中文摘要
mRNA 降解對於原核生物而言，是調節基因表現的重要機制。在大腸 桿菌中，RNase E 對 mRNA 的降解以及 rRNA 熟成扮演了關鍵性的角 色。RNase E 為細胞生長時必須的蛋白質，當其無活性時會造成大量 mRNA 半衰期延長與阻礙部分 mRNA 之降解，因此大腸桿菌利用回饋作用嚴格控 制 RNase E 的生合成。此機制藉由 RNase E 作用於自身 mRNA 的 5’-untranslated region (UTR) 361個核苷酸來進行。
過去文獻指出，大腸桿菌 RNase E 的濃度及活性會隨生長環境不同而 進行調整，為了得知環境因子如何在轉錄層面調控 rne 基因表現，我們利 用插在染色體上的 rne-lacZ 活性以及北方墨點法來進行分析。至於RNase E 的活性，則是藉由其受質 rpsO mRNA 的半衰期來測試。結果發現，rne mRNA 的表現量與 RNase E 的酵素活性，的確會受到不同碳源、生長速率 與氧氣所影響。此外，亦發現 rne 基因表現受控於葡萄糖效應，當 LB 培 養液外加 40mM 葡萄糖時， rne-lacZ 表現會下降。結果發現飢餓環境下， rne 基因表現降低會受 (p)ppGpp 調控。當大腸桿菌生長於有氧及無氧的環 境下，轉錄因子 Integration host factor (IHF) 亦會對 rne 基因進行不同的調 控方式。
Abstract
mRNA degradation is an important mechanism of regulation gene expression in prokaryotes. In Escherichia coli, RNase E plays as a key role for mRNA degradation and rRNA maturation. This endonuclease is essential for cell growth. The inactivation of RNase E has been shown to prolong the lifetime of bulk mRNA and to impede the processing and decay of a variety of individual transcripts. E. coli cells tightly control RNase E synthesis through a feedback mechanism, which is mediated in cis by the 361-nucleotide rne mRNA 5’-untranslated region (UTR).
Earlier reports have indicated that the intracellular RNase E concentration and its activity may change in response to modification of environmental conditions. To examine how the environmental factors regulated rne expression at transcription level, rne-lacZ operon fusions and Northern blotting were analyzed. In addation, rpsO mRNA, which is one of RNase E substrates was used to test RNase E activity. The results showed that the mount of rne mRNA and the activity of RNase E indeed changed in different carbon sources, growth rate and oxygen. Besides, rne expression was glucose repressed. After starvation, the expression of rne gene decressed because of (p)ppGpp effect. Finally, this study showed that integration host factor (IHF) regulated rne gene under aerobic and anaerobic growth conditions by different ways.
誌謝
感謝指導教授曾慶平老師於生活與實驗上的指導，支持與鼓勵，也謝 謝林志生老師和黃效民博士在論文上的細心指教以及在口試的時候給予許 多寶貴的意見，在此致上最誠摯的感謝。 過去的兩年來家中正好遭逢許多事情，也是我心情最低落的時後，感 謝好友們的支持。我要特別感謝我剛進實驗室時就在的老人們！愛製造魔 音的校賢學長與超老實的宗益學長在生活上與實驗上的各種幫助及任我們 使喚；可愛的慧珊在我無聊心煩時陪我聊八卦，還當了我近一年的司機； 八卦來源鐘達學長、美麗的傅老師與喜歡史奴比的育甄學姊對我各種幫 忙；電腦之神鈞毅對電腦白痴的我耐心教學；蟲在我們剛進實驗室時帶我 們做實驗；還有國領學長幫我一張張改口試投影片，該減肥的煜沛學長幫 我 “隨機”挑論文錯誤。 再來謝謝我可愛的同學們，與我出雙入對的好室友婉君、老鄰居靜 雪、活潑的惠文、常常陪我逛街的郁婷、酷妹巧璇、人好好的岳賢以及我 的“老老”同學愛雁 ( 從高中到現在的孽緣!? )，因為有你們讓我黑暗的研 究生生活出現一線曙光。 還有新進成員，感謝我的新鄰居阿姐慧貞，跟我討論實驗還不辭辛勞 的幫我安排各種schedule ^o^ ，以及由衷謝謝我的搞笑學妹兼我的新司 機，名翊維，字美智的任我差遣，還有“人緣廣”的冀冬、智彬、繼元與秉 鑫謝謝你們的各種幫助。 最後特別感謝我的貴婦阿媽與家人對我的包容與支持，謝謝所有關心 我的人！目錄
壹、 文獻回顧………...1
1.1 mRNA 穩定性及對基因表現的影響...1
1.2 mRNA 降解機制與 RNA 分解體 (RNA degradosome)...2
1.3 RNase E 的重要性 ...4
1.4 rne 基因與 RNase E 自我調控 (autoregulation) 機制 ...5
1.5 RNase E 蛋白質 ...7 1.6 環境因子對 RNase E 的影響 ...8 1.7 rpsO mRNA...9 貳、 原理………...10 2.1 批次培養 (batch culture) 時細胞生長模式...10 2.1.1 批次培養下細胞之生長曲線 ...10 2.1.2 菌體倍增時間 ...11 2.2 化學恆定連續式培養之原理 ...13 2.2.1 化學恆定連續式培養之動力學模式 ...13
2.3 聚合酶連鎖反應 (Polymerase chain reaction，PCR) 之原理...15
2.4 β-galactosidase 酵素活性 (specific activity) 之測定 ...15
2.5 mRNA 半衰期計算原理 ...16 參、 材料、設備與方法………...18 3.1 實驗材料 ...18 3.1.1 菌株 ...18 3.1.2 培養基與培養液 ...19 3.1.3 厭氧培養液的處理 ...20 3.1.4 DNA 電泳分析...21 3.1.5 RNA 萃取及電泳分析...21 3.1.6 電泳膠體 ...23 3.2 實驗方法 ...23 3.2.1 大腸桿菌生長條件與培養方法 ...23 3.2.2 β-galactosidase 酵素活性分析...28 3.2.3 大腸桿菌總 RNA 之萃取 ...31 3.2.4 mRNA 穩定性測定方法...32
肆、 結果………...39 4.1 不同生長期對 rne-lacZ 表現之影響 ...39 4.2 碳源對 rne 基因表現之影響 ...39 4.2.1 不同碳源對 rne mRNA 表現量影響 ...39 4.2.2 不同碳源對 rne 基因後轉錄層次(post-transcription)的影響40 4.2.3 不同碳源對 RNase E 活性影響 ...40 4.2.4 葡萄糖對 rne-lacZ 的影響 ...40 4.3 批次培養下氧氣對 rne 基因的影響...42 4.4 生長速率對 rne 基因表現的影響...42 4.5 HimA 蛋白對 rne 表現之影響...43 4.6 饑餓對 rne 表現之影響 ...44 伍、討論………...45 5.1 批次培養下，不同生長時期對 rne-lacZ 表現之影響 ...45 5.2 碳源對 rne 基因表現的影響 ...46 5.2.1 不同碳源對 rne 各層面之影響...46 5.2.2 葡萄糖效應、cAMP 與 CRP 對 rne 的調控...46 5.3 氧氣與生長速率對 rne 基因的影響...47 5.4 IHF 對 rne 基因於轉錄層次的影響 ...48 5.5 飢餓對 rne 基因於轉錄層次的影響...49 陸、論文圖表………...51 柒、參考文獻………...68 捌、附圖………...76
表目錄
表一、本實驗所使用菌株………51 表二、碳源對RNase E 受質 rpsO mRNA 半衰期之影響……….52 表三、氧氣與生長速率對RNase E 受質 rpsO mRNA 半衰期之影響...…..53
圖目錄
圖一、細菌生長與rne-lacZ 表現……….…………..54 圖二、葡萄糖與醋酸為碳源時 rne 基因之表現量 (A) 北方墨點分析及總 RNA 定量分析之電泳圖 (B) 程式定量分析基因相對表現量...55 圖三、不同碳源下 rne 基因之穩定度 (A) 40mM 葡萄糖 (B) 40mM 醋 酸...56 圖四、不同碳源下RNase E 對 rpsO mRNA 之活性測試 (A) 40mM 葡萄糖 下，rpsO mRNA 之穩定性 (B) 40mM 醋酸下，rpsO mRNA 之穩定 性………57 圖五、有氧環境下葡萄糖對大腸桿菌rne-lacZ 表現之影響………58 圖六、無氧環境下葡萄糖對大腸桿菌rne-lacZ 表現之影響……….59 圖七、氧氣對 rne 基因表現之影響 (A) 北方墨點分析及總 RNA 定量分析之電泳圖 (B) 程式定量分析基因相對表現量………...60
圖八、氧氣與生長速率對 rne 基因表現之影響 (A) 北方墨點分析及總
RNA 定 量 分 析 之 電 泳 圖 (B) 程 式 定 量 分 析 基 因 相 對 表 現 量………..61 圖九、有氧時生長速率對RNase E 之活性測試 (A) 生長速率 µ 為 0.24 h-1
