第一節 槲皮素及桑色素在大白鼠體內之藥物動力學
一、 血清中槲皮素、桑色素結合態代謝物之水解
槲皮素與桑色素因化學上皆屬多酚結構，易被氧化，為較不安定的黃 酮類化合物。欲測定血清中的槲皮素或桑色素之結合態代謝物，須先以β -glucuronidase 於活性最好的 pH 5.0 及 37℃之狀態下，將結合態的代謝物 水解成自由態。此外，經由預試驗，發現 4 小時之水解反應，所生成的槲 皮素與桑色素均最多，因此 解時間都採 4 小時。於 解反應時，須添加 抗氧化劑維生素 C，並將試管內的氧氣抽出，可避免反應時槲皮素與桑色 素發生降解的現象。
二、 血清中槲皮素、桑色素及其結合態代謝物之定量
(1) 血清中槲皮素及其結合態代謝物之定量
血清中之槲皮素，係以含內標(6,7-dimethoxycoumarin)的乙酸乙酯萃 取，再利用逆相層析分離定量，係以乙 : 0.1 %磷酸水溶液(28:72, v/v)
為移動相，在流速為 1.0 mL/min 的條件下，於 12 分內完成分離，其層析 圖如 Fig.1-1 所示。檢量線方程式為 y = 0.29χ+ 0.01 ( r = 0.999 )，槲皮素 濃度範圍為 0.16 ~ 5.00
µ
g/mL，於此範圍內濃度與 peak area ratios 間有良 好的線性關係。同日內及異日間的 C.V. ( % ) 值分別為 0.6 ~ 2.6 % 及 1.3 ~ 2.7 %，顯示其精密度佳，而相對誤差也在 20 %以內(Table. 1-1)。回收率 為 81 % ~ 82 % (Table. 1-2)，LOQ 為 0.16µ
g/mL，LOD 為 4.9 ng/mL。至 於血清中結合態代謝物之含量，係由總槲皮素含量(以 水解)減去原型槲 皮素含量(無 水解)而得。(2) 血清中桑色素及其結合態代謝物之定量
血清中之桑色素，係以含內標(ethyl paraben)的乙酸乙酯萃取，利用逆 相層析分離定量，以乙 : 0.1 % 磷酸水溶液 ( 28:72, v/v )為移動相，在 流速為 1.0 mL/min 的條件下，於 13 分內完成分離，其層析圖如 Fig.1-3 所 示。檢量線方程式為 y = 0.02χ- 0.01 ( r = 0.999 )，桑色素濃度範圍為 0.39
~ 100.00
µ
g/mL，此範圍濃度與 peak area ratios 間皆有良好的線性關係。由同日內及異日間的 C.V. ( % ) 值為 0.1 ~ 1.9 % 及 0.2 ~ 4.1 %，顯示其精 密度佳，而相對誤差也在 20 %以內 (Table. 1-8)。回收率為 70.1% ~ 75.9 % (Table.1-9)，LOQ 為 0.19
µ
g/mL，LOD 為 0.09µ
g/mL。至於血清中結合態 代謝物之含量由總桑色素含量(以 水解)減去原型桑色素含量(無 水解)而得。
三、 槲皮素、桑色素於大白鼠體內之動力學
(1) 槲皮素之動力學
本實驗將大白鼠分成兩組，口服給予兩種不同劑量的槲皮素 (50 mg/kg，n=5；100 mg/kg，n=6 )，血清濃度經時變化如 Fig. 1-2 所示。口 服 100 mg/kg 槲皮素後，僅有少數血清檢品可偵測到極微量的原型槲皮 素，但其濃度小於定量極限。而口服 50 mg/kg 槲皮素後，血清中皆無法 偵測到原型。因此，無法計算其原型槲皮素之動力學參數。至於其結合態 代謝物的的血藥數據，以 WINNONLIN 的非室模式計算動力學參數，結 果如 Table. 1-5 ~ 1-6 所示。口服低劑量(50 mg/kg)的五隻大白鼠的平均血 峰濃度(Cmax)為 4.9 ±1.0 nmol · mL-1，平均血藥面積(AUC0-t)為 2906.1 ± 230.6nmol· min· mL-1，平均滯留時間 MRT 為 707.3 ±56.7 min。而口服高 劑量(100 mg/kg)的六隻大白鼠的平均血峰濃度(Cmax)為 9.5 ±1.6 nmol· mL-1，平均血藥面積(AUC0-t) 4818.0 ±385.0 nmol· min· mL-1，平均滯留時 間 MRT 為 740.3 ±38.4 min。結果顯示(Table. 1-7)，槲皮素在 50 ~ 100 mg/kg 的劑量範圍內，血峰濃度與血藥面積皆成倍數增加。然而，各隻大 白鼠間之吸收的程度與血峰時間差異頗大。
(2) 桑色素之動力學
將大白鼠分成兩組，分別投予兩種劑量的桑色素(25 mg/kg，n=6；50 mg/kg，n=6)，其血藥濃度經時變化如 Fig.1-4 ~ 1-5 所示。經 WINNONLIN 非室性模式計算，求得動力學參數。若比較血清中的原型桑色素(Table.
