第一節 實驗材料及儀器
一 、實驗試藥
槲皮素 (Quercetin, 95%) Sigma Chemical Co.(U.S.A.) 桑色素 (Morin, 95%) Sigma Chemical Co.(U.S.A.) 芸香 (Rutin,95%) Sigma Chemical Co.(U.S.A.) 槐花 台中市欣隆藥行
Tetraglycol (GLycofurol) Sigma Chemical Co. (U.S.A.) β-Glucuronidase/Sulfatase Sigma Chemical Co. (U.S.A.)
無水醋酸鈉 Kohusan Chemical Works Ltd. (Japan) 醋酸 ( 99% ) Sigma Chemical Co. (U.S.A.)
氫氧化鈉 RiedeL-deHaen AG (Germany) L(+)-Ascorbic Acid RdH laborchemikalien GmbH
& Co. KG (Germany) 磷酸二氫鉀 Merck (Germany)
乙 ( LC Grade ) Merck (Germany) 甲醇 ( LC Grade ) Merck (Germany)
乙酸乙酯 ( LC Grade ) Mallinckrodt Baker, Inc. (U.S.A.)
磷酸 ( ortho-Phosphoric Acid, 85% ) Riedel-deHaen AG (Germany) 6,7-Dimethoxycoumarin Aldrich (Milwaukee, WI,U.S.A)
Ethyl paraben (99%) Aldrich (Milwaukee, WI, U.S.A.) 藥用酒精 臺灣菸酒公賣局
Sandimmun ( Cyclosporin, 100 mg/mL ) Sandoz Pharma Ltd.
Digoxin 永信藥廠
Medium 199 Sigma Chemical Co. (U.S.A.) Rhodamine 123 (95%) Sigma ChemicaL Co. (U.S.A.) 乙醚 Shimakyu’s pure Co. (Japan) 生理食鹽水
二、儀器設備
1. 酸鹼測定儀 Microprocessor pH-mV meter 2. 高速離心機 Denver Instrument (Force –14)
3. 渦旋振盪器 Scientific Industries 4. 超音波振盪器 Branson 5200
5. 控溫往復式振盪水槽 Shaker ZC4000 6. 吹氮氣濃縮裝置 OA-SYSEVAP-112
7. 混合氣體 (95% O2, 5%CO2) 源吉行有限公司 8. 電子分析天平 Mettler AJ100 9. 微量移液管 Eppendorf 10. 水壓抽氣機 Aspirator AS-1
11. TDX AnaLyzer Abbott, U.S.A.
12. 血清塞 弘光企業有限公司 13. 試管 ( 12×75 mm ) KimbLe
14. 鋁箔紙 Diamond
15. 過濾膜 ( 0.45μm, 13 mm ) Alltech Associates Inc.
16. 螢光光譜儀 Perkin Elmer (U.S.A.) 17. 高效液相層析儀(HPLC)包括:
(1) 幫浦 Shimadzu LC-6AD (Japan)
(2) 層析管 Cosmosil packed column 5C18C－AR－II
Waters, (150×4.6 mm) (3) 管柱前濾膜 SS/Pk
(4) 紫外光偵測器 Shimadzu SPD-6A (Japan) (5) 系統控制儀 Shimadzu SCL-6B
(6) 積分儀 Shimadzu C-R6A (7) 自動注射器 Perkin Elmer Series 200
Autosampler (U.S.A.) 16. 動物:
(1) 紐西蘭白兔 體重 : 2 ~ 3 kg, 雄性 (2) Sprague-DawLey 大白鼠 體重 : 200 ~ 400 g 17. 實驗器材:
(1) 胃管 (0.9×L 70 mm, 1.5×L 120 mm)
(2) 注射針及針筒 Terumo (Japan) 2.5 mL Syringe ( 0.55×25 mm )
1.0 mL Syringe ( 0.45×13 mm )
(3) 滅菌過濾膜 ( 0.2 μm, 13 mm ) Alltech Associates Inc.
