過去研究發現，當大腸桿菌於豐富培養液在diauxic lag 生長時（反映 出菌體耗盡一種未確認的培養液組成，而轉移到一個新的代謝途徑的情 形），會出現rne mRNA 表現量下降、RNase E 蛋白減少以及其作用於受質 之能力下降的情形 (Barlow et al., 1998)，而這與本實驗中發現當大腸桿菌 在飢餓環境下，其rne 表現量會顯著下降的結果相符(圖十二)，因為當菌體 耗盡某種培養液組成的情形，類似於短暫的飢餓環境。在必須養分缺乏的 飢餓環境時，菌體必須具有立即調整蛋白質生合成的能力 (Barlow et al., 1998)。推測在養分缺乏的壓力之下，菌體為了維持生存所需蛋白質，必須 降低RNase E 的表現，使轉譯所需的 mRNA 穩定。而先前也已經觀察到於 養分缺乏的壓力下，大量mRNA 的降解都會出現減緩的現象 (Georgellis et al., 1993)。而於飢餓環境下大量 mRNA 降解減緩的情形則可被降低的轉錄 速率所抵銷 (Georgellis et al., 1993)，因此 rne mRNA 減少的原因可能是於 飢餓環境下菌體的轉錄速率減緩所導致。
生長環境惡劣時，大腸桿菌生長速率會減慢且菌體內 RNA、核糖體、
蛋白質等巨分子量降低，以避免產生浪費，此種迫切反應是由菌體內
(p)ppGpp 含量所調控 (Gallant, 1979)。一般環境下細菌體內(p)ppGpp 量非 常低，若細胞內缺乏胺基酸時，RelA 會將 ATP 上 β 及 γ 上的 phosphates 移轉至GTP 上，形成 pppGpp 或 ppGpp (Gallant, 1979)；而細胞內碳源及 能量缺乏時，則由SpoT 製造 (p)ppGpp。當細菌產生迫切反應時，菌體內 (p)ppGpp 的濃度上升，其會抑制 rRNA 合成、降低轉錄頻率、減少核糖體 合成並影響轉譯速率 (Pao and Dyess, 1981)。由本實驗結果發現，正常培 養下relA 突變株、spoT 突變株及雙突變株，rne 表現量與野生株比較，並 沒有改變 (圖十三 (A)，圖十四、 (A))。在進行饑餓反應後，relA 突變株 之 rne 表現量與野生株相比差距不大，而 spoT 突變株及雙突變株的 rne 表現量與野生株相較則會出現回復情形。顯現出於飢餓環境下rne 之表現 確實受到 (p)ppGpp 之調控，且由 spoT 調控較顯著（圖十三 (B)，圖十四、
(B)），即rne 對碳源與能量缺乏時較敏感，但詳細的機制仍需進一步研究。
綜合上述研究結果可知，rne 的基因表現確實會受到環境因子調控，
在其轉錄以及後轉錄的層次。且RNase E 的酵素活性也會因環境因子改變 而改變，進行自我調控。
陸、論文圖表
表一、本實驗所使用菌株
菌株名稱 來源 基因型或表現型 MC4100 F- araD139 ∆(argF-lac)U169 rpsL150 relAl
flb-5301 deoC1 ptsF25 rbsR HHS2 MC4100 rne-lacZ
HHS5 HHS2 ∆cya Kanr HHS9 HHS2 ∆crp Tetr HHS10 HHS2 ∆himA Tetr K12
K12ΔrelA K12 ΔrelA Kanr K12ΔspoT K12 ΔspoT Cmr
K12ΔrelA spoT K12 ΔrelA spoT Kanr Cmr
表二、碳源對RNase E 受質 rpsO mRNA 半衰期之影響
碳源（40mM） rpsO mRNA 半衰期 （分鐘）
葡萄糖 2.3
醋酸 1.8
※將菌體分別培養於含 40mM 葡萄糖或醋酸的基礎培養液中進行批次培 養，當菌體生長達對數生長期前期，加入 rifampicin 後，於不同時間點抽 取其總RNA，之後以 rpsO 探針，進行北方墨點分析再利用程式將底片的 訊號進行定量分析偵測每一個雜交訊號的強度，並將所測得的數值與不同 的採樣時間點做一關係圖，利用線性回歸分析在不同時間點所得的雜交訊 號強度，計算出 mRNA 的半衰期。
表三、氧氣與生長速率對RNase E 受質 rpsO mRNA 半衰期之影響
rpsO mRNA 半衰期 （分鐘）
生長速率 µ (h-1) ＋O2 －O2
0.24 2.3 1.2