1-16、1-18 及 1-22)。兩種劑量的平均血藥面積(AUC0-t)分別為 168.0 ±41.0 與 6272.5 ±1359.0 nmol· min· mL-1，兩者之間的差異遠超過兩倍，而達三 十 六 倍 之 多 ； 平 均 血 峰 濃 度 (Cmax)分 別 為 3.1 ± 0.8 與 84.9 ± 21.0 nmol/mL1，其差異近二十六倍。平均排除半生期分別為 95.7 ±15.4與 271.1
±62.1 min，平均滯留時間 MRT 分別為 71.5 ±14.2 與 273.3 ±67.0 min。
至於有關血清中結合態代謝物之係數(Table. 1-17、1-19 及 1-23)，兩種劑 量的平均血藥面積(AUC0-t)分別為 961.1 ±405.2 與 2851.1 ±878.1 nmol·
min· mL-1，兩者之間的差異將近三倍，但於早期吸收血藥面積(AUC0-30)分 別為 246.8 ±117.43 與 323.0 ±109.8 nmol· min· mL-1，平均血峰濃度(Cmax) 分別為 18.5 ±7.2 與 20.9 ±6.2 nmol/mL，平均排除半生期分別為 161.2
±46.6 與 305.0 ±82.6 min，平均滯留時間 MRT 分別為 157.5 ±50.7 與 343.7 ±99.3 min。經數據的觀察及計算可知，無論是自由態桑色素或其 結合態代謝物之血峰濃度和血藥面積皆不呈倍數增加。經計算，血中結合 態佔水解後總量的比率，低劑量與高劑量分別為 85 %與 30 % (Table. 1-20
~ 1-21)。低劑量口服時，血中結合態代謝物多於原型藥，但高劑量口服時 卻是原型藥多於結合態代謝物，此外，兩劑量之結合態代謝物的平均血峰 濃度與早期吸收血藥面積顯示並無顯著差異。因此，可推斷桑色素在其動 力學行為上有非線性之現象，顯示藥物代謝 glucuronyl transferase 可能 不足供應高劑量 morin 之代謝，而使原型藥之血藥濃度反而高於結合態代 謝物，同時排除速率變慢，滯留時間顯著變長。
(3) 槲皮素與桑色素動力學之比較
槲皮素在 50 mg/kg 及 100 mg/kg 兩劑量口服後，血中之原型藥濃度極 微。但桑色素在 25 mg/kg 及 50 mg/kg 兩劑量口服後，血中之原型藥濃度 頗高，特別是口服高劑量時。桑色素之動力學行為顯然與槲皮素差異極 大。就化學結構而言，槲皮素與桑色素互為結構異構物，若比較大白鼠口 服相同劑量 (50 mg/kg) 之槲皮素與桑色素，結果顯示了兩者於體內的命 運迥然不同。口服 50 mg/kg 的槲皮素，血清中無法偵測到任何原型藥物。
相對地，口服 50 mg/kg 的桑色素，血清中的原型藥卻遠多於結合態代謝 物。不禁令人推想，是否由於槲皮素與桑色素結構上的位向差異，使其與 生物體內 glucuronyl transferase 產生不等的親和力，而造成兩者於體內的 原型藥與結合態代謝物的比例懸殊。由槲皮素動力學之實驗結果顯示，槲 皮素皆以結合態代謝物循環於體內。因此，槲皮素之體內藥理活性應該主
要來自其結合態代謝物，因此建議致力於體外藥理活性研究的學者，應多 重視此些結合態代謝物。
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20
( a ) ( b ) ( c )
Retention time (min)
Fig. 1-1 Chromatograms of quercetin (Q) and 6,7-dimethycoumarin (internal standard ; IS) in rat serum: ( a ) blank serum ; ( b ) spiked in blank serum , Q: 8.3 nmol/mL ; ( c ) after oral administration of 50 mg/kg quercetin , Q: 3.1 nmol/mL.