二、 溶液製備
1. Buffer solution ( pH 5.0 )
取 0.1N 醋酸鈉溶液a 67.8 mL，加入 0.1N 醋酸b至 100 mL，再加 1N 氫氧化鈉調至 pH = 5.0 ± 0.1。
a 稱取 0.82 g 無水醋酸鈉，加水溶解並定容至 100 mL。
b 量取醋酸 (d = 1.049) 0.6 mL，加水定容至 100 mL。
2. β-Glucuronidase/Sulfatase 溶液
取β-glucuronidase/sulfatase (110350/4194 units/mL) 50
µ
L，加 pH 5.0 buffer 定容至 50 mL，貯存在-30℃備用。3. 維生素 C 溶液
稱取維生素 C 0.60 g，加水至 2.0 mL 即得 300 mg/mL 之維生素 C 溶液，使用前新鮮製備。
4. 槲皮素口服溶液
稱取 quercetin 500 mg 及 1000 mg，分別以 tetraglycol 定容至 10 mL， 即得 50 mg/mL 及 100 mg/mL 之槲皮素溶液，使用前新 鮮製備。
5. 桑色素口服溶液
稱取 morin 250 mg 及 500 mg，分別以 tetraglycol定容至 10 mL，
即得 25 mg/mL 及 50 mg/mL 之桑色素溶液，使用前新鮮製備。
6. 標準溶液之配製 A. 槲皮素
精確稱取 quercetin 20.0 mg，加入甲醇定容至 10.0 mL，即得 2.0 mg/mL 之槲皮素貯存溶液，再以甲醇稀釋成各種所需濃度之標 準溶液。
B. 桑色素
精確稱取 morin 20.0 mg，加入甲醇定容至 10.0 mL，即得 2.0 mg/mL 之桑色素貯存溶液，再以甲醇稀釋成各種所需濃度之標準 溶液。
C. 芸香
精確稱取 rutin 20.0 mg，加入甲醇定容至 10.0 mL，即得 2.0 mg/mL 之芸香 貯存溶液，再以甲醇稀釋成各種所需濃度之標準 溶液。
7. 內部標準品溶液之配製
A. 槲皮素的內部標準品溶液
精確稱取 6,7-dimethoxycoumarin 10.0 mg，以甲醇溶解並定
容至 10.0 mL，即得 1.0 mg/mL 之貯存溶液，再以乙酸乙酯稀釋成 各種所需濃度之標準溶液。
B. 桑色素的內部標準品溶液
精確稱取 ethyl paraben 10.0 mg，以甲醇溶解並定容至 10.0 mL，即得 1.0 mg/mL 之貯存溶液，再以乙酸乙酯稀釋成各種所需 濃度之標準溶液。
C. 芸香 的內部標準品溶液
精確稱取 6,7-dimethoxycoumarin 10.0 mg，以甲醇溶解並定 容至 10.0 mL，即得 1.0 mg/mL 之貯存溶液，再以甲醇稀釋成各種 所需濃度之標準溶液。
8. 地高辛溶液
精確稱取 digoxin 5.0 mg，先以 tetraglycol 助溶並定容至 5.0 mL，
即得 1.0 mg/mL 之貯存溶液，再以蒸餾水稀釋成所需濃度之標準溶液 (0.04 mg/mL)。
9. Medium 199 溶液
精確稱取 9.55 克 medium 199，加入 2.2 克碳酸氫鈉，再加水溶 解並定容成 1000 mL，調整 pH 至 7.4
±
0.1，貯存在 2 ~ 8 ℃，於一星 期內使用。10. Rhodamine 123 溶液
精確稱取 10.0 mg rhodamine 123，加水定容成 10.0 mL，即得 1.0 mg/mL 標準溶液，再以 medium 199 溶液稀釋成 20.0
µ
g/mL。第二節 實驗方法
一、槲皮素及桑色素在大白鼠體內之藥物動力學
A. 動物
雄性 Sprague-Dawley 老鼠，體重介於 350 ~ 450 g，出生 16 ~ 22 週，實驗前禁食 24 小時，並先剃除胸前之毛，以利心臟採血。