時，rpsO mRNA 之穩定性及總 RNA 電泳圖 (B) 生長速率 µ 為 1.20 h-1時，rpsO mRNA 之穩定性及總 RNA 電泳圖………62
圖十、無氧時生長速率對RNase E 之活性測試 (A) 生長速率 µ 為 0.24 h-1 時，rpsO mRNA 之穩定性及總 RNA 電泳圖 (B) 生長速率 µ 為 1.20 h-1時，rpsO mRNA 之穩定性及總 RNA 電泳圖………..63 圖十一、IHF 對 rne 基因表現之影響 (A) 北方墨點分析及總 RNA 定量分
析之電泳圖 (B) 程式定量分析基因相對表現量..………64 圖十二、飢餓反應對rne 基因表現的影響 (A) 北方墨點分析及總 RNA 定 量分析之電泳圖 (B) 程式定量分析基因相對表現量………65 圖十三、野生株與 (p)ppGpp 基因突變株對 rne 基因表現之影響 (A) 正常 培養 (B) 饑餓培養……...66 圖十四、野生株與 (p)ppGpp 基因突變株之 rne 基因相對表現量 (A) 正常 培養 (B) 饑餓培養………..67
附圖目錄
附圖一、大腸桿菌內mRNA 的降解模式………..76
附圖二、RNase E 蛋白質結構………77 附圖三、rne-lacZ operon fusion 菌株之構築………..78
壹、
文獻回顧
1.1 mRNA 穩定性及對基因表現的影響
mRNA 降解 (degradation) 對於基因表現扮演了兩個重要角色：首先， mRNA 分子結構的穩定性決定了其可以當核糖體轉譯模板的時間；再者藉
由環境因子調控 mRNA 降解，能使細胞快速適應改變中之菌體所需
(Rauhut and Klug, 1999)。
相較於真核生物 mRNA 半衰期可長達一小時而言，原核生物 mRNA
半衰期只有幾分鐘，是明顯短了許多。正因原核生物可在短時間將 mRNA 降解，所以能對環境改變做出快速的反應及適應 (Regnier and Arraiano, 2000)。且 mRNA 降解過程大都遵循著全有全無定律 (all-or-none) ，所以 一旦降解作用開始進行後，整個mRNA 便很快地降解掉，很少會累積其中 間產物，以避免製造無功能的蛋白質，進而確保核酸有效分解及再利用 (Py et al., 1994)。 mRNA 的穩定性對蛋白質的表現量及細胞的代謝途徑影響甚大，因此 mRNA 的降解速率對細胞的生理調控極為重要。細胞內調控基因表現之高 低通常透過調節個別轉錄產物 (transcripts) 的穩定性，會造成不同 mRNA 之間的降解速率有著極大的差異 (Georgellis et al., 1995) 。大腸桿菌體內 不同基因之 mRNA 半衰期就有很大的差異，有些 mRNA 的半衰期很短， 僅有二十至三十秒，有些則可長達數十分鐘，一般而言，大部分mRNA 的
1.2 mRNA 降解機制與 RNA 分解體 (RNA degradosome)
在大腸桿菌mRNA 降解機制中，核糖核酸分解酶 (ribonuclease) 為主 要分解 mRNA 的酵素，其中又可分為核糖核酸切內酶 (endoribonuclease) 和核糖核酸外切酶 (exoribonuclease) 兩大類。而於 in vivo 的情況下，調控 mRNA 降解機制的因子還包括了核糖體 (ribosome) 、負責解開 mRNA 二 級 結 構 的 解 旋 酶 (helicase) 以 及 mRNA 本 身 特 殊 的 二 級 結 構 序 列 (Regnier and Arraiano, 2000)，且外在環境改變及細菌生長速率也會影響 mRNA 穩定性 (Wellington et al., 1993)。
絕大部分 mRNA 降解起始於一個主要的內切作用，通常由 RNase E (ribonuclease E) 或少數由 RNase III (ribonuclease III) 來進行。爾後所產生 新的 3’端再被外切酶 PNPase (polynucleotide phosphorylase) 或 RNase II (ribonuclease II) 辨 識 而 自 3’ 端 往 5’ 端 降 解 (Barlow et al., 1998; Grunberg-Manago, 1999; Regnier and Arraiano, 2000)，最後 mRNA 會被降解 成單核苷酸(mononucleotides)及寡核苷酸(oligonucleotides)，或再進一步被 oligoribonuclease 代謝成更小的分子 (附圖一) (Walsh et al., 2001; Kushner, 2002)。
近來研究發現，在大腸桿菌中 RNA 之代謝或降解會由一個酵素複合
體的形式來進行，此酵素聚合體稱為RNA 分解體，RNase E 為 RNA 分解 體的主要骨架，其 C 端 （胺基酸 734-1061） 具有其他 RNA 分解體主要 組成的酵素PNPase、RhlB (RNA helicase) 與 enolase 的結合位置 (Miczak et al., 1996; Ow et al., 2002; Py et al., 1996) (附圖二) 。另外 RNA 分解體有時 還包括少量的GroEL、DnaK 及 PPK (polyphosphate kinase) (Blum et al., 1997; Coburn et al., 1999; Liou et al., 2001)。目前 in vivo 實驗已證實 RNA 分解體
確實存在於大腸桿菌內，以附著於細胞膜來進行分解作用 (Liou et al., 2001)。而其各個組成之相關研究內容如下：
PNPase 由兩個分子量各為 85 KDa 與 48 KDa 的單元體組成，屬於外 切酶，為pnp 基因產物 (Deutscher, 1993)。PNPase 自 3’端降解 mRNA，一 次移去一個核酸，產生雙磷酸核酸 (Deutscher, 1993; Hajnsdorf et al., 1994)。過去研究發現，在 PNPase 缺失的突變株中，poly (A) tail 會大幅延 長，由此證實PNPase 在分解 mRNA 3’端的 poly (A) tail 上為很重要的核糖 核酸酶 (Huang et al., 1998)。
RhlB 是 DEAD box proteins 之中的一員，DEAD 為 Asp-Glu-Ala-Asp
四個氨基酸的縮寫，這類蛋白質在序列中皆有一段 DEAD 之高度保留區，
所以稱為DEAD box proteins。RhlB 作用時需要消耗能量 ATP，其功能為 將 RNA 上的雙股結構解開形成單股 RNA 結構，使外切酶可自 3’端往 5’ 端而將RNA 降解 (Miczak et al., 1996; Py et al., 1996; Rauhut and Klug, 1999)。當缺乏 ATP 時，RhlB 無法作用，則 RNA 分解體不能完全將 mRNA 降解為核苷酸 (nucleotide) 而產生中間產物，由此可知 RhlB 在降解 RNA 上亦扮演重要的角色 (Py et al., 1996; Rauhut and Klug, 1999)。
PPK 之功能為可逆性合成及分解 polyphosphate (poly (P) ) ，使 AMP 及ADP 形成 ATP (Ishige and Noguchi, 2000)。在 in vitro 實驗中，poly (P) 會 強烈抑制RNA 的降解，但在加入 ADP 後，抑制效果即消失，因此時 PPK 會將 poly (P) 分解，進而與 ADP 結合成 ATP。因此 PPK 在 degradosome 內的功用，可能是分解poly (P)，再與 RhlB 水解 ATP 後所產生的 ADP 結 合，製造ATP 以提供給 RhlB 重複使用 (Blum et al., 1997)。
Enolase 為參與糖解作用中的一個酵素，可將 2-phosphoglycerate 移走 一個水分子形成phosphoenopyruvate (Woo and Lin-Chao, 1997)，在細胞內 僅有5~10%的 enolase 會與 RNA 分解體結合，但其在 RNA 分解體中之功
用目前仍不清楚 (Rauhut and Klug, 1999)。GroEL 為一種 chaperonin 蛋白， 除了幫助蛋白質摺疊 (protein folding) 外，亦可調節 mRNA 穩定性，其會 與 RNase E 一起被純化，在功能上也與 RNase E 活性具有交互作用 (Sohlberg et al., 1993)。
1.3 RNase E 的重要性
RNase E 最早被提及於過去文獻中，是因為其參與大腸桿菌中作用 9S rRNA 成熟為 5S rRNA 之必須蛋白質 (Gegenheimer et al., 1977; Ghora and Apirion, 1978) 。 現 今 已 有 超 過 二 十 種 大 腸 桿 菌 之 核 糖 核 酸 分 解 酶 (Deutscher, 1993) 被鑑定出，其中具核糖核酸內切酶活性的主要有 RNase E 、RNase III 及 RNase P (Deutscher, 1985,1993; Apirion and Miczak,1993)， 而大部分mRNA 的降解均起始於 RNase E 的內切作用，此步驟亦為速率決
定步驟，因此 RNase E 被認為是大腸桿菌中降解 mRNA 最重要的酵素
(Apirion, 1978; Ono and Kuwano, 1979; Mudd et al., 1990; Babitzke and Kushner, 1991; Melefors and von Gabain, 1991; Taraseviciene et al., 1991)。
雖然RNase E 已被定義為內切酶，但於最近研究發現 in vitro RNase E 具有外切活性，可切短位於3’端的 poly (A)與 poly (U) tails 產生單核苷酸 產物 (Huang et al., 1998; Nicholson, 1999)。目前已知 RNase E 在大腸桿菌 中扮演多重角色，除了先前所提到與 9S rRNA 的成熟有關 (Ghora and Apirion, 1978)，也會作用 16S rRNA 的 5’端 (Li et al., 1999) 以及成熟 RNase P 的 RNA subunit，亦參與 tRNA 之成熟 (Li and Deutscher, 2002)。 且其可切割負調控子RNA I 及 copA 和 sok (控制或維持 ColE1 和 R1 質體