Table. 1-1 Intra-run and inter-run analytical precision and accuracy of quercetin.
precision accuracy
Conc. Intra-run Inter-run Intra-run Inter-run
(μg/mL) mean ± S.D. (C.V.%) mean ± S.D. (C.V%) relative error(%) relative error(%)
5.00 5.02 ± 0.02 (0.9) 5.07 ± 0.06 (1.3) + 0.4 + 1.4
2.50 2.50 ± 0.01 (0.6) 2.55 ± 0.04 (1.3) + 0.0 + 2.0
1.25 1.26 ± 0.01 (0.9) 1.24 ± 0.02 (1.8) + 0.8 - 0.8
0.63 0.62 ± 0.02 (2.5) 0.60 ± 0.03 (1.3) - 1.6 + 4.8
0.32 0.31 ± 0.01 (1.8) 0.33 ± 0.03 (1.8) - 3.1 - 3.1
0.16 0.15 ± 0.01 (2.6) 0.14 ± 0.03 (2.7) - 6.3 + 12.5
(n=3)
Table. 1-2 Recovery (%) of quercetin from rat serum.
Conc. (μg/mL) Mean(﹪) ±S.D.
2.50 81.93 ±0.01
1.25 81.68 ±0.01 0.63 81.11 ±0.02
(n=3)
Table. 1-3 The concentrations of quercetin conjugates ( nmol/mL ) in serum after oral administration of querceitn (50 mg/kg = 165μmol/kg ) to five rats.
Table. 1-4 The concentrations of quercetin conjugates ( nmol/mL ) in serum after oral administration of querceitn (100 mg /kg = 331μmol/kg ) to six rats.
Table. 1-5 Individual pharmacokinetic parameters of quercetin conjugates in serum after oral administration of quercetin (50 mg/kg = 165μmol/kg) to five rats.
Parameters Cmax
Table. 1-6 Individual pharmacokinetic parameters of quercetin conjugates in serum after oral administration of quercetin (100 mg/kg = 331μmol/kg) to six rats.
Table. 1-7 Comparison of pharmacokinetic parameters of quercetin conjugates after oral dosing 50 mg/kg (165μmol/kg; n=5) and 100 mg/kg (331μmol/kg; n=6) quercetin to rats.
( a )
( b )
Fig. 1-2 ( a ) Mean (± S.E.) serum concentration-time profiles of quercetin conjugates in rats after oral administration of 50 mg/kg (l ; n=5) and 100 mg/kg (¡ ; n=6)of quercetin to rats , respectively and ( b ) the semi-log diagram of ( a ).
Time (min)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
serum concentration (nmol/ml)
0 2 4 6 8 10 12
quercetin (50 mg/kg) quercetin (100 mg/kg)
Time (min)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
serum concentration (nmol/ml)
10
quercetin (50 mg/kg) quercetin (100 mg/kg)
0 4 8 12 16 0 4 8 12 16 0 4 8 12 16
( a ) ( b ) ( c )
Retention time (min)
Fig. 1-3 Chromatograms of morin (M) and ethyl paraben (internal standard; I.S.) in rat serum: ( a ) blank serum ; ( b ) spiked in blank serum , M: 167.0 nmol/mL ;
( c ) after oral administration of 25 mg/kg morin , M: 27.5 nmol/mL.
