大腸桿菌生長條件與培養方法

菌株之第一代培養皆以LB 為培養液，挑單一菌落於培養液，在 37 ℃ 恆溫震盪箱，以震盪速率200 rpm 培養 12∼16 小時。利用四區劃法將菌 株畫於含1.5%洋菜膠的平板培養基上 (LB plate) (不同菌株可依其所需培 養在含不同抗生素的平板培養基上)，在 37 ℃恆溫箱培養。同時本實驗所 使用的菌株多為lacZ fusion，所以平板培養基需含有 X-gal，而 X-gal 需避 光以避免其分解。因lacZ 之關係，所生成的菌落應為藍色。待菌落生成後 將其置於4 ℃保存。4 ℃下平板培養基上之菌株大概可保存一個月，因此 每個月均需重覆以上繼代培養之工作，保持菌株新鮮度以防止其失去活 性。另外，將菌株做長期保存的方法為在37 ℃培養菌液至平穩期後，取菌 液加15% Glycerol (已滅菌)，再分裝至菌種保存管中後編號，存放於-80 ℃

冰櫃。

2. 批次培養 (batch culture)

為使菌體適應生長環境，所以需先作二次繼代培養，然後再於第三代 時培養在所需條件。

第一代培養：挑取單一菌落接種至5 ml 的 LB 培養液 (依其需要可在 培養液中加入所需的抗生素)，培養 6~8 小時使菌體活化。

第二代培養：取適量菌液接種到有氧及厭氧的基礎培養液，並以終濃 度40 mM 葡萄糖作為碳源，於 37 ℃隔夜培養，此培養目的在使細菌適應 新的生長環境。

第三代培養：取適量菌液至有氧及厭氧，並以40 mM 葡萄糖為碳源的 基礎培養液中進行培養。所加入的菌量多寡完全視菌液的濃度而定，唯加 入之菌量在OD600上升範圍控制於0.02~0.025 之間，並於 37 ℃ 200 rpm 培 養 。 在 有 氧 環 境 下 ，5 ml 培 養 液 之 透 氣 塑 膠 蓋 的 玻 璃 管 中 培 養 至 mid-exponential phase 大約是 OD600吸光值為0.40~0.45 時收取；而厭氧環 境之培養則是用10 ml 的培養液，以鋁蓋封口之玻璃管，菌液利用針筒注 入，並注意避免打入空氣，培養至 OD600在 0.20∼0.25 之間收菌。收菌後 罝於冰上 20 分鐘後以 6000 rpm，離心 10 分鐘並除去上清液，離心下來 的菌體以PM2 buffer 懸浮，準備作 β-galactosidase 活性測定之分析，或置 於- 80 ℃酒精冰桶 10 秒鐘，之後進行總 RNA 萃取。

以下除最後一次繼代培養時依其所需加入不同碳源或不同培養環境 外，其餘培養及收菌條件皆相同。

3. 飢餓處理 (starvation)

將菌體培養在 LB 培養液中，當其生長達對數生長期前期，以 6000 rpm，離心 10 分鐘，倒去上清液，利用不含 casamino acid 之基礎培養液清 洗菌體後再以6000 rpm，10 分鐘離心，倒去上清液之後加入不含 casamino acid 之基礎培養液繼續培養 30 分鐘。

4. 連續式培養 (continuous culture)

本實驗用化學恆定連續式培養 (chemostat continuous culture) 控制細 胞 的 生 長 速 率 。 在 連 續 式 培 養 過 程 中 細 胞 生 長 速 率 可 用 比 生 長 速 率 (specific growth rate, µ) 表示。細胞數目增倍所需的時間為 Td (doubling time) 與比生長速率 (µ) 的關係為 Td = ln 2/µ。在連續式培養中當進料的 液體為無菌之培養液且醱酵槽內細胞生長已達穩定狀態 (steady state) 時，µ 可用稀釋度 (D) 來表示，即 µ = D，

其中D = F/V

F：培養液之流動速率 (medium flow rate) V：培養液在醱酵槽內體積 (working volume)

而稀釋率由可調式幫浦決定，因此可控制細菌的比生長速率 (詳見 2.2)。

(1) 培養基的製備

化學恆定連續式培養使用之培養基與批式培養的基本培養基成分相 同，唯碳源的添加為2.25 mM/L，在此以 carbon limitation 來限制菌體生長。

由於連續式培養須消耗大量培養液，所以以20 L 的儲水桶 (Nalgene cat No.