B. 給藥及採血
將大白鼠分成四組，第一組給予槲皮素溶液 50 mg/mL (165
µ
moL/kg)，第二組給予槲皮素溶液 100 mg/mL (330µ
moL/kg)，第三組 給予桑色素 25 mg/mL (83 µmoL/kg)，第四組給予桑色素溶液 50 mg/mL (165µ
moL/kg)。經由胃管投予藥物溶液，採血時間點為給藥前(blank) 及給藥後 5，15，30，60，90，120，240，360，480，600，720，及 1440 分鐘，從心臟採血，每次採血量為 0.8 mL，將檢品離心 (9860 × g) 15 分鐘，取上層血清，並保存在-30℃，俟後分析。C. 血清中槲皮素、桑色素之定量分析
(一) HPLC 分析條件
A. 槲皮素
層析管( Column ) Cosmosil packed column 5C18C－AR－II
Waters, (150×4.6 mm) 管柱前濾膜( Prefilter ) SS/PK
檢測波長 : 370 nm
移動相比例 : acetonitrile -0.1% ortho-phosphoric acid ( 28 : 72, v/v )，pH = 2.3
內標準：6,7-dimethoxycoumarin 流速 : 1 mL/min
B. 桑色素
層析管( Column ) Cosmosil packed column 5C18C－AR－II
Waters, (150×4.6 mm) 管柱前濾膜( Prefilter ) SS/PK
檢測波長 : 250 nm
移動相比例 : acetonitrile -0.1% ortho-phosphoric acid ( 28 : 72, v/v )，pH = 2.3
內標準：ethyl paraben
流速 : 1 mL/min
(二) 血清檢品之前處理
a. 總槲皮素、總桑色素之定量
取 血 清 檢 品 150
µ
L 置 於 外 包 鋁 箔 紙 之 試 管 ， 加 100µ
L glucuronidase/sulfatase 溶 液 (β -glucuronidase 110.35 units/mL, sulfatase 4.194 unit/mL in pH 5.0 buffer)，及 15µ
L 維生素 C 溶液 (300 mg/mL)，蓋 上血清塞，置於渦旋振盪器上混合 20 秒，用針筒將試管內之空氣抽出。置於 37 ℃之往復式振盪水槽 (轉速 100 rpm) ，反應 4 小時後，取出檢品，
加入 265
µ
L 乙酸乙酯 (含內標準)，於渦旋振盪器上混合 20 秒，再將檢品 倒入棕色離心管，以 9860 × g 離心 15 分鐘之後，取出乙酸乙酯層，以氮 氣吹乾，貯於-30℃，待分析時，以 50µ
L 乙 溶解，供 HPLC 定量。b. 自由態槲皮素、自由態桑色素之定量
取血清檢品 150 µL 於棕色離心管，加入 pH 5.0 之醋酸鈉緩衝液 100 μL，及 15
µ
L 維生素 C 溶液 (300 mg/mL) ，置於渦旋振盪器上混合 20 秒，加入 265µ
L 乙酸乙酯 (含內標準)，於渦旋振盪器上混合 20 秒，以 9860 × g 離心 15 分鐘之後，取出乙酸乙酯層，以氮氣吹乾後，貯於-30℃，待分析時，以 50 µL 乙 溶解，供 HPLC 定量。
(三) 檢量線之繪製
A. 槲皮素
精確稱取 quercetin，以甲醇溶解並稀釋定容，製備 0.19，0.39，
0.78，1.56，3.13，6.25，12.50，25.00，50.00
µ
g/mL 等濃度之標準溶液，各取 100 µL quercetin 標準溶液，加入 900
µ
L 空白血清，製備血清標準溶 液，濃度分別為 0.02，0.04，0.08，0.16，0.31，0.63，1.25，2.50，5.00 µg/mL。每一濃度之血清標準溶液各取 150 µL，加 100