Table. 1-8 Intra-run and inter-run analytical precision and accuracy of morin.
precision accuracy
Conc. intra-run inter-run intra-run inter-run
(μg/mL) mean ± S.D. (C.V.%) mean ± S.D. (C.V%) relative error(%) relative error(%)
200.0 201.5 ± 0.3 (0.1) 202.3 ± 0.6 (0.3) + 0.7 + 1.1
100.0 102.4 ± 0.2 (0.2) 102.5 ± 0.2 (0.2) + 2.4 + 2.5
50.0 50.6 ± 0.2 (0.3) 50.9 ± 0.2 (0.5) + 1.3 + 1.9
25.0 25.1 ± 0.5 (1.9) 25.1 ± 0.5 (1.9) - 0.9 + 0.4
6.3 6.3 ± 0.1 (1.1) 6.3 ± 0.2 (2.7) + 0.5 + 0.2
1.6 1.4 ± 0.02 (1.4) 1.4 ± 0.02 (4.1) -10.9 - 8.9
(n=3)
Table. 1-9 Recovery (%) of morin from rat serum.
Conc. (μg/mL) Mean(﹪) ± S.D.
50.0 70.1 ± 0.01
12.5 75.9 ± 0.02
3.1 71.7 ± 0.1 (n=3)
Table. 1-10 The concentrations of morin with its conjugates ( nmol/mL ) in serum after oral
Table. 1-11 The concentrations of morin ( nmol/mL ) in serum after oral administration of 25 mg/mL morin to six rats.
Table. 1-12 The concentrations of morin conjugates ( nmol/mL ) in serum after oral administration of 25 mg/mL morin to six rats.
Rats Time ( min )
a b c d e f Mean ± S.E.
5 50.3 5.3 18.7 1.2 0.4 24.6 16.8 ± 7.8 15 19.4 3.0 11.6 1.2 9.6 18.3 10.5 ± 3.1 30 12.0 1.6 1.1 2.5 2.7 10.9 5.1 ± 2.0 60 4.8 1.7 1.7 0.6 3.2 7.7 3.3 ± 1.1 90 2.7 0.2 0.6 0.3 1.3 4.6 1.6 ± 0.7 120 1.9 0.6 0.6 0.6 0.7 3.8 1.4 ± 0.5 240 0.8 ND 0.3 ND 0.1 2.0 0.5 ± 0.3 360 0.9 ND 0.5 ND 0.3 1.5 0.5 ± 0.2
480 1.1 ND ND ND 0.5 0.6 0.4 ± 0.2
600 0.8 ND ND ND 0.4 0.5 0.3 ± 0.1
720 0.4 ND ND ND 0.6 0.5 0.3 ± 0.1
1440 0.4 ND ND ND ND ND 0.1 ± 0.1
ND : not detectable.
Table. 1-13 The concentrations of morin with its conjugates ( nmol/mL ) in serum after oral
Table. 1-14 The concentrations of morin ( nmol/mL ) in serum after oral administration of 50 mg/kg morin to six rats.
Table. 1-15 The concentrations of morin conjugates ( nmol/mL ) in serum after oral administration of 50 mg/kg morin to six rats.
Rats Time ( min )
A B C D E F Mean ± S.E.
5 19.5 15.8 18.4 6.6 1.4 6.2 11.3 ± 3.1 15 7.0 3.4 40.8 0.8 2.5 8.9 10.6 ± 6.2 30 23.9 16.7 20.5 5.4 1.8 16.5 14.1 ± 3.5 60 35.1 23.8 10.3 0.9 1.5 14.9 14.4 ± 5.4 90 28.0 13.8 13.4 0.8 0.6 8.2 10.8 ± 4.2 120 16.7 3.6 11.5 0.1 0.6 10.7 7.2 ± 2.8 240 7.3 5.3 6.3 0.6 0.7 0.7 3.5 ± 1.3 360 3.5 1.6 4.1 0.8 0.2 0.6 1.8 ± 0.7 480 1.1 0.6 1.0 0.4 0.2 0.3 0.6 ± 0.2 600 0.5 0.3 0.2 0.2 0.2 0.1 0.3 ± 0.1 720 1.5 0.7 0.2 0 0.6 0.3 0.6 ± 0.2 1440 0.2 0.4 0.1 1.0 0.3 0 0.3 ± 0.1
Table. 1-16 Individual pharmacokinetic parameters of morin in serum after oral administration
Table. 1-17 Individual pharmacokinetic parameters of morin conjugates in serum after oral administration of 25 mg/kg morin to six rats.