copy number 的基因)，因而被認為可控制細菌體內 DNA 複製 (Cohen and McDowall, 1997; Le Derout et al., 2002)。RNase E 對很多 RNA 都有切割的 活性，包括降解自身的mRNA (rne trascripts)、OmpA、TrxA 和核糖體蛋白 S20、S15 的 mRNA (rpsT 及 rpsO)等 (Rauhut and Klug, 1999; Le Derout et al., 2002)。
由過去文獻得知，當細胞內缺乏 rne 基因，會造成大部分的 mRNA 降
解不完全，進而造成菌體死亡，且利用質體大量表現 rne 基因則使細胞生
長減慢、失去含rne 之質體或產生 rne 突變株 (Jain and Belasco, 1995; Woo and Lin-Chao, 1997; Grunberg-Manago, 1999)，故細胞內 RNase E 至少須為 正常值之10~20%才可維持菌體生長 (Jain et al., 2002)，由此可知 RNase E 在維持菌體生存上扮演著重要的角色。
1.4 rne 基因與 RNase E 自我調控 (autoregulation) 機制
rne 基因具有三個啟動子，其中 p2 及 p3 分別位於 p1 上游 34 及 145 核苷酸處，形成的5’-untranslated region (5’-UTR)分別為 395 核苷酸及 506 核苷酸。啟動子轉錄能力 (transcription activity) 由高至低分別為：野生株 (wildtype，即具有三個啟動子)、p1 啟動子、p3 啟動子、p2 啟動子。當細 胞內分別只具有p1、p2 及 p3 其中一種啟動子時，便已足夠維持細胞存活， 但會明顯減少細胞內的 RNase E 濃度，並使 RNase E 失去自我調節的能 力。另外細胞內RNase E 濃度下降時，雖然會使 rne mRNA 穩定性增加， 但其轉譯的效率亦下降 (Ow et al., 2002)。
其存在與否皆會影響菌體的存活能力，因此大腸桿菌非常嚴密地調控 RNase E 在菌體內的量 (Jain and Belasco, 1995; Grunberg-Manago, 1999; Diwa et al., 2002)。而 RNase E 藉由改變對自己 mRNA 降解速率來控制自 身的合成，此種回饋抑制 (feedback control) 的機制是經由啟動子 p1 所轉 錄rne mRNA 的 5’-UTR 所調控 (Jain and Belasco, 1995)。rne mRNA 長 3.6-Kb，啟動子 p1 產生的 5’-UTR 具有 361 個核苷酸 (Jain and Belasco, 1995; Ow et al., 2002)。為了使細胞內 RNase E 能維持適當的濃度，RNase E 可自
我調控於菌體內的含量，當細胞內RNase E 活性或濃度變高時，便會加快
對rne mRNA 的降解速率 (Jain and Belasco, 1995; (Diwa et al., 2002)，所以 將菌體內 rne 基因增加 21 倍時，RNase E 蛋白只增加 2.8 倍 (Jain and Belasco, 1995)。若將 rne mRNA 的 5’-UTR 刪除，RNase E 便失去自我調節 的功能。5’-UTR 可折疊出三個髮夾結構 (stem-loop structure) ，其中第二 個stem-loop (hp 2) 是影響 RNase E 自我調節最主要的區域，其調控機制可 能是直接或間接提供RNase E 結合位置，並幫助 RNase E 找到其切點，進 而快速地分解rne 之 mRNA (Diwa et al., 2000; Diwa and Belasco, 2002)。值 得一提的是雖然5’-UTR 上有 RNase E 的切點，但將此切點突變並不影響 RNase E 自我調控的功能，推測 rne mRNA 上可能有許多 RNase E 的切點 所致 (Jain and Belasco, 1995)。
此外目前發現當RNase E 失去活性時，rne 之 mRNA 會被其它內切酶 作用，切點位於1558 及 1576 核苷酸處 (靠近 3’端) 並產生 2-kb 片段 (Woo and Lin-Chao, 1997)。而減少細胞內 RNase E 時，其它 RNA 降解速率的下 降並不與之呈正比 (Jain et al., 2002)，引此推測 rne mRNA 穩定度除了受 RNase E 自我調節之外，亦會受 RNase E-independent 機制所調控(Woo and Lin-Chao, 1997; Barlow et al., 1998)。
1.5 RNase E 蛋白質
RNase E 是 rne 基因 (即 ams 或 hmp 基因) 轉譯而得，由 1,061 個胺基 酸組成，分子量為118 kDa，但在 SDS-polyacrylamide gel 上卻移動至 180 kDa 位置 (Casaregola et al., 1992, 1994)，這種異常的移動是因為在 RNase E 的C-端含有一段 proline-rich 的序列所造成 (Cohen and McDowall, 1997)。 在1993 年之前所提到的核糖核酸內切酶 RNase K，已證實為 RNase E 酵素 水解後殘存仍具有活性的酵素，因此RNase K 正式改名為 RNase E (Mudd and Higgins, 1993)。RNase E 蛋白之 N 端 (胺基酸 1∼498) 為剪切 RNA 酵 素活性區，亦為影響細胞存活主要位置 (McDowall and Cohen, 1996)；C 端 (胺基酸 734∼1061) 為與 RNA 分解體其他三個主要成員 RhlB、enolase 及 PNPase 蛋白結合處 (Vanzo et al., 1998)，若將此區刪除並不會影響細菌的 存活，但會妨礙 mRNA 降解及 RNase E 自我調控的能力 (Lopez et al., 1999; Jiang et al., 2000)。胺基酸 580∼700 處有一段 arginine-rich 的序列， 為RNase E 與 RNA 結合的區域 (附圖二) (Cohen and McDowall, 1997; Jiang et al., 2000; Diwa et al., 2002)。
RNase E 切割位置通常是單股 RNA 且為 AU-rich 的序列區 (Babitzke and Kushner, 1991; Cohen and McDowall, 1997; Le Derout et al., 2002)，其切
割效率受到RNA 結構與是否接近其切點所影響，如核糖體或與 RNA 結合
的蛋白質 (如 DEAD box helicases) 均可能會遮閉 RNase E 的切點，使得 RNase E 切割效率降低 (Iost and Dreyfus, 1995; Le Derout et al., 2002)。 RNase E 需自 RNA 的 5’端開始作用 (5’-end-dependence)，若將其受質以人 為方式使mRNA 兩端接合形成圓形 (circular form) 時，RNase E 便無法作
用 (Mackie, 1998; Grunberg-Manago, 1999; Carpousis, 2002)，而當受質 5’ 端為單一磷酸根 (monophosphate) 時，RNase E 可較有效率地將其降解 (Grunberg-Manago, 1999; Regnier and Arraiano, 2000; Le Derout et al., 2002)。
1.6 環境因子對 RNase E 的影響
為適應不斷改變的外在環境，大腸桿菌具有許多不同的代謝途徑，生
成各種蛋白，以供環境改變時，能迅速適應。將大腸桿菌培養在營養豐富
的培養液中，在diauxic lag 生長時，rne mRNA、RNase E 蛋白及 RNase E
作用於其受質的能力皆會暫時下降；可是在厭氧環境下，此種 diauxic
response 並不會發生 (Barlow et al., 1998)。而 RNase E 是降解 mRNA 的主 要酵素，因此許多研究，都是利用RNase E 受質的穩定性，或 9S rRNA 產 生5S rRNA 的能力來推知不同環境下 RNase E 活性的高低。研究發現，將 生長快速的大腸桿菌移至營養貧脊的培養液中，RNase E 之受質 ompA mRNA 降解速率上升，9S rRNA 形成 5S rRNA 的速率下降；相反地，若將 生長緩慢的細胞移至營養培養液中，ompA mRNA 降解速率下降，9S rRNA 形成5S rRNA 的速率上升 (Georgellis et al., 1992)。而在厭氧環境、相同的 生長速率下，ompA mRNA 降解速率及 9S rRNA 形成 5S rRNA 的速率皆會 下降 (Georgellis et al., 1993)。由過去文獻也得知，若將培養溫度上升至 44℃，則會造成 rpsO mRNA 累積；若於培養液中加入 casamino acid，rpsO mRNA 則可被降解，且此時細胞內 RNase E 量上升 (Woo and Lin-Chao, 1997; Le Derout et al., 2002)，另外以人工誘導 RNase E 的受質 (substrate)
表現時發現造成rne mRNA 會累積，這是因 RNase E 對 rne mRNA 切割活 性改變所造成的結果 (Sousa et al., 2001)。由上述可知當環境改變時可能會 改變細胞內RNase E 的活性及濃度 (Le Derout et al., 2002)。而實際上環境
因子是如何影響 RNase E 的表現，目前仍不甚清楚，因此我們藉由
β-galactosidase 酵素活性的表現、北方墨點以及測定 RNase E 之受質 rpsO mRNA 的穩定性來推知各種環境因子對 rne 基因在轉錄層面上和酵素活性 的影響與調控。
1.7 rpsO mRNA
rpsO mRNA 的蛋白質產物為核糖體蛋白(ribosome protein) S15。大腸
桿菌中 rpsO mRNA 的降解途徑是目前研究最清楚的降解途徑之一。其降
解的起始步驟是由RNase E 切第一刀，使其缺乏 3’端的髮夾結構，之後就 會由外切酶 PNPase 及 RNase III 快速的由 3’端往 5’端進行降解 (Regnier and Hajnsdorf, 1991; Hajnsdorf et al., 1994; Braun et al., 1996)。