µ
L 醋酸鈉緩衝溶液 (pH 5.0) 及 15µ
L 維生素 C 溶液 (300 mg/mL)，再以乙酸乙酯 265µ
L (含內標準 6,7-dimethoxycoumarin；2.0μg/mL)萃取之，於渦旋振盪器上混合 20 秒，以 9860 × g 離心 15 分鐘，取乙酸乙酯層，以氮氣吹乾，加 50 µL 乙 溶 解，供 HPLC 分析。
B. 桑色素
精確稱取 morin，以甲醇溶解並稀釋定容，製備 1.9，3.9，7.8，15.6，
31.3，62.5，125.0，250.0，500.0，1000.0
µ
g/mL 等濃度之標準溶液，各 取 100µ
L morin 標準溶液，加入 900µ
L 空白血清，製備血清標準溶液，濃度分別為 0.19，0.39，0.78，1.56，3.13，6.25，12.50，25.00，50.00，
100.00
µ
g/mL。每一濃度之血清標準溶液各取 150µ
L，加 100µ
L 醋酸鈉 緩衝溶液 (pH 5.0) 及 15µ
L 維生素 C 溶液 (300 mg/mL)，再以乙酸乙酯265
µ
L (含內標準 ethyL paraben 10.0μg/mL)萃取之，於渦旋振盪器上混合 20 秒，以 9860 × g 離心 15 分鐘，取乙酸乙酯層，以氮氣吹乾，加 50µ
L 乙 溶解，供 HPLC 分析。(四) 分析方法之確效
( 1 ) 精密度
將各種濃度的槲皮素、桑色素血清標準溶液，分別於同日內早、午、
晚及連續三日之異日間各作一次 HPLC 分析，並代入檢量線求得每次分析 之濃度。以三次同日內及三次異日間分析值分別求其平均值 (mean)、標 準偏差 (standard deviation，S.D.) 及變異係數 (coefficient of variation，
C.V. )。
( 2 ) 靈敏度
將槲皮素、桑色素血清標準溶液濃度一再稀釋，直到 HPLC 層析圖 顯示其波峰高度為雜訊之三倍的濃度為其偵測極限。
( 3 ) 回收率 A. 槲皮素
將 quercetin 溶於甲醇，製備 25.0, 12.5 及 6.3
µ
g/mL 三種濃度，分別 加入 9 倍體積之空白血清成為 2.50, 1.25, 0.63 µg/mL，每種濃度各三管。所得血清中之檢出濃度除以相對應濃度於水中之檢出濃度即為回收率。
B. 桑色素
將 morin 溶於甲醇，製備 500.0, 125.0 及 31.3
µ
g/mL 三種濃度，分別 加入 9 倍體積之空白血清及水中成為 50.0, 12.5, 3.1 µg/mL，每種濃度各三 管。所得血清中之檢出濃度除以相對應濃度於水中之檢出濃度即為回收 率。(五) 數據處理
血清檢品經 HPLC 定量後之數據，利用電腦程式 WINNONLIN 中非 室體模式 （noncompartment model），求其動力學參數。
二. 槲皮素及桑色素於大白鼠體內對地高辛吸收之影響
A. 動物及給藥
雄性 Sprague-Dawley 老鼠，體重介於 250 ~ 350 g，出生 8 ~ 16 週，
實驗前禁食 24 小時，且先剃除胸前之毛，以利心臟採血。給藥途徑則是 以胃管口服灌食。
本 實 驗 依 併 服 藥 物 與 劑 量 將 大 白 鼠 分 成 高 劑 量 槲 皮 素 (100 mg/kg)、低劑量槲皮素(50 mg/kg)、高劑量桑色素(100 mg/kg)與低劑量桑 色素(50 mg/kg)等四組。單服地高辛與併服黃酮類藥物採交叉設計，一次 單服地高辛，另一次併服黃酮類化合物，兩次至少相隔兩星期。
B. 採血及檢品處理
採血時間於給藥前(blank)及給藥後 20，40，60，90，120，240，360，
