加的作用，而第一次點頭的時間 則有減少的作用；可推知夜交藤70%乙醇粗抽物和大黃素對孔洞實驗 誘發大鼠焦慮之實驗模式確具有抗焦慮之作用。
舉臂型十字迷宮此實驗是由Montgomery（1955）的研究發展而 來的，1984 年 Handley 和 Mithani 用來研究個種 α 腎上腺素受體致效 劑及拮抗劑的不同作用，Pellow 通過大量實驗研究，發展成有效評價 大鼠焦慮狀態的動物模型，1987 年經 Lister 進步改進裝置，用於評價 小鼠焦慮也獲得成功。本實驗原理是利用動物對新環境的探究特性和 對高敞開臂的恐慌形成動物的矛盾衝突狀態，而誘發焦慮的產生，本 模式對小鼠及大鼠均有作用，其中常以老鼠在開放臂及封閉臂的進入 次數及滯留時間，當作評估焦慮作業的指標。
國內外研究報告証實diazepam 及 buspirone(118 )可明顯增加小鼠 進入開放臂次數及延長滯留時間；此結果與本實驗的正對照組
diazepam 及 buspirone 的實驗結果一致。而分別口服給予小鼠夜交藤 70%乙醇粗抽物(1g/kg)、大黃素(15mg/kg)，實驗結果顯示均可明顯增 加小鼠之開放臂的進入次數及滯留時間；及減少小鼠之封閉臂的進入 次數及滯留時間；顯示夜交藤70%乙醇粗抽物及大黃素對於舉臂型十 字迷宮誘發小鼠之焦慮模式亦具有抗焦慮作用。
另外，因孔洞實驗及舉臂型十字迷宮誘發老鼠焦慮模式均牽涉所 評估藥物的鎮靜作用之有無，為釐清此作用是否對夜交藤 70%乙醇粗 抽物和大黃素之抗焦慮作用實驗結果有所影響，因此本研究利用動物 的自發運動量測量鎮靜作用模式，進一步探討夜交藤70%乙醇粗抽物