最近文獻指出，環境因子會控制RNase E 作用 rpsO mRNA 的效率。 研究發現，當培養基缺乏casamino acid 時，大腸桿菌細胞中 rpsO mRNA 濃度會上升。而造成其濃度上升的原因為RNase E 作用 rpsO mRNA 之 M2 位置的效率減低，使得rpsO mRNA 趨於穩定化 (Le Derout et al., 2002)。 由此可知，rpsO mRNA 可以很靈敏的感應到環境因子調控 RNase E
作用，而反應在它的穩定度上，因此於本實驗中我們選擇 rpsO mRNA 作
貳、
原理
2.1 批次培養 (batch culture) 時細胞生長模式 批次培養法是指在細胞的培養過程中不再添加任何新鮮的培養液，僅 於開始時提供定量的培養液供細胞生長所需。由於細胞的生理狀況、培養 液組成及細胞代謝產物等因素均會影響細胞的生長，因此進行分批式培養 時，細胞的生長具有一定模式，且可依細胞生長濃度與所需時間作出一條 生長曲線。 2.1.1 批次培養下細胞之生長曲線 在批次培養系統下，細菌的生長過程可分為以下六個時期 (Lee, 1992)： 1. 遲滯期 (lag phase)： 細菌開始適應新的環境，菌體的重量會增加，但細胞不會分裂繁殖。 2. 加速生長期 (accelerated growth phase)：細菌體開始進行分裂，細胞數增加，且細菌的生長速率逐漸增加至 最高生長速率。
細菌以最高生長速率在固定時間內分裂一次，菌數亦隨著時間呈對 數比例增加。
4. 減速生長期 (decelerated growth phase)： 菌體生長及分裂速率均開始降低。 5. 靜止期 (stationary phase)： 細菌的增殖速率與死亡速率相等，菌數維持一定。 6. 死亡期 (death phase)： 環境中的養分耗盡，過量代謝產物累積對菌體產生毒害作用。細 菌的死亡速率快於增殖速率，菌數開始降低。 欲研究細菌生理及生長速率，一般皆取對數生長期之菌體加以測定分 析。 2.1.2 菌體倍增時間 菌體自開始培養到最後總菌群為N 時，可依下列公式表示： N = N0 × 2n --- (2-1) 其中N：最後菌數 N0：起始時間菌數 n：菌體培養時的世代數
(2-1) 式兩邊取自然對數 ln N = ln N0 + ln 2n ↓ ln N =ln N0 + n ln 2 ↓ ln (N / N0) = n ln 2 --- (2-2) ln 2 = 0.693 代入 (2-2) 式 n = ln (N / N0) / 0.693 ↓ n = 1.443 × ln (N / N0) --- (2-3) 菌群加倍所需時間為倍增時間，以下列公式表示： g = t / n --- (2-4) 其中 g：菌體倍增時間 t：發生 n 次世代所需時間 N0和 N 為已知，則可由 (2-3) 式得到 n 值，將其代入 (2-4) 得到 g 值即菌體的倍增時間。
2.2 化學恆定連續式培養之原理 連續式培養可依對流量控制之方式不同而分兩種形式，一種是利用可 調式幫浦直接控制流進基質的量，同時從反應槽中移除相同體積的菌液， 以維持反應槽中的培養體積固定。流進的基質成分中，除了一種為限量基 質 (limited nutrient) 外，其餘的養分均夠細胞生長所需。而此限制生長的 營養因子 (growth-limiting nutrient) 在連續式培養的過程中濃度受新鮮培 養液之稀釋速率 (dilution rate) 控制，並控制了在穩定狀態 (steady state) 下細胞族群的大小。此種方式之培養稱為化學恆定 (chemostat) 的連續式 培養 (chemostat 是指在穩定狀態時培養基內的化學組成維持一定)。另一種 方式稱為濁度恆定 (turbidostat) 連續式培養，其培養液之流量是以光電管 來控制，這種光電管可以很敏銳的察覺反應槽中細胞濃度變化，當培養液 中菌體的吸光度超過設定值時，可依據光電發出的訊號來添加基質以維持 細胞濃度的一定。本論文中採用化學恆定的連續式培養法來控制細胞生長 速率。 2.2.1 化學恆定連續式培養之動力學模式 當連續式培養達穩定狀態時，反應槽中細胞質量的平衡狀態可以下 列反應式表示：
FX0/V – FX/V + µX –αX = dX/dt --- (2-5) X0：進料時的細胞質量 X：細胞質量 µ：比生長速率 (hr-1) α：死亡速率 (hr-1) F：培養液流量 (L/hr) V：培養體積 (L) t：時間 (hr) 由於進料的培養液為滅菌培養液，所以為無菌狀態 (即 X0 = 0)，且 在連續式培養中，比生長速率遠大於死亡速率 (µ > > α)，所以上式可 以簡化如下： (µ – F/V)X = dX/dt --- (2-6) 當反應槽達穩定狀態時，單位時間內菌體質量的變化為零，即 dX/dt = 0 所以由 (2-6) 可得 µ = F/V --- (2-7) 又將F/V 定義為稀釋率 (D)，因此可得 µ = D，也就是在化學恆定連續 式培養過程中固定反應體積 (V) 下只需控制培養液流動速率 (F) 即
可控制細胞生長速率。所以在低的稀釋速率時，相對槽體內所含的限制
營養成分濃度降低，細胞生長速率減慢；當稀釋速率高時，相對槽體內 所含的限制營養成分濃度提高，細胞生長速率則會增快。
2.3 聚合酶連鎖反應 (Polymerase chain reaction，PCR) 之原理
聚合酶連鎖反應是在活體外，以基因組DNA 當模板 (template)，將某 段特定序列之套數擴增至數百萬倍，利於實驗進行分析。PCR 原理係利用 高溫將雙股基因組 DNA 分成單股 (denature)，並以兩段單股的引子 (primer) 與單股基因組 DNA 互補接合 (primer annealing)，經由耐熱性高的 Tag DNA polymerase 產 生 聚 合 反 應 ， 進 行 primer 下 游 的 序 列 合 成 (extension)，至此稱為一個週期。之後重新進行 DNA 分股的步驟，依序進 行多個週期。當進行 n 個週期時，便產生 2n條特定序列雙股 DNA，藉此 達到擴增大量特定序列之目的。
2.4 β-galactosidase 酵素活性 (specific activity) 之測定
不同環境因子對rne 基因於轉錄層面 (transcriptional level) 的影響，可 由rne-lacZ 中 reporter fusion 所表現的 β-galactosidase 酵素活性得知。
大腸桿菌可利用乳糖 (lactose) 作為唯一碳源，在雙醣的代謝中需 β-galactosidase 酵素將乳糖水解為半乳糖 (galactose) 和葡萄糖 (glucose)。
生長於乳糖培養基中的每個大腸桿菌含有數千個 β-galactosidase 分子，若 生長於其它碳源中，如葡萄糖或甘油 (glycerol)，則每個細胞只含有少於十 個 β-galactosidase 分子，所以其專一性很高。又因為培養基中乳糖的存在 會誘導 β-galactosidase 大量增加，其是藉由引導新的酵素分子合成而非活 化proenzyme，因此 β-galactosidase 是一個可誘導的酵素。在乳糖操縱組及 結構基因中，lacZ 的基因產物即為 β-galactosidase，是乳糖操縱組裡最主要 的一種酵素，且極為穩定易被偵測，故lacZ 是常被用來接在欲研究啟動子
(promoter) 後面的結構基因 (structure gene)。若啟動子表現能力強，則可 測得較高的β-galactosidase 酵素活性。
β-galactosidase 的酵素活性 (specific enzyme activity) 可利用色素原基 質 o-nitrophenyl-β-d-galactopyraniside (ONPG) 來檢測。在 β-galactosidase 存在下，此無色的複合物會分解成半乳糖和硝基酚 (o-nitrophenol)，因硝 基酚是黃色的，所以可在波長 420 nm 下偵測其吸光度。在過量的 ONPG 下 o-nitrophenol 的產量與酵素的含量呈正比，故可對 β-galactosidase 作定 量的測定。當加入濃碳酸鈉溶液使 pH 值變成 11 時，β-galactosidase 失去 活性，則反應終止。 2.5 mRNA 半衰期計算原理 mRNA 自 N0 開始降解，最後殘餘數值為 N 時，依下列公式表示： N = N0 / 2n ---(2-8)
N0 ： mRNA最初表現量 N：一段時間（t）後， mRNA 殘餘表現量 n：降解半衰期次數 (2-8) 式兩邊取自然對數 ln N0 = ln N ＋ n ln 2 ↓ n = ln (N0 / N) / ln 2---(2-9) ln 2 = 0.693 代入 (2-9) 式 n = ln (N0 / N) / 0.693 ↓ n = 1.443 × ln (N0 / N) ---(2-10) 經由測量 N0 與 N 的量，得到 ln (N0 / N) 代入 2-10 式，可求得 n 。 半衰期（T1/2）即 T1/2 = t / n ，此時 N = 1/2 N0 。
參、
材料、設備與方法
3.1 實驗材料
3.1.1 菌株
1. 菌株
Escherichia coli K12
Escherichia coli K12 ∆relA Escherichia coli K12 ∆spoT Escherichia coli K12 ∆relA ∆spoT
Escherichia coli MC4100： (F- araD139 ∆(argF-lac)U169 rpsL150 relAl flb-5301 deoC1 ptsF25 rbsR)
HHS2： 利用 λ phage 將 rne-lacZ operon fusion 插入 MC4100 染色體中 (附圖三)。 HHS5：利用 P1 lysate 將 ∆cya 送至 HHS2，篩選菌株之抗生素為 Kanamycin。 HHS9：利用 P1 lysate 將 ∆crp 送至 HHS2，篩選菌株之抗生素為 Tetracyclin。 HHS10：利用 P1 lysate 將 ∆himA 送至 HHS2，篩選菌株之抗生素為 Tetracyclin。
3.1.2 培養基與培養液
1. 基礎培養液 (minimal medium)
每公升 solution I 須加入 1 毫升 solution II
Solution I：KH2PO4 5.44 g，K2HPO4 10.49 g，(NH4)2SO4 2 g，casamino acids 0.5 g
Solution II (以 0.2 N H2SO4為溶劑)：
MgSO4•7H2O 50 g，MnSO4•H2O 5 g，FeSO4•7H2O 0.125 g， CaCl2•2H2O 0.735 g
