Commercial desalt deep sea water
四. 姬松茸多醣體之生物活性測定分析
4.1 菌絲體
從發酵實驗中，將取樣之發酵液經過過濾，分離出菌絲體與菌液兩部分，菌絲體 將其秤等重秤等重分裝於小試管中以離心機以 5000 rpm 離心 20 min 3 次後置 於烘乾箱烘乾後取出稱重。(圖 18)
圖 18 菌絲體待烘乾
4.2 胞外多醣體
1.從實驗取樣(2 ml)之菌液將其秤等重分裝於小試管中以離心機以 5000 rpm 離 心 30 min 2-3 次後取澄清的上清菌液置另一試管。
2.加 2 倍的酒精置冰箱 18°C 冰存 24 小時(隔夜)。
3.第二天再以 4000 rpm 離心 10 min 後，去上清液留多醣體作為測試的樣品。
4.加 10 倍的 RO 水置於大燒杯加熱至 80 °C 溶解均勻。
5.運用光譜儀測吸光值(OD)-- 總醣含量測定(苯酚硫酸法)
ml H2SO4 溶液(95~97 %)，設定波長490 nm 測試吸光值。
五. 抗腫瘤作用
近年來對真菌多醣體的抗腫瘤機制研究證實，真菌多醣體對腫瘤細胞不具有 細胞毒作用，主要是通過提高機體免疫力而間接發揮抗腫瘤效果；當然也有通過 抑制腫瘤細胞增生，進而促進腫瘤細胞凋亡的作用。國內外學者通過實驗研究證 明，從姬松茸子實體和菌絲體中提取的多醣體，具有增強機體免疫力、抑制腫瘤 細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡等明顯的抗腫瘤作用。
本實驗為了解抗腫瘤食物、藥物與新藥開發，除了在癌細胞株的離體實驗 (in vitro experiment)中，獲得抗癌活性的證實，與詳細抗癌機制的探討外，並利 用摘除小鼠脾臟 50~60 %，藉以瞭解小鼠欠缺完整製造 B 細胞器官後，製造抗體 (免疫球蛋白 Ig G)的功能、數量，摘除小鼠部分脾臟再以人工餵食姬松茸 4 週，
促使小鼠能否加速恢復製造抗體能力，因此，比較摘除脾臟與正常小鼠同時免疫 注射飯匙倩蛇毒(Naja naja atra)，測試產生抗體效價(Potency)，以了解姬松 茸是否真正對動物免疫系統有強化功能。其次在建立腫瘤治療動物模式及其動物 的活體實驗 (in vivo experiment)。抗腫瘤食物如果能在腫瘤離體實驗中，證
與飼養方式比其他動物容易，而且小鼠平均壽命約 2~3 年，相對其他動物平均壽 命並不長。因此，利用小鼠做為動物實驗模式，便可提高研究的時效性，且研究 結果也較為吻合人類治療癌症的模式。
異種移植 (Xenograft Model) 是指採用移植到動物體內的癌細胞而不是同種動 物所產生的，例如將人類的肺腺癌細胞株(A549)，皮下注射(subcutaneous injection)方式注射入裸鼠(Nude mice BALB/c nu/nu)的皮下組織內，便能成功 地誘發裸鼠皮下腫瘤增生。利用異種移植的模式，是人類的癌細胞可在免疫功能 缺乏的小鼠(SCID Mice)中，產生腫瘤生長。
口服姬松茸懸浮液在小鼠體內生化作用，為許多期刊報告提到，故本實驗利 用小鼠異種移植，皮下接種肺腺癌腫瘤細胞(A549)以皮下注射，透過小鼠體內抗 腫瘤機制，了解姬松茸多醣體是否誘導動物體的自身免疫功能，具有抑制細胞分 裂和調節免疫系統反應的作用而抑制腫瘤生長，對於長期服用之人體，是否達到 抑制腫瘤生長為目的。
5.1 動物實驗方法與麻醉藥品配製
(1) Tribromoethanol( Avertin)配製方法
避光攪拌 2 小時，直到完全溶解，用 0.2 um 無菌過濾膜無菌過濾，分裝玻璃瓶，
封瓶口後，用鋁箔紙密封。保存於 4 ℃冰箱，有效期 6 個月。
(2) Sodium pentobarbital 配製方法
準備滅菌量筒、50 ml 注射筒 500 ml ddH2O、玻璃瓶、橡皮塞、鋁蓋以 121 ℃ 20 分鐘滅菌，置無菌操作箱，秤量 5000 mg Sodium pentobarbital 放入玻璃瓶，
取 ddH2O 100 ml 放入 500 ml 血清瓶，原液為 50 mg/ml，充分震盪約 5 分鐘待完 全溶解，無菌過濾濾膜(0.2 um)過濾，裝填 sodium Pentobarbital 至玻璃瓶，
無菌操作蓋上橡皮塞、鋁蓋，封口鉗夾緊鋁蓋，放置 4℃冰箱。
5.2 動物實驗步驟：
第一群摘取脾臟與正常小鼠免疫注射飯匙倩蛇毒各 10 隻，首先將 4 週齡 小鼠脾臟摘除 50~60 % 10 隻。
小鼠脾臟摘除手術步驟說明如下:
A. 手術工具於術前均要消毒完成，特別縫合用針、線均要用消毒水浸泡 2 hr，