Table. 1-18 Individual pharmacokinetic parameters of morin in serum after oral administration
Table. 1-19 Individual pharmacokinetic parameters of morin conjugates in serum after oral administration of 50 mg/kg morin to six rats.
Table. 1-20 Comparison of AUC0-t (nmol ⋅ min/mL) of between morin and morin conjugates after oral administration of 25 mg/kg morin to rats.
Rats
a b c d e f Mean ± S.E.
Morin + conjugates 191.2 800.6 2645.6 2316.2 230.0 591.0 1129.1 ± 439.5
Morin conjugates 115.3 555.4 2358.9 2078.1 179.0 480.1 961.1 ± 405.2
Morin 75.9 245.2 286.7 238.2 51.0 110.9 168.0 ± 41.0
Morin conjugates
Morin + conjugates 0.60 0.69 0.89 0.90 0.78 0.81 0.78 ± 0.10
Morin
Morin + conjugates 0.40 0.31 0.11 0.10 0.22 0.19 0.22 ± 0.10
Table. 1-21 Comparison of AUC0-t (nmol ⋅ min/mL) between morin and morin conjugates after oral administration of 50 mg/kg morin to rats.
Rats
A B C D E F Mean ±S.E.
Morin + conjugates 13945.8 12261.5 13813.9 2736.1 3022.6 9261.9 9173.6 ± 2106.5
Morin conjugates 6103.0 3342.6 4165.7 821.5 639.3 2334.7 2901.1 ± 852.6
Morin 7842.8 8918.9 9648.2 1914.6 2383.3 6927.2 6271.5 ± 1358.6
Morin conjugates
Morin + conjugates 0.44 0.27 0.30 0.30 0.21 0.25 0.30 ± 0.03
Morin
Morin + conjugates 0.56 0.73 0.70 0.70 0.79 0.75 0.70 ± 0.03
Table. 1-22 Comparison of pharmacokinetic parameters of morin after oral dosing 25 mg/kg (83μ
Table. 1-23 Comparison of pharmacokinetic parameters of morin conjugates after oral dosing 25 mg/kg (n=6) and 50 mg/kg (n=6) morin to rats.
Table. 1-24 Comparison of the ratios of AUC0-t (nmol•min/mL) of morin conjugates and morin to the total AUC0-t of morin with its conjugates after oral administration of 25 mg/kg (n=6) and 50 mg/kg (n=6) morin to rats.
( a ) ( b )
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
serum concentration (nmol/ml)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
serum concentration (nmol/ml)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
serum concentration (nmol/ml)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
serum concentration (nmol/ml)
( a ) ( b )
Fig. 1-6 ( a ) Mean (± S.E.) serum concentration-time profiles of morin conjugates in rats after oral dosing 25 mg/kg (l ; n=6) and 50 mg/kg (¡ ; n=6) of morin to rats, respectively