2250-0050) 為單位，每桶裝 17 L 的 minimal medium，配製數桶後於高溫 高壓下滅菌100 分鐘，於滅菌後待培養液溫度下降到室溫時再添加碳源。

(2) 連續式培養系統之裝置

連續式培養系統主要可分為四個部分：槽體、流速測定管、培養液供 應桶、廢液收集桶。

a. 槽體之組裝：

槽體為連續式醱酵之主體。將槽身洗淨後加入1 L 的去離子水，把上蓋 裝配鎖緊，將冷凝管出口及進氣口接上0.22 µm 濾菌膜，各出口及接頭均 用鐵夾封閉並在管口處包上錫箔紙。以打氣幫浦測試槽體是否有漏氣情 況，直到調整到完全封閉後才可加以滅菌。滅菌時須打開冷凝管出口以防 止滅菌時壓力的變化。

b. 流速測定管：

將滴定管頂部以棉花塞住，包上錫箔紙。滴定管之下方接上三插管，再 接上矽膠管而分成兩個接頭，其中一個與槽體相接，另一個則與進料管相 接，並在管口處包上錫箔紙，二接頭均用鐵夾封閉。

c. 培養液供應桶：

內裝有17 L 的培養液，桶上的蓋子有兩個接頭，一個是負責進料的接 頭，另一個接頭則與過濾器相接，目的在平衡桶子內外的壓力並過濾空氣，

所有出口及接頭均用鐵夾封閉並在管口處包上錫箔紙，以防止滅菌後的污 染。

d. 廢液收集桶：

以20 L 的空桶收集廢液用。桶上的蓋子也有兩個接頭，一個與醱酵槽 出料管相接以收集廢液，另一個接頭與裝有棉花之注射筒的筒身相接，目 的也是在平衡桶子內外的壓力並過濾空氣，出口及接頭均用鐵夾封閉並在 管口處包上錫箔紙，以防止滅菌後的污染。

槽體、流速測定管、廢液收集桶三者可同時置於 121 ℃，1 大氣壓下滅 菌50 分鐘或各別滅菌，而培養液供應桶則需 121 ℃，1 大氣壓下滅菌 100 分鐘。滅菌後便可以將此四部分所有接頭相連接，所有操作過程皆需快速 完成並過火滅菌以避免污染。

(3) 接菌前的準備及接菌

由於安裝於蠕動幫浦之矽膠管長度可能會有些許的不同，所以每次接 菌前須先利用流速測定管測定本次蠕動幫浦的流速，以作為往後調控培養 液之流動速率的依據。且在接菌之前需先啟動連續式培養系統，將槽體內 的一次水置換成培養液，本實驗的通氣量是利用氣體流量計來控制，而氣 體流量計在使用之前需用排水集氣法校正。另外欲進行連續式培養的菌株 需先培養在5 ml 的 LB 培養液，於 37 ℃恆溫振盪培養至對數期後以作為 接菌用。接菌時利用10 ml 注射針筒在無菌操作台取出活化之菌液並注入 醱酵槽內，接菌完成後，先以批式培養使菌體生長達對數期後，再調整蠕 動幫浦的流速以控制生長速率進行連續式培養。

(4) 連續式培養的生長條件

本實驗是利用BIOFLO III (NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC CO.) 醱 酵槽控制器進行生長條件的控制。實驗用槽體體積為1.5 L，培養液在醱酵 槽內體積 (working volume) 為 1 L，培養溫度為 37 ℃，攪拌速率為 500 rpm，通氣量控制在 2 L/min。調整蠕動幫浦控制培養液之流動速率以進行 不同生速率之連續式培養。每次變換培養液流動速率時，至少須相隔6 個 反應槽的滯留時間 (reactor residence time, τ)，以確定菌體的生長到達新的 穩定期 (steady state)，當菌體生長達穩定狀態後才可以收集樣本。