以減少手術發炎發膿。
C.麻醉完成，從第一刀切開至縫合終了一隻小鼠手術時間約 5 分鐘，小鼠保持
血管結紮使用 No1 縫合線（約 10 cm）2 條血管同時結紮。
J.胰臟放入腹腔恢復原有位置，用無勾鑷子送入腹腔調整臟器位置。
腹膜使用 No3 縫合針連續縫合 2~3 針，間距 1.5~2mm 縫合傷口周圍使用 3 % 碘酒棉消毒。
K.皮膚切口縫合後使用簡式縫合貼紙（透氣膠帶）貼即可。
觀察記錄小鼠生長體重變化，肉眼確認小鼠恢復健康，再準備蛇毒免疫小鼠，
由於飯匙倩蛇毒( Naja naja atra)毒性甚強，必須先減毒測試最低致死量 (Minimum lethal dose)，降低毒性，減毒前 MLD 為
0.006~0.014mg/mice(12~14gm)。
5.3 小鼠免疫方法及抗原(蛋白質)與佐劑之混合(操作如圖 19):
1.基礎免疫：第 1~3 劑 。
2.追加免疫：第 4 劑以後。
表 4 飯匙倩蛇毒(Naja naja atra)免疫小鼠劑量表
免疫週期 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ Ⅸ
免疫小鼠方法：
(1)抗原用戊乙醯醛(glutaraldehyde GA) 2.5 % 進行 24 hr 減毒處理，可降低 毒性 99.2%。
(2)第一針取 100 µl Ag+100 µl CFA 乳化後進行 S.C.注射(打背部，分佈 10 個 點以上)。
(3)第二針取 100 µl Ag+100 µl IFA 乳化後進行 S.C.注射(打背部，分佈 10 個 點以上)。
(4)注射前必須確認抗原乳化是否完全，以確保抗原被吸附慢慢釋放。
(5)D60~D90↑都可進行 prebleeding。
5.4 蛇毒無毒化與佐劑乳化混合製備
免疫前 24 小時，取凍結乾燥飯匙倩蛇毒秤量放入玻璃瓶，每隻小鼠劑量依
循如（表 4 飯匙倩蛇毒免疫小鼠劑量表），加入 PBS(pH6.8 M/10 Phosphate Buffered
Saline2%) 4.5 ml，待完全溶解後，再加入稀釋 10 倍戊二醛（Glutardialdehyde sol.25 %） 0.5 ml，放置 4 ℃ 24 小時後，可減毒 99.2 %，再將抗原與佐劑乳 化。 取 1 ml 玻璃注射筒，裝置 26 號針頭吸取 PBS 0.1 ml 潤濕玻璃注射筒後，
將三通管開關轉向上方，排除注射筒內空氣再將三通管開關轉向橫向，確認 玻璃注射筒與三通管接頭鎖緊。含抗原之玻璃注射筒成垂直狀，而含佐劑之玻璃 注射筒呈水平狀，緩緩將佐劑推入抗原中，使抗原與佐劑混於一支注射筒，使佐 劑浮於注射筒之上。
將含有抗原與佐劑之注射筒，漸進地推回另一邊注射筒內，通過三通管擠壓，
達到抗原與佐劑混合效果(water-in-oil)。抗原乳化時間約 10~15 分鐘，且推送 注射筒感覺力道漸沉，即可測試抗原均乳化至黏稠乳狀，放置冰桶上，靜置 20~30 分鐘，如抗原和佐劑有油水分離成兩層，需再重新乳化。判定乳化是否完全，可 滴一滴乳化完成之抗原於水面上，乳化完成之抗原不會擴散；或將玻璃注射筒之 推桿用力拉向一邊，乳化完成之抗原會產生凝聚力，不易散開，在注射筒內會留 有空隙。
5.5 免疫注射法：
第一劑使用 Complete Freund's Adjuvant (CFA)乳化，以 S.C.注射方式注射小 鼠皮下約 15~20 點，施打結束後需觀察小鼠成長健康狀態，第二劑後使用 Incomplete Freund's Adjuvant (IFA)佐劑；最後一劑不加佐劑，直接抽取抗原
圖 19 小鼠免疫注射及抗原乳化
5.5.1.試血：
免疫至第 D60~90 天均可抽取少量小鼠血液(操作如表 4、圖 20)，置於微量 試管，室溫靜置 24 hr，分離血清，使用桌上型離心機 Beckman ，以 2500 rpm 20 分鐘、吸取上層血清測試抗體力價(Titer)，剩餘血清密封貯藏於 4 ℃冰箱備 用。
圖 20 小鼠採血
5.5.2 效價測試(Potency test)：
採用酵素連結免疫吸著劑分析法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,：ELISA) 主要利用抗原和抗體高親和性與專一性；本實驗使用 96 槽微量滴定盤(96-well microtitration plate，簡稱 ELISA 盤)，取專用 ELISA 專用光度計(ELISA reader) 測得每一樣品的呈色吸光值，藉以判讀抗體濃度。
5.6 ELISA 使用藥劑