1.20 3.7 1.8
※以含 2.25mM 葡萄糖的基礎培養液分別於有氧及無氧下進行連續式培 養，當菌體生長速率 µ 達 0.24 h-1與1.20 h-1時取出菌液，加入rifampicin 後，於不同時間點抽取其總 RNA，之後以 rpsO 探針，進行北方墨點分析 再利用程式將底片的訊號進行定量分析偵測每一個雜交訊號的強度，並將 所測得的數值與不同的採樣時間點做一關係圖，利用線性回歸分析在不同 時間點所得的雜交訊號強度，計算出 mRNA 的半衰期。
圖一、細菌生長與rne-lacZ 表現
●生長曲線；▲ β - galactosidase activity。將 rne-lacZ 菌株培養於 40mM 葡 萄糖的基礎培養基，於不同時間點將菌液取出利用 OD600測其混濁度繪製 成生長曲線與測不同時間點其rne-lacZ 的 β - galactosidase 活性。
β-galactosidase activity (Miller unit)
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
0 50 100 150 200 250 300 350
0.01 0.1 1 10
log OD600
Time (min)
(A)
(B)
圖二、 葡萄糖與醋酸為碳源時 rne 基因之表現量
(A) 北方墨點分析及總 RNA 定量分析之電泳圖 (B) 程式定量分析基因相 對表現量。將菌體分別培養於含40mM 葡萄糖或醋酸的基礎培養液中，進 行批次培養。當菌體生長達對數生長期前期，抽取其總RNA，電泳圖為 RNA 定量之 internal control。以 rne 探針進行北方墨點分析，結果以壓片 訊號強弱來判讀，再利用程式將訊號進行定量分析與相對表現量計算。
Glucose Acetate
Glucose Acetate 23S rRNA
16S rRNA
0 20 40 60 80 100 120
Relative mRNA level (％)
rne
(A)
(B)
圖三、 不同碳源下 rne 基因之穩定度
(A) 40mM 葡萄糖 (B) 40mM 醋酸。將菌體分別培養於含 40mM 葡萄糖或 醋酸的基礎培養液中進行批次培養，當菌體生長達對數生長期前期，加入 rifampicin 後，於不同時間點抽取其總 RNA 進行電泳，電泳圖為 RNA 定 量之internal control，之後以 rne 探針進行壓片與北方墨點分析。
0 1 3 5 7 9 12 15 min
0 1 3 5 7 9 12 15 min 23S rRNA
16S rRNA
23S rRNA 16S rRNA
rne
rne
(A)
(B)
圖四、不同碳源下RNase E 對 rpsO mRNA 之活性測試。
(A) 40mM 葡萄糖下，rpsO mRNA 之穩定性 (B) 40mM 醋酸下，rpsO mRNA 之穩定性。將菌體分別培養於含40mM 葡萄糖或醋酸的基礎培養液中進行 批次培養，當菌體生長達對數生長期前期，加入rifampicin 後，於不同時 間點抽取其總RNA 進行電泳，電泳圖為 RNA 定量之 internal control，之 後以rpsO 探針進行壓片與北方墨點分析。
0 1 3 6 10 15 20 25 min
0 1 3 5 7 9 12 15 min 23S rRNA
16S rRNA
23S rRNA 16S rRNA
rpsO
rpsO
圖五、有氧環境下葡萄糖對大腸桿菌rne-lacZ表現之影響
□ LB；■ LB+40mM 葡萄糖。將具有rne-lacZ的野生株與突變株分別培養 於LB或含40mM葡萄糖的LB培養液中，進行批次培養，當菌體生長達對數 生長期前期測其 rne-lacZ 的β - galactosidase 活性。
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500
β-galactosidase activity ( Miller unit)
Wild Type ∆cya ∆crp
圖六、無氧環境下葡萄糖對大腸桿菌rne-lacZ 表現之影響