2. LB (Luria-Bertani) 培養液
1% Tryptone，0.5% Yeast extract，1% NaCl pH 7.0 3. LB 培養基
1% Tryptone，0.5% Yeast extract，1% NaCl pH 7.0，1.5% Agar 4. LB-Kanamycin 培養基
1% Tryptone，0.5% Yeast extract，1% NaCl pH 7.0，1.5% Agar，30 µg/ml Kanamycin
5. LB-Chloroamphenicol 培養基
1% Tryptone，0.5% Yeast extract，1% NaCl pH 7.0，1.5% Agar，30 µg/ml Chloroamphenicol
6. LB-Kanamycin, Chloroamphenicol 培養基
1% Tryptone，0.5% Yeast extract，1% NaCl pH 7.0，1.5% Agar，30 µg/ml Kanamycin，30 µg/ml Chloramphenicol
1% Tryptone，0.5% Yeast extract，1% NaCl pH 7.0，1.5% Agar，X-gal 40 mg/L
8. LB-X gal-Tetracyclin 培養基
1% Tryptone，0.5% Yeast extract，1% NaCl pH 7.0，1.5% Agar，X-gal 40 mg/L，30 µg/ml Tetracyclin
9. LB-X gal-Kanamycin 培養基
1% Tryptone，0.5% Yeast extract，1% NaCl pH 7.0，1.5% Agar，X-gal 40 mg/L，30 µg/ml Kanamycin
10. LB-X gal-Kanamycin-Tetracyclin 培養基
1% Tryptone，0.5% Yeast extract，1% NaCl pH 7.0，1.5% Agar，X-gal 40 mg/L，30 µg/ml Kanamycin，30 µg/ml Tetracyclin 以上培養基 (液) 若須添加碳源、抗生素或指示劑時皆待 121 ℃高濕 高壓滅菌後冷卻至55 ℃後再加入。 3.1.3 厭氧培養液的處理 本實驗所需用到的厭氧培養液其組成與好氧培養液相同，唯配製時處 理方式不同。為確保細菌於厭氧環境下生長，所有厭氧環境下實驗所需用 到的培養液，在配製好後裝於錐形瓶中必須事先加熱煮沸，再以氮氣趕走 培養液中的氧氣。煮沸 10 分鐘後將錐形瓶迅速放於冰中冷卻，此時即開 始通氮氣。分裝前的試管亦必需先通氮氣，每根試管分裝10 ml 的培養液 後，立刻以鋁蓋封口，並以121 ℃高溫高壓滅菌。
3.1.4 DNA 電泳分析
藥品
Promega：agarose
J. T. baker：Tris-HCl , EDTA Viogene : DNA gel extraction kit
緩衝液
1. TAE electrophoresis buffer
40 mM Tris-HCl, 40mM acetate, 1 mM EDTA 2. DNA gel loading dye (PROtech Lot#AL24)
3.1.5 RNA 萃取及電泳分析
藥品
BDH：chloroform MRC：TRI reagent
Merck：formamide, formaldehyde, ammonium acetate, ethanol, 3-(N-Morpholino propanesulfonic acid) (MOPS), sodium acetate, sodium citrate, Denhardt's solution
Roche : Anti-DIG-AP, positively charged nylon membrane, CSPD®
J. T. Baker : HCl, NaCl, NH4Cl, (NH4)2SO4, CaCl2, MgCl2⋅6H2O,
2-propanol, Tris-HCl, sodium dodecyl sulfate (SDS), dimethyl sulfoxide (DMSO)
緩衝液
1. PCR DIG Peobe Synthesis Kit (Roche 1 636 090) 2. DIG Wash and Block Buffer set (Roche 1 585 762) 3. 10X formaldehyde gel running buffer
0.2 M MOPS, 80 mM sodium acetate, 10 mM EDTA (pH 7.0) 4. RNA gel loding dye (Ambion cat#8552)
5. 20X SSC, pH 7.0
3 M NaCl, 300 mM sodium citrate 6. 20X SSPE, pH 7.0
3 M NaCl, 0.2 M NaH2PO4⋅H2O, 0.02 mM EDTA (pH 7.4) 7. Hybridization buffer
5X Denhardt's solution, 33% formamide, 6.6X SSPE, 1% SDS, 50﹪Dextran sulfate
8. Tris-glycine electrophoresis buffer
25 mM Tris-base, 250 mM glycine(pH 8.3), 0.1% SDS 9. Rifampicin solution
1 g rifampicin 於 10 ml DMSO, 過濾滅菌 10. DEPC treated water
1 ml DEPC 於 1 L ddH2O, 震盪 2 分鐘，靜置 10 小時後高溫高 壓滅菌
3.1.6 電泳膠體
1. DNA gel
1.0% agarose 溶於 1 X TAE buffer中 2. RNA gel
1.2 % agarose (Peomega), 1 X formaldehyde gel running buffer, 2.2 M formaldehyde 3.2 實驗方法 3.2.1 大腸桿菌生長條件與培養方法 1. 繼代培養 菌株之第一代培養皆以LB 為培養液，挑單一菌落於培養液，在 37 ℃ 恆溫震盪箱，以震盪速率200 rpm 培養 12∼16 小時。利用四區劃法將菌 株畫於含1.5%洋菜膠的平板培養基上 (LB plate) (不同菌株可依其所需培 養在含不同抗生素的平板培養基上)，在 37 ℃恆溫箱培養。同時本實驗所 使用的菌株多為lacZ fusion，所以平板培養基需含有 X-gal，而 X-gal 需避
光以避免其分解。因lacZ 之關係，所生成的菌落應為藍色。待菌落生成後
將其置於4 ℃保存。4 ℃下平板培養基上之菌株大概可保存一個月，因此
每個月均需重覆以上繼代培養之工作，保持菌株新鮮度以防止其失去活
性。另外，將菌株做長期保存的方法為在37 ℃培養菌液至平穩期後，取菌
冰櫃。 2. 批次培養 (batch culture) 為使菌體適應生長環境，所以需先作二次繼代培養，然後再於第三代 時培養在所需條件。 第一代培養：挑取單一菌落接種至5 ml 的 LB 培養液 (依其需要可在 培養液中加入所需的抗生素)，培養 6~8 小時使菌體活化。 第二代培養：取適量菌液接種到有氧及厭氧的基礎培養液，並以終濃 度40 mM 葡萄糖作為碳源，於 37 ℃隔夜培養，此培養目的在使細菌適應 新的生長環境。 第三代培養：取適量菌液至有氧及厭氧，並以40 mM 葡萄糖為碳源的 基礎培養液中進行培養。所加入的菌量多寡完全視菌液的濃度而定，唯加 入之菌量在OD600上升範圍控制於0.02~0.025 之間，並於 37 ℃ 200 rpm 培 養 。 在 有 氧 環 境 下 ，5 ml 培 養 液 之 透 氣 塑 膠 蓋 的 玻 璃 管 中 培 養 至 mid-exponential phase 大約是 OD600吸光值為0.40~0.45 時收取；而厭氧環 境之培養則是用10 ml 的培養液，以鋁蓋封口之玻璃管，菌液利用針筒注 入，並注意避免打入空氣，培養至 OD600在 0.20∼0.25 之間收菌。收菌後 罝於冰上 20 分鐘後以 6000 rpm，離心 10 分鐘並除去上清液，離心下來 的菌體以PM2 buffer 懸浮，準備作 β-galactosidase 活性測定之分析，或置 於- 80 ℃酒精冰桶 10 秒鐘，之後進行總 RNA 萃取。 以下除最後一次繼代培養時依其所需加入不同碳源或不同培養環境 外，其餘培養及收菌條件皆相同。
3. 飢餓處理 (starvation) 將菌體培養在 LB 培養液中，當其生長達對數生長期前期，以 6000 rpm，離心 10 分鐘，倒去上清液，利用不含 casamino acid 之基礎培養液清 洗菌體後再以6000 rpm，10 分鐘離心，倒去上清液之後加入不含 casamino acid 之基礎培養液繼續培養 30 分鐘。 4. 連續式培養 (continuous culture)
本實驗用化學恆定連續式培養 (chemostat continuous culture) 控制細 胞 的 生 長 速 率 。 在 連 續 式 培 養 過 程 中 細 胞 生 長 速 率 可 用 比 生 長 速 率 (specific growth rate, µ) 表示。細胞數目增倍所需的時間為 Td (doubling time) 與比生長速率 (µ) 的關係為 Td = ln 2/µ。在連續式培養中當進料的 液體為無菌之培養液且醱酵槽內細胞生長已達穩定狀態 (steady state) 時，µ 可用稀釋度 (D) 來表示，即 µ = D，
其中D = F/V
F：培養液之流動速率 (medium flow rate) V：培養液在醱酵槽內體積 (working volume)
而稀釋率由可調式幫浦決定，因此可控制細菌的比生長速率 (詳見 2.2)。
(1) 培養基的製備
化學恆定連續式培養使用之培養基與批式培養的基本培養基成分相
由於連續式培養須消耗大量培養液，所以以20 L 的儲水桶 (Nalgene cat No. 2250-0050) 為單位，每桶裝 17 L 的 minimal medium，配製數桶後於高溫 高壓下滅菌100 分鐘，於滅菌後待培養液溫度下降到室溫時再添加碳源。 (2) 連續式培養系統之裝置 連續式培養系統主要可分為四個部分：槽體、流速測定管、培養液供 應桶、廢液收集桶。 a. 槽體之組裝： 槽體為連續式醱酵之主體。將槽身洗淨後加入1 L 的去離子水，把上蓋 裝配鎖緊，將冷凝管出口及進氣口接上0.22 µm 濾菌膜，各出口及接頭均 用鐵夾封閉並在管口處包上錫箔紙。以打氣幫浦測試槽體是否有漏氣情 況，直到調整到完全封閉後才可加以滅菌。滅菌時須打開冷凝管出口以防 止滅菌時壓力的變化。 b. 流速測定管： 將滴定管頂部以棉花塞住，包上錫箔紙。滴定管之下方接上三插管，再 接上矽膠管而分成兩個接頭，其中一個與槽體相接，另一個則與進料管相 接，並在管口處包上錫箔紙，二接頭均用鐵夾封閉。 c. 培養液供應桶： 內裝有17 L 的培養液，桶上的蓋子有兩個接頭，一個是負責進料的接 頭，另一個接頭則與過濾器相接，目的在平衡桶子內外的壓力並過濾空氣，