1. coating buffer：秤取 NaHCO3 0.84 g，加 ddH2O 80 ml 溶解，再加 ddH2O 補至 100 ml，即為 0.1 M NaHCO3。
2. 1 X PBS
NaCl 80.1 g
Na2HPO4 6.1 g
KCl 2.0 g
KH2PO4 2.0 g
加水 800 ml 溶解後，用 NaOH 修正 pH 7.0，再定量 1000 ml，成為 10 X PBS。
1X PBS 1000 ml
Tween-20 2 ml
將 10 倍 PBS 以 ddH2O 稀釋至 1 倍，再加入 0.2 % ( v/v)的 Tween-20 即成為 0.2
% PBST。
4.Blocking buffer：秤取 non-fat Milk(安佳)5 g 溶解於 100ml 1X PBST(0.2 %) 即為 5 % non-fat milk/PBST(0.2 %)。
5.Dilution buffer：秤取 non-fat Milk(安佳)2 g 溶解於 100ml1X PBST(0.2 %) non-fat milk/PBST(0.2 %)。
6.放置 4℃二次抗體：Goat anti mouse IgG (H+L)-Horseradish peroxidase adsorbed against Human serum proteins.
7.OPD 基質液：取 15ml substeate buffer +150 OPD +15µl H2O(體積比=1000:10:1)
8.Substrate buffer：
Citric acid 7.3 g
Na2HPO4 2 H2O 12.0 g
加 ddH2O 800 ml 溶解後再加 ddH2O 補至 1000 ml。
5.7 ELISA 作業步驟：
QC by ELISA (各重複三次)
1. Coating :GST protein 0.2 µg /100µl coating buffer/well,37 ℃,2 hr
( wash with 5% milk in 0.2% PBST, 1time)
2. Blocking:5% milk in 0.2% PBST, 200µl/well, RT 1hr.
( wash with 5% milk in 0.2% PBST, 2time)
3. 1stAb:Anti-GST1µg/µl, dilute 1000X,100µl/well, RT 1hrI
( wash with 5% milk in 0.2% PBST,5time)
4. 2stAb:Goat anti-mouse IgG-HRP,1mg/ml ,dilute 1000X, 5000X, 10000X,blank use 5% milk in 0.2% PBST,100 µl/well ,RT 1hr.
5. ( wash with 5% milk in 0.2% PBST,9time)
6. 呈色呈色劑 150 µl /well ,OPD 450 nm,15 min
7. 判讀 QC：在 blank OD 質＜0.08 的情況，以 OD 450 平均值作為評比，比值 須符合下列三個標準。
Dilute 5000XOD450/blank OD450 ≧9 ≧6 注射肺腺癌細胞前 14 天，開始胃管餵食(Intragastric administration)姬松茸 懸浮液(圖 21)；第 2 組注射 A549 細胞後，即開始餵食姬松茸懸浮液，並於腫瘤 增長至第 5 週(50x50mm↑花生粒大)以上切除腫瘤，繼續餵食姬松茸懸浮液；第 3 組腫瘤長出後開始餵食姬松茸懸浮液，切除腫瘤後不餵食姬松茸懸浮液，上列 實驗每週量測記錄腫瘤大小。 Nude mice 及 ICR 小鼠依照實驗動物飼養管理方 式飼養，使用美製 PMI 5013 滅菌飼料。
Crude protein not less than 20.5%。
Crude fat not less than 5%。
Crud fiber not more than 6%。
Ash not more than 8%。
飼養在潔淨飼養鼠籠( cage)，每週量測腫瘤生長尺寸(size)1 次(操作如圖 22)，
依據實驗設計餵食姬松茸懸浮溶液。待腫瘤長出後手術取出腫瘤，使用 Sodium pentobarbital & Avertin 腹腔注射全身麻醉，外科手術切除腫瘤，再觀察比較 腫瘤再生速度，藉以了解姬松茸多醣體是否對 Nude mice 體內的肺腺癌細胞 (A549)之抑制能力。
圖 21 小鼠胃管餵食姬松茸懸浮液