□ LB；■ LB+40mM 葡萄糖。將具有rne-lacZ的野生株與突變株分別培養 於LB厭氧管或含40mM葡萄糖的LB培厭氧管中，進行批次培養，當菌體生 長達對數生長期前期測其 rne-lacZ 的β - galactosidase 活性。
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
β-galactosidase activity ( Miller unit)
Wild Type ∆cya ∆crp
(A)
Relative mRNA level (％)
＋O2 －O2 rne
(A)
Relative mRNA level (％)
－O2 ＋O2
rne
(A)
(B)
圖九、有氧時生長速率對RNase E 之活性測試
(A) 生長速率 µ 為 0.24 h-1時，rpsO mRNA 之穩定性及總 RNA 電泳圖 (B) 生長速率µ 為 1.20 h-1時，rpsO mRNA 之穩定性及總 RNA 電泳圖。以含 2.25mM 葡萄糖的基礎培養液分別於有氧下進行連續式培養，當菌體生長 速率µ 達 0.24 h-1與1.20 h-1時取出菌液，加入rifampicin 後，於不同時間 點抽取其總RNA 進行電泳，電泳圖為 RNA 定量之 internal control，之後 以rpsO 探針進行壓片與北方墨點分析。
0 1 3 5 7 9 12 15 min
0 1 3 5 7 9 12 15 min
23S rRNA 16S rRNA 23S rRNA 16S rRNA rpsO
rpsO
(A)
(B)
圖十、 無氧時生長速率對 RNase E 之活性測試
(A) 生長速率 µ 為 0.24 h-1時，rpsO mRNA 之穩定性及總 RNA 電泳圖 (B) 生長速率µ 為 1.20 h-1時，rpsO mRNA 之穩定性及總 RNA 電泳圖。以含 2.25mM 葡萄糖的基礎培養液分別於無氧下進行連續式培養，當菌體生長 速率µ 達 0.24 h-1與1.20 h-1時取出菌液，加入rifampicin 後，於不同時間 點抽取其總RNA 進行電泳，電泳圖為 RNA 定量之 internal control，之後 以rpsO 探針進行壓片與北方墨點分析。
0 1 3 5 7 9 12 15 min
0 1 3 5 7 9 12 15 min
23S rRNA 16S rRNA 23S rRNA 16S rRNA rpsO
rpsO
(A) RNA 定量之 internal control。以 rne 探針進行北方墨點分析，結果以壓片 訊號強弱來判讀，再利用程式將訊號進行定量分析與相對表現量計算。
Relative mRNA level (％)
rne
(A) 後抽取其總RNA，電泳圖 RNA 定量之為 internal control。以 rne 探針進行 北方墨點分析，結果以壓片訊號強弱來判讀，再利用程式將訊號進行定量 分析與相對表現量計算。
Normal
growth Starvation
23S rRNA
Relative mRNA level (％)
Normal
growth Starvation rne
(A)
(B)
圖十三、 野生株與 (p)ppGpp 基因突變株對 rne 基因表現之影響 (A) 正常培養 (B) 饑餓培養。將 E. coli K12 及 (p)ppGpp 相關基因突變株 培養於LB 培養液進行批次培養，當菌體生長達對數生長期前期，分別至 換新的LB 培養液或不含 casamino acid 之基礎培養液進行飢餓培養 30 分 鐘，之後抽取其總RNA，電泳圖為 RNA 定量之 internal control。以 rne 探 針進行北方墨點分析，結果以壓片訊號強弱來判讀。
23S rRNA 16S rRNA 23S rRNA 16S rRNA
Wild
Type ∆relA ∆spoT ∆relA
∆spoT
Wild
Type ∆relA ∆spoT ∆relA
∆spoT rne
rne
(A)
Relative mRNA level (％)
0
Relative mRNA level (％)
∆spoT
∆relA ∆relA
∆spoT Wild
Type
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