所有出口及接頭均用鐵夾封閉並在管口處包上錫箔紙，以防止滅菌後的污 染。 d. 廢液收集桶： 以20 L 的空桶收集廢液用。桶上的蓋子也有兩個接頭，一個與醱酵槽 出料管相接以收集廢液，另一個接頭與裝有棉花之注射筒的筒身相接，目 的也是在平衡桶子內外的壓力並過濾空氣，出口及接頭均用鐵夾封閉並在 管口處包上錫箔紙，以防止滅菌後的污染。 槽體、流速測定管、廢液收集桶三者可同時置於 121 ℃，1 大氣壓下滅 菌50 分鐘或各別滅菌，而培養液供應桶則需 121 ℃，1 大氣壓下滅菌 100 分鐘。滅菌後便可以將此四部分所有接頭相連接，所有操作過程皆需快速 完成並過火滅菌以避免污染。 (3) 接菌前的準備及接菌 由於安裝於蠕動幫浦之矽膠管長度可能會有些許的不同，所以每次接 菌前須先利用流速測定管測定本次蠕動幫浦的流速，以作為往後調控培養 液之流動速率的依據。且在接菌之前需先啟動連續式培養系統，將槽體內 的一次水置換成培養液，本實驗的通氣量是利用氣體流量計來控制，而氣 體流量計在使用之前需用排水集氣法校正。另外欲進行連續式培養的菌株 需先培養在5 ml 的 LB 培養液，於 37 ℃恆溫振盪培養至對數期後以作為 接菌用。接菌時利用10 ml 注射針筒在無菌操作台取出活化之菌液並注入 醱酵槽內，接菌完成後，先以批式培養使菌體生長達對數期後，再調整蠕 動幫浦的流速以控制生長速率進行連續式培養。
(4) 連續式培養的生長條件
本實驗是利用BIOFLO III (NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC CO.) 醱
酵槽控制器進行生長條件的控制。實驗用槽體體積為1.5 L，培養液在醱酵
槽內體積 (working volume) 為 1 L，培養溫度為 37 ℃，攪拌速率為 500 rpm，通氣量控制在 2 L/min。調整蠕動幫浦控制培養液之流動速率以進行
不同生速率之連續式培養。每次變換培養液流動速率時，至少須相隔6 個
反應槽的滯留時間 (reactor residence time, τ)，以確定菌體的生長到達新的 穩定期 (steady state)，當菌體生長達穩定狀態後才可以收集樣本。 3.2.2 β-galactosidase 酵素活性分析 1. 藥品製備 (1) 1 M NaPO4 (pH 7.0) buffer 分別配製1 M 的 NaH2PO4•H2O (pH 4.2) 及 1 M Na2HPO4•7H2O (pH 9.0) 再將二者混合調至pH 7.0 (此緩衝液不需以高溫高壓滅菌)。 (2) PM2 緩衝液之製備 取無菌水500 ml (去離子水以高溫高壓滅菌過)，加入 100 ml 的 1 M NaPO4 (pH 7.0) 緩衝液，1 ml 1 M 的 MgSO4和1 ml 0.2 M MnSO4，再以無 菌水加到總體積為1 L 即可。
(3) ONPG (o-nitrophenyl-β-d-galactopyraniside) 之配製 取ONPG 0.4 g 溶於 100 ml 0.25 M 的 NaPO4 (pH 7.0) 緩衝液中。因其 溶解性差，故可以於 60 ℃水浴槽內加熱 (不可高於此溫度否則 ONPG 會 被破壞)。一旦溶解後，立刻取出並以每 10 ml 分裝之。分裝後的 ONPG 放入 -20 ℃冰中保存。配置及使用時皆須避光。 (4) Na2CO3的製備 利用無菌水配製1 M Na2CO3。 2. 細胞內蛋白質濃度之測定 離心收集來的菌體加入 PM2 緩衝液，將細胞震盪混合均勻。PM2 緩 衝液的量可依其活性的高低而自行調整，一般約為收集菌液的 0.1 倍體積 即可。本實驗依其活性不同加入0.6∼1.5 ml 不等的 PM2 緩衝液使細胞懸 浮。測定細胞內蛋白質含量步驟如下：取100 µl 的細胞懸浮液加入 900 µl PM2 懸浮液 (即 10 倍稀釋)。利用光電比色計 (UV/VIS 911A 機型) 測定 其OD600吸光值，細胞內蛋白質總濃度可由公式計算得知： 蛋白質濃度 (mg/ml) = OD600 × 稀釋倍數 × 0.107 3. β-galactosidase 酵素反應 本實驗中酵素反應的測定取100 µl 細胞懸浮液至 900 µl PM2 緩衝液做 十倍稀釋後，再取100 µl 稀釋液加入 900 µl PM2 緩衝液 (稀釋倍數可依酵 素活性大小調整，但最後反應體積為1 ml)。緩衝液中可先加入 3.5 µl/ml
β-mercaptoethanol，50 µl chloroform 及 25 µl 0.1% SDS (sodium dodecyl sulfate)，震盪混和後置於 28 ℃水浴槽 10 分鐘。此過程是為了破壞細胞 膜而容易偵測到 β-galactosidase 的酵素活性。酵素活性反應從起始至終止 皆於 28 ℃水浴槽中進行，加入 0.25 ml ONPG 後即開始反應。注意加入 ONPG 後需震盪混合，並記錄反應時間。當反應至呈現淡黃色時，利用 2 ml 1 M 的 Na2CO3終止反應。反應時間和酵素含量及其活性有關，最理想的 反應時間在 15 分鐘至 2 小時之間 (OD420在0.3∼0.8 之間)，超過此範圍 必須考慮調整細胞懸浮液的稀釋倍數。終止反應後取1.5 ml 酵素呈色反應 液以 11000 rpm 離心 17 分鐘。儘量吸取上層之液體測定 OD420及 OD550 吸光值。經由公式計算即可得β-galactosidase 的酵素活性。 4. 酵性活性之計算 β-galactosidase 酵素比活性定義是：1 mg 的蛋白質在 28 ℃， 1 分鐘 內水解1 nmole ONPG 為 1 unit (即 Miller unit)。其比活性計算公式為： specific activity
(OD420 – OD550 × 1.75) × total assay volume =
time × volume cells × (mg/ml) protein × extinction coefficient
total assay volume：1 ml time：反應時間 (in min)
protein (mg/ml)：細胞懸浮液蛋白質濃度 extinction coefficient：0.0045
除了ONPG 被分解產生的 o-nitrophenol 可在 OD420下吸光外，菌體本 身亦會吸光。大腸桿菌於OD420及OD550的關係式為：OD420 = 1.75 × OD550。 而o-nitrophenol 在 OD550下不吸光，故可利用此關係式來校正細胞在OD420 吸光值所造成的效應。另外extinction coefficient 是在 28 ℃，1 分鐘，1 unit β-galactosidase 酵素水解 ONPG 所測得 OD420吸光值為0.0045，亦即每 1 nm 的ONPG 水解相對的 OD420吸光值為0.0045。 3.2.3 大腸桿菌總 RNA 之萃取 收集 10 ml 菌液（OD600 = 0.4 ~ 0.45）於離心管內，迅速置於 -80 ℃ 的 酒精桶內，進行冰浴 10 秒鐘後迅速插於冰上，立刻以 6,000 rpm 在 4 ℃ 下，離心 10 分鐘。之後去除上清液，以 0.75 ml TRI reagent 將菌塊震盪 溶解，將溶液轉置於微量離心管內，於 65 ℃ 水浴槽內水浴 10 分鐘 (每 隔 2.5 分鐘取出，以手搖方式溫和混合均勻，重複 4 次)，然後在室溫下 加入 150 µl chloroform，以溫和手搖方式充份混合均勻，於室溫下靜置15 分鐘後，在 4 ℃ 下以 12,000 rpm，離心 12 分鐘後，去除下層液，將上 清液吸取到另一乾淨離心管內，加入 400 µl 2-propanol 及 40 µl 3 M sodium acetate（pH 5.2），置於 -20 ℃ 冰箱內 30 分鐘，此目的在於沉澱 RNA。然後於 4 ℃， 12,000 rpm，離心 12 分鐘，丟棄上清液後留下 RNA 沉澱物，加入 75% 乙醇 1.0 ml 清洗一次，再於 4 ℃， 12,000 rpm 離 心 10 分鐘，完全吸乾上清液後，將沉澱之 RNA，進行真空乾燥。待 RNA
完全乾燥後 (約需 10 分鐘)，加入適量的 DEPC 處理過的二此逆滲透水 將其溶解，測定 OD260 及 OD280 吸光值，確定 RNA 的濃度及純度。剩 餘之 RNA 樣本則須立刻置於 -80 ℃ 冰箱內保存。 3.2.4 mRNA 穩定性測定方法 收集100 ml ( OD600 = 0.4 ~ 0.45 ) 菌液，將菌液置於 37 ℃ 返復式循環 水浴槽內持續震盪培養，先取 10 ml 菌液做為第 0 點的樣品，之後立即 將濃度為 0.1g/ml 的 rifampicin 溶液取 250 µl 加入剩餘菌液中混合均勻 後，依據不同時間點分別收取樣品。每次取完後立刻置於 -80 ℃ 酒精桶 內冰浴 10 秒鐘，迅速插於冰上。其他 RNA 萃取步驟請參照 3.2.3 大腸 桿菌總 RNA 之萃取。
3.2.5 北方墨點分析法（Northern blotting analysis）
1. RNA 電泳分析
(1) 1.2% 洋菜膠（agarose gel）配製
取洋菜膠0.55 g 加入 29.4 ml DEPC 處理過後的水，加熱溶解並 混合均勻，待稍冷卻後即加入 5 倍濃度的 formaldehyde gel running buffer 9 ml 及甲醛（formaldehyde）7.4 ml，再次混和均勻並製成膠體。
(2) 樣品前處理