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
serum concentration (nmol/ml)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
serum concentration (nmol/ml)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
serum concentration (nmol/ml)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
serum concentration (nmol/ml)
第二節 槲皮素、桑色素在大白鼠體內對地高辛動力學之影響
本實驗以大白鼠為模型，探討槲皮素與桑色素對地高辛(digoxin)動力 學之影響。血清中地高辛濃度之分析，採用螢光偏極免疫法(Fluorescence Polarization Immuno Assay; FPIA)，此方法為一種抗原抗體競爭結合的免 疫反應，利用待測藥物濃度與螢光偏極程度成反比關係，將通過測定樣品 的 偏 極 光 大 小 ， 精 確 地 換 算 出 藥 物 濃 度 ( 單 位 為 ng/mL) 。 結 果 經 WINNONLIN 之非室體模式 (noncompartment model) 計算出動力學參數。
(1) 槲皮素對地高辛動力學之影響 1. 高劑量組(100 mg/kg)：
大白鼠單服地高辛(0.04 mg/kg)後，其平均血藥面積(AUC0-t)為 1458.6
±208.9 ng· min· mL-1，平均血峰濃度(Cmax)為 9.7 ±0.9 ng· mL-1，平均滯留 時間 MRT 為 174.4 ±6.2 min。併服槲皮素後，地高辛之平均血藥面積 (AUC0-t)為 1123.4 ±169.5 ng· min· mL-1，平均血峰濃度(Cmax)為 6.1 ±1.2 ng· mL-1，平均滯留時間 MRT 為 185.6 ±12.1 min。以 paired Student’s t - test 比較兩種給藥方式之間的差異。結果顯示，併服槲皮素後，AUC0-t降低了 23 %，達顯著差異 (p < 0.01)。Cmax 降低了-37 %，亦達顯著差異 (p <
0.01)。血藥經時變化圖如 Fig. 2-3 所示，血中地高辛之濃度如 Table.2-5 ~
2-6 所示。
2.低劑量組(50 mg/kg)：
併服槲皮素後地高辛之血中濃度分成增加及減少兩個子群：
A. 在增加之子群(n=3)中，單服地高辛後，其平均血藥面積(AUC0-t) 為 908.5 ±173.9 ng· min· mL-，平均血峰濃度(C1 max)為 3.3 ±0.6 ng· mL-1，平均滯留時間 MRT 為 261.6 ±9.7 min。然而，併服槲皮素 後，其平均血藥面積(AUC0-t)為 1365.6 ±166.0 ng· min· mL-1，平 均血峰濃度(Cmax)為 4.4 ±0.6 ng· mL-1，平均滯留時間 MRT 為 240.2 ±17.5 min。血藥經時變化圖如 Fig. 2-1 所示，及血中地高 辛之濃度如 Table.2-1 ~ 2-2 所示。
B. 在減少之子群(n=8)中，單服地高辛後，其平均血藥面積(AUC0-t) 為 1520.1 ±104.1ng· min· mL-1，平均血峰濃度(Cmax)為 7.4 ±0.7 ng· mL-1，平均滯留時間 MRT 為 186.0 ±10.3 min。而併服槲皮素 後，其平均血藥面積(AUC 0-t)為 815.4 ±132.8 ng· min· mL-1，平均 血峰濃度(Cmax)為 4.3 ±1.0 ng· mL-1，平均滯留時間 MRT 為 186.5
±9.3 min。血藥經時變化圖如 Fig. 2-2 所示，及血中地高辛之濃度 如 Table.2-3 ~ 2-4 所示。
兩子群皆利用 paired Student's t - test，比較槲皮素的併服與否，其地 高辛血藥面積 (AUC0-t)之差異。結果顯示當與槲皮素併服時，血藥濃度增
加之子群，其 AUC0-t增加了 50 % (p＝0.1)，Cmax增加了 33 % (p＝0.07)；
減少之子群，AUC0-t降低了 46%，達顯著差異 (p < 0.001)，Cmax降低了 42%，亦達顯著差異 (p < 0.01)。
再利用 unpaired t-test 比較併服不同劑量之槲皮素後，地高辛吸收之 差異。結果顯示，雖然高劑量組比低劑量組地高辛吸收降低的現象較為一 致，但發現兩者並無顯著差異。
(2) 桑色素對地高辛動力學之影響 1. 高劑量組(100 mg/kg)：
單服地高辛(0.04 mg/kg)的大白鼠，其平均血藥面積(AUC0-t)為 1621.6
±99.9 ng· min · mL-1，平均血峰濃度(Cmax)為 7.5 ±0.8 ng· mL-1，平均滯留 時間 MRT 為 186.7 ±5.8 min。而併服桑色素後，地高辛的平均血藥面積
±99.9 ng· min · mL-1，平均血峰濃度(Cmax)為 7.5 ±0.8 ng· mL-1，平均滯留 時間 MRT 為 186.7 ±5.8 min。而併服桑色素後，地高辛的平均血藥面積