及 480 分鐘，每次採血量為 0.8 mL，將檢品離心 (9860 × g) 15 分鐘，取 上層血清，並保存在-30℃，俟後分析。
C. 血液中 digoxin 之定量
血液檢品利用 TDx AnaLyzer 以 FPIA (Fluorescence Polarization Immuno Assay) 方法定量血液中 digoxin 的濃度。
D. 數據處理及統計方法
利用電腦程式 WINNONLIN，採非室體模式 （noncompartment modeL）計算動力學參數，並使用 paired Student's t - test 分析兩種給藥方 法是否具統計上的差異。
三. 槲皮素對 P-glycoprotein 功能之影響
A. 體外翻轉腸管實驗
雌性 Sprague-Dawley 老鼠，體重介於 150 ~ 250 g，出生 8 ~ 12 週，實驗前先禁食 1 ~ 2 天，以清除胃腸道中殘餘食物，並於乙醚麻醉的 狀態下，剖開腹腔。取出離胃 5 cm 以下的空腸及離盲腸 5 cm 以上的迴腸 各 30 cm，將取出的空腸及迴腸用冰的生理食鹽水灌流清洗內部殘留物。
再將腸子外翻，讓黏膜層在外，漿膜層在內，隨後先於腸子一端以線綁緊，
再於腸子另一端插入針頭，並於 25 cm 處以線綁緊。
將大白鼠分成三組，第一組為空白組將腸子置於裝有 50 mL medium 199 溶液的燒杯中，第二組置於裝有 50 mL 含 200
µ
M 槲皮素 medium 199 溶液的燒杯中，第三組置於裝有 50 mL 含 400µ
M 槲皮素之 medium 199 溶液的燒杯中。這些溶液皆含 0.5 % DMSO 為助溶劑。將各 燒杯置於 37 ℃之往復式振盪水槽 (轉速為 50 rpm) 並持續通入混合氣體 (含 95 % O2及 5 % CO2) 以維持腸子存活。待腸子放入燒杯 20 分鐘後，在裝有針頭的一端注入 rhodamine 123 溶液 3.0 mL (20.0
µ
g/mL) 。B. 採樣及檢品處理
檢品採樣係取腸子外之燒杯內容物，每次採樣量為 0.8 mL，採樣
時間為注入 rhodamine 123 溶液之前(blank)及之後 20，40，60，80 及 100 分鐘，並將採得之樣品置於離心管內，俟後分析。
C. Rhodamine 123 檢量線之繪製
取 rhodamine 123 (1.0 mg/mL) 標準溶液，以 medium 199 溶液稀 釋為 2000，1000，500，250，125，100，50，25 ng /mL 等濃度，經螢光 光譜儀分析，設定 485 nm 為 excitation 波長，546 nm 為 emission 波長，
以直線迴歸法繪製檢量線。
D. 檢品中 rhodamine 123 之定量
待分析的檢品以所繪製之檢量線以內插法定量。
E. 數據處理及統計方法
利用電腦程式 SPSS，以 ANOVA 分析此三組不同藥物間 rhodamine 123 的排出量是否達到統計上的差異。
四、槐花水煎劑中芸香 之含量分析
(1) 槐花水煎劑之製備
槐花 150g，加入 6 L 水，以瓦斯爐加熱，剛開始大火至沸騰時 改小火，使水位略低於 1.5 L 之刻度線，趁熱過濾，再以沸水定容至 1.50L。
(2) 槐花水煎劑之前處理
取槐花水煎劑 1.0 mL，以純水溶液定容至 100.0 mL。取此稀釋 液 60
µ
L，加入 140µ
L 甲醇（即水：甲醇＝3：7），於 9860 × g 離心 15 分鐘，取上清液 100 µL，加入 100µ
L 甲醇 (含內標準6,7-dimethoxycoumarin；10.0
µ
g/mL)，於渦旋振盪器上混合 20 秒，取 100µ
L，供 HPLC 分析。(3) 芸香 之含量分析 HPLC 分析條件
(3) 芸香 之含量分析 HPLC 分析條件