取出下列試劑分別加入微量離心管內並充份混合均勻：8 µg RNA，2 µl 之 5 倍濃度的 formaldehyde gel running buffer，3.5 µl 的 formadehyde (37%)，10 µl 的 formamid。 (3) 樣品變性反應處理(denature) 及電泳 將樣本置於 65 ℃ 水浴 10 分鐘後，取出插至冰上，加入 5 µl 染 劑 (6X RNA dye)，充份混合均勻後於室溫下， 60 伏特電壓進行 RNA 電泳 2.5 小時。 (4) 膠體染色 電泳完成後，將膠體浸泡於 150 ml EtBr 染液（0.5 µg/ml EtBr 溶於 0.1 M ammonium acetate）染色 8 分鐘，接著以 DEPC 處理過 的水進行退染 3 小時後，利用 UV 燈箱即可觀察到 rRNA，之後進 行照相。 2. RNA 轉漬 此轉漬原理係利用厚濾紙產生的毛細現象，引導 20X SSC 溶液 向 上 流 動 ， 進 而 帶 動 膠 體 中 的 RNA 脫 離 膠 體 ， 吸 附 於 nylon membrane。 剪裁與膠體面積相同之 8 × 7 cm 的 nylon membrane，轉漬前先 將與膠體面積相同的 nylon membrane，以 20 X SSC 溶液浸溼。取一 方形容器，其內放置一個 2 ~ 4 cm 高的方形塑膠盒，此塑膠盒表面需 平整，且比膠體長些和寬些。倒入適量的 20X SSC 溶液於方形容器 內，於塑膠盒表面鋪上一張 7 ×22 cm 長方形的 whatman 3MM 濾 紙，濾紙二端需浸到 20 X SSC 溶液。然後濾紙上層再鋪一張 8 × 7
cm 的 whatman 3MM 濾紙，此濾紙長寬與膠體相同，並用 20 X SSC 溶液使其潤濕。將膠體反轉（原來電泳時朝下的一面朝上），置於已 經溼潤的濾紙上，接著把濕潤的 nylon membrane 置於膠體上，再放 一張 8 × 7 cm 的 Whatman 3MM 濾紙於 nylon membrane 上方，在 濾紙、膠體、 nylon membrane 與濾紙相互之間必須把氣泡完全趕出， 避免 RNA 轉漬不完全。最後放一疊 6 ~ 7 cm 高的厚濾紙 (長寬約為 8 × 7 cm)在 Whatman 3MM 濾紙上，厚濾紙最上層置一塑膠板並用 500 公克重的血清瓶壓住。 轉漬過程進行 12 ~ 16 小時後，取出 nylon membrane，置於核酸 快速固定儀中，利用 UV 光（254 nm）照射 2 分鐘使 RNA 固定於 nylon membrane 上以進行雜交反應。 3. 核酸探針製備
本實驗我們利用聚合酶連鎖反應（Polymerase Chain Reaction； PCR）來擴增一段序列上含有 DIG-11-dUTP ( Roche PCR DIG Probe Synthesis Kit Cat. No. 1 636 090 ) 的 DNA，以此段 DNA 來做為核酸 探針，其做法敘述如下：將 63 µl 滅菌二次逆滲透水，10 µl 10X PCR reaction buffer，10 µl DIG-labeling mixture， 8 µl (25 ng/µl) DNA template，4 µl (20 µM ) primer 1 與 primer 2，1 µl 5 units Taq DNA polymerase，依序放入 200 µl 的微量離心管內（eppendorff tube），最 終体積為 100 µl。混合均勻後放入聚合酶溫度循環機進行反應。 本實驗 rne 核酸探針的 rne-1 及 rne-2 的序列如下:
rne-1： 5’-CCTCTGGCAAAGTCTGGAT - 3’ (19 mer) rne-2： 5’-CTGCGGCACCTTTACCTT- 3’ (18 mer)
PCR 設定溫度如下
將上述微量離心管內混合液先於 94 ℃下，反應 5 分鐘，分開所 有 DNA 模板，再進行以下之溫度循環步驟：
1. 94 ℃，35 秒鐘：使兩股 DNA 模板分開。 2. 58 ℃，35 秒鐘： primer 與 DNA 模板結合。
3. 72 ℃，35 秒鐘： DNA polymerase 合成新股 DNA。
重覆上列溫度循環 20 次，之後進行 72 ℃，反應10 分鐘，使 最後一次未合成完全的 PCR 產物合成完全，最終保存溫度設定為 4 ℃。 rne 核酸探針的預期長度為 612 bp，但由於在 dUTP 上接有 DIG 的關係，在電泳膠上的位置會略高於 612 bp，約在 600 bp ~ 700 bp 之間。
本實驗 rpsO 核酸探針的 rpsO-1 及 rpsO -2 的序列如下: rpsO-1： 5’-CGGCGTCCTTTCATTC- 3’(16 mer) rpsO -2： 5’-GCTGCCGTCAGCTTG- 3’(16 mer)
PCR 設定溫度如下
將上述微量離心管內混合液先於 94 ℃下，反應 5 分鐘，分開所 有DNA 模板，再進行以下之溫度循環步驟：
1. 94 ℃，30 秒鐘：使兩股 DNA 模板分開。 2. 53.5 ℃，20 秒鐘： primer 與 DNA 模板結合。
3. 72 ℃，30 秒鐘： DNA polymerase 合成新股 DNA。 重覆上列溫度循環 20 次，之後進行 72 ℃，反應 10 分鐘，使 最後一次未合成完全的 PCR 產物合成完全，最終保存溫度設定為 4 ℃。 rpsO 核酸探針的預期長度為 366 bp，但由於在 dUTP 上接有 DIG 的關係，在電泳膠上的位置會略高於 366 bp，約在 400 bp ~ 500 bp 之間。
本實驗所採用的是 viogen 公司生產之 Gel Extraction Kit 來純 化 PCR 產物。其做法敘述如下：將 PCR 產物自電泳膠上切下，放 入微量離心管內，並加入 0.5 ml 的 GEX buffer 在 65 ℃ 下加熱溶 解，吸取已溶解之 PCR 產物混和液至 spin column 內，用 13,000 rpm 之速度離心 30 秒，再將 0.5 ml wash I buffer 加至 spin column 內 沖洗，在 13,000 rpm 下，離心 30 秒，再以 0.7 ml wash II buffer 沖 洗之，然後也是在 13,000 rpm 下，離心 30 秒，最後將 spin column 放到另一個 1.5 ml 微量離心管內，加入 30 µl 滅菌二次逆滲透水， 於室溫下靜置 1 分鐘，最終以 13,000 rpm，離心 2 分鐘的方式沖洗 出所需的核酸探針 (PCR 產物)，定量後儲存於 -20 ℃ 冰箱備用。 4. 雜交反應（hybridization）
將 RNA 固定在上面的 nylon membrane 放入玻璃雜交管內，加 入15 ml 的 hybridization buffer，於 48 ℃ 核酸雜交烘箱旋轉反應 30 分鐘，轉速設定為 30 rpm ，此過程稱為 Pre-hybridization。再加入 150
ng 的核酸探針（核酸探針需先以 100 ℃，煮沸 10 分鐘後，置於冰 上10分鐘），繼續進行 48 ℃的核酸雜交烘箱旋轉反應，反應時間為 14 ~ 18 小時。反應結束後將 nylon membrane 自玻璃雜交管取出，平放 於微免疫偵測反應盒內，加入含 2X SSC， 0.1% SDS 的洗滌液 50 ml，在室溫下以平面震盪的方式清洗 5 分鐘，震盪速度為 25 rpm， 共洗二次；再用含 0.1X SSC， 0.1% SDS 的洗滌液 50 ml 清洗 15 分鐘，共洗三次。 5. 免疫偵測（immunological detection）
本實驗所採用的是 Roche 公司所生產的 DIG Wash and Block Buffer Set (Cat. No. 1 585 762) ，內含有 10 倍濃度之 buffer 1、2、3 和 4 。將 nylon membrane 用洗滌液清洗完畢後，用 30 ml 的 1X buffer
1 清洗 5 分鐘，倒掉 1X buffer 1 後， 加入 30 ml 的 1X buffer 2 與
1X buffer 3 混和液，於室溫下，以平面震盪的方式搖動 40 分鐘，震 盪 速 率 為 25 rpm 。 目 的 在 於 使 buffer 3 中 的 Brovine Serium Albumin (BSA) 均 勻 佈 滿 整 張 nylon membrane 表 面 ， 避 免 anti-DIG-AP 直接與 nylon membran 結合，此舉可以減少大量非專一 性之鍵結（non-specific binding），這個步驟稱為 blocking 。反應結束 後將 3 µl 的 anti-DIG-AP ( Roche Cat. No. 1 093 274 ) 加入 30ml 的 1X buffer 2 與 1X buffer 3 混和液，於室溫下搖動 40 分鐘，使 anti-DIG-AP 與核酸探針上的 DIG 形成專一性之鍵結。之後於室溫 下，用 30 ml 的 1X buffer 1 清洗兩次，每次 15 分鐘。倒掉 1X buffer 1 後，加入 15 ml 的 1X buffer 4 清洗 5 分鐘，之後把 nylon membrane 平放於投影片夾層內，將 10 µl 的 CSPD® 溶於 1 ml 的 1X buffer 4 內，均勻灑佈於 membrane 上，蓋上投影片，立刻置於底
片夾內，於室溫下進行避光反應 15 分鐘。反應後於暗房內以 Kodak XAR-5 X 光底片進行壓片，感光適當時間後沖洗底片。
6. 訊號分析
利用掃描器（Microteck）將底片掃成 .tif 圖檔，存進電腦中，再 利用Zero-Dscan Quantitative Gel and Blot Analysis (Scannalytics) 軟體 偵測每一個雜交訊號（hybridization signal）的強度，並將所測得的數 值與不同的採樣時間點做一關係圖，利用線性回歸分析在不同時間點 所得的雜交訊號強度，可算得 mRNA 的半衰期。
肆、
結果
4.1 不同生長期對 rne-lacZ 表現之影響
首先我們將含有rne-lacZ operon fusion 的大腸桿菌培養於含有 40 mM
葡萄糖的基礎培養液下進行批次培養，於不同時間點收取菌液測 OD600吸
光值，並離心菌液測其 β-galactosidase 活性，分別繪製成生長曲線與 β-galactosidase 活性雙曲線圖 (圖一)。由圖一我們發現， rne-lacZ 表現在 不同生長時間點皆出現趨近於3500 miller uint 左右，代表 rne 基因於不同 生長時期，分別為遲滯期 (lag phase) 、對數生長期 (exponential growth phase) 與靜止期 (stationary phase) 表現都相差不大。
4.2 碳源對 rne 基因表現之影響 4.2.1 不同碳源對 rne mRNA 表現量影響 將大腸桿菌分別培養於含有40 mM 葡萄糖或醋酸 (acetate) 的基礎培 養液中，當菌體生長至對數生長期前期，分別抽取總RNA 後，以 rne 探針 進行北方墨點分析。由圖二 A 得知，將大腸桿菌培養於以葡萄糖為碳源的 培養基中，其 rne 基因之表現量明顯比培養於醋酸時高，經由程式定量分 析後發現在葡萄糖之表現量比醋酸高了約六倍 (圖二 B)。
4.2.2 不同碳源對 rne 基因後轉錄層次(post-transcription)的影響
接著我們進行rne mRNA 的穩定性測試，當菌生長達對數生長期前期
時，加入rafampicin，於不同時間點抽取總 RNA 之後，以 rne 探針進行北
方墨點分析。結果發現當大腸桿菌培養於葡萄糖時，rne mRNA 在加入
rifampicin 後的第 3 分鐘仍可看見訊號，而培養於醋酸時，rne mRNA 在加 入rafapaincin 後的第 1 分鐘後訊號即消失（圖三）。
4.2.3 不同碳源對 RNase E 活性影響
在RNase E 的活性測試上，我們以 RNase E 的受質 rpsO mRNA 之穩 定性作為測試 (Le Derout et al., 2002)。同樣當菌生長達對數生長期前期， 加入 rafampicin，於不同時間點抽取總 RNA 後，改以 rpsO 探針進行北方 墨點分析，接著利用程式定量分析與計算半衰期。發現以葡萄糖為碳源時， rpsO mRNA 的半衰期為 2.3 分鐘，而以醋酸為碳源時，rpsO mRNA 的半 衰期則為1.8 分鐘（表二、圖四）。
4.2.4 葡萄糖對 rne-lacZ 的影響
為瞭解有氧情況下葡萄糖對 rne 基因表現之影響，將具有 rne-lacZ operon fusion 的大腸桿菌分別培養於 LB 培養液及含有 40 mM 葡萄糖的 LB
培養液中，當菌生長到對數生長期前期，將菌液離心，測其β-galactosidase 活性，結果發現培養於LB 培養液之 rne-lacZ 的表現量約為 4500 miller uint 左右，但在加入葡萄糖後 rne-lacZ 的表現量則下降 40% 左右，代表 rne 基因有受葡萄糖抑制的現象(catabolic repression) (圖五)，此現象指微生物 處於兩種不同的碳源環境下會先分解較易利用的受質當作能源，直到此受 質耗盡後再利用另一受質的情形。若是大腸桿菌優先利用葡萄糖作為能量 來源，此時乳糖酵素等相關基因被抑制不表現，這種 catabolic repression 又被稱為葡萄糖效應(glucose effect)。
研究發現catabolic repression 反應與細胞內 cAMP 濃度以及 CRP 蛋白 質有密切相關，cAMP 是經由 adenylate cyclase (cya) 催化 ATP 所形成，大
腸桿菌中可被cAMP 調控的基因多達數十個，其調控的方式是 cAMP 與其
調節蛋白質CRP (cAMP receptor protein) 形成複合物，再藉由此複合物來 調控不同基因的表現 (Busby and Ebright, 1999)。因此我們使用 ∆cya 突變 株及 ∆crp 突變株來探討 rne 基因出現之葡萄糖效應是否是受到 cAMP 和 CRP 所調控。將具有 rne-lacZ operon fusion 的 ∆cya 突變株及 ∆crp 突變株 大腸桿菌分別培養於LB 培養液及含有 40 mM 葡萄糖的 LB 培養液中。結 果顯示，∆cya 突變株葡萄糖效應消失，rne 基因在 LB 培養液中不論有無 加入葡萄糖其表現量相去不遠，而∆crp 突變株亦具有相同的情形 (圖五)。 此外也發現 ∆cya 突變株與 ∆crp 突變株 rne-lacZ 表現量皆會減少 20% 左 右。 接著進行無氧情況下葡萄糖對 rne 基因表現的影響，將具有 rne-lacZ operon fusion 的大腸桿菌分別培養於 LB 培養液厭氧管與含有 40 mM 葡萄 糖的LB 培養液厭氧管中，分別偵測其 β-galactosidase 活性，結果發現 rne 基因在無氧狀態下也具有葡萄糖效應，培養含有40 mM 葡萄糖於厭氧 LB 培養液之rne-lacZ 的表現量下降了約 30% (圖六)。我們也使用 ∆cya 突變株
及∆crp 突變株，來探討在無氧生長環境下，rne 基因出現之葡萄糖效應是 否也是受控於cAMP 和 CRP。將具有 rne-lacZ operon fusion 的大腸桿菌分 別培養於LB 培養液，及含有 40 mM 葡萄糖的 LB 培養液厭氧管中。結果 在∆cya 突變株和 ∆crp 突變株中發現葡萄糖效應消失，結果與有氧狀態下 的現象相近。但在無氧中 ∆crp 突變株並不會造成 rne-lacZ 表現下降 (圖 六)。 4.3 批次培養下氧氣對 rne 基因的影響 大腸桿菌為一兼性厭氧細菌 (facultative anaerobe)，可因環境中氧氣含 量不同而行使不同的代謝途徑。在有氧環境下，大腸桿菌會以氧作為電子 傳 遞 鏈 中 最 終 的 電 子 接 受 者 。 在 無 氧 環 境 下 ， 細 菌 會 進 行 醱 酵 作 用 (fermentation) 或利用環境中不同受質 (substrate) 當作電子接受者以進行 厭氧呼吸作用。 大腸桿菌分別培養於含有 40 mM 葡萄糖的基礎培養液與厭氧管下進 行批次培養，當細菌生長達對數生長期之前期，抽取總 RNA 後，以 rne 探針進行北方墨點分析。結果發現，在無氧狀態下rne mRNA 的表現量比 在有氧狀態下提高許多，（圖七、 (A)）。經掃描程式定量分析後，得知無 氧情形下rne mRNA 的表現量為有氧的 2.7 倍(圖七、 (B))。 4.4 生長速率對 rne 基因表現的影響
將大腸桿菌以2.25 mM 葡萄糖進行連續式培養，在有氧狀態下，於菌 體生長速率達µ 達 0.24 h-1及1.20 h-1時收取菌液，之後分別抽取不同生長
速率的菌液之總 RNA 以 rne 探針進行北分墨點分析。結果發現，有氧狀
態下rne RNA 表現量在高生長速率時略高於低生長速率，高了 50% 左右。 在無氧狀態下，亦於菌體生長速率µ 為 0.24 h-1及1.2 h-1時收取菌液，結果 顯示 rne RNA 表現量在高生長速率時為低生長速率的 2.5 倍 (圖八、 (A) (B))。
接著進行RNase E 之活性測試，我們以 RNase E 的受質 rpsO mRNA 的 穩定性作為測試，發現有氧情況下，生長速率µ 為 0.24 h-1時，rpsO mRNA 的半衰期為2.3 分鐘，而生長速率 µ 為 1.2 h-1時，rpsO mRNA 的半衰期為 3.8 分鐘（表三、圖九）。 無氧情況下時，生長速率µ 為 0.24 h-1時，rpsO mRNA 的半衰期為 1.2 分鐘，而生長速率µ 為 1.2 h-1時，rpsO mRNA 的半衰期為 1.8 分鐘 （表 三、圖十）。 4.5 HimA 蛋白對 rne 表現之影響
已知 integration host factor (IHF)會於有氧無氧環境下調控某些基因 (Darie and Gunsalus, 1994)，因此對為暸解 IHF，是否會在有氧或無氧下進 行調控rne 基因的表現，我們以大腸桿菌 IHF α 次單元體 Him A 蛋白的基 因突變株來進行實驗。IHF 除了可調控 DNA 複製外，還會影響許多基因 表現 (Mengeritsky et al., 1993)。將含大腸桿菌中 himA 基因突變株，以 40 mM 葡萄糖為碳源，分別在有氧及無氧的環境下，以 rne 探針進行北方墨
下較高。而在有氧環境下，himA 突變株 rne mRNA 的表現量比野生株低， 下降約30%。在無氧環境時，himA 基因突變之大腸桿菌 rne 基因之表現量 則反而上升 60% 左右（圖十四），因此顯示 HimA 蛋白 (即 IHF) 於有氧 狀態實為一轉錄活化子 (activator) 可幫助 rne 基因的表現，但在無氧環境 下則為抑制子 (repressor)。 4.6 饑餓對 rne 表現之影響 當細菌體內胺基酸、碳源及能量不足時，皆會使 (p)ppGpp 濃度上升， 而使菌體內大分子物質合成量下降並進而影響基因表現，此反應稱為迫切 反應 (stringent responses ) (Pao and Dyess, 1981)。首先我們將菌液培養達對
數生長期，接著進行饑餓反應。結果發現，於進行饑餓反應後 rne 基因表 現量比起正常生長顯著降低下降了90% 左右 (圖十二、 (A) (B))。relA 與 spoT 可產生 (p)ppGpp，為大腸桿菌於貧脊環境中調控生理表現的重要機 制。過去文獻中對於 (p)ppGpp 是否影響 ribonuclease 的活性或表現量並無 太多的研究，為了暸解 rne 於饑餓反應後明顯下降的情形是否為受 (p)ppGpp 的影響，我們分別以 relA 及 spoT 突變株以及其雙突變株，進行 正常生長和饑餓反應後rne 表現量之偵測。結果指出，於正常培養下，relA 突變後rne 表現量與野生株比較，並沒有明顯改變，而 spoT 突變株及雙突 變株亦為相同情形 (圖十三，圖十四)。而在進行饑餓反應後，relA 突變株 之rne 表現量比野生株進行饑餓反應相差不大，但值得注意的是 spoT 突變 株與雙突變株的 rne 表現量則會出現回復情形。
伍、討論
為適應瞬息萬變的外在環境以求生存，大腸桿菌可快速地調控基因表 現，目前已知大部分基因表現是藉由改變轉錄層次 (transcription level) 來 達成 (Barlow et al., 1998)。由過去文獻發現，當環境改變時，大腸桿菌體 內 RNase E 濃度及活性可能會隨之改變，為了瞭解不同環境因子如何影響 RNase E，藉由偵測 β-galactosidase 的活性、北方墨點分析以及 RNase E 受 質rpsO mRNA 半衰期，來推測不同生長環境下 rne 基因於轉錄層次的表現 情形與酵素活性。 5.1 批次培養下，不同生長時期對 rne-lacZ 表現之影響 在批次培養下， rne-lacZ 的表現量於不同生長時期皆具有高度且穩定 的表現，由此我們可得知，rne 基因表現對菌體生長的每個時期而言均為 重要且必須，因為每個時期都需要不同的蛋白質表現。無須再被轉譯 mRNA 則需要被降解，以免製造出這個生長時期無需的蛋白質，浪費細胞 能量。RNase E 是目前認為降解 mRNA 最主要關鍵的酵素之一(Apirion, 1978; Ono and Kuwano, 1979; Mudd et al., 1990; Babitzke and Kushner, 1991; Melefors and von Gabain, 1991; Taraseviciene et al., 1991)，因此由此推測每 個生長時期皆要有 rne 基因的高度表現，更證明若無 rne 的基因表現，對 大腸桿菌而言為致死性突變 (Apirion, 1978; Ono and Kuwano, 1979) 。
