本次實驗主要分為光通量與脈衝數對殺菌數目分析，接下來我們 將介紹所使用的儀器以及運作原理。
3-1 大腸桿菌培養
大腸桿菌的學名為 Escherichia coli，通常簡寫爲 E. coli，是由德 國細菌學家 Theodor Escherich 發現，而將其名字拉丁化為 Escherichia，
至於 coli 是指大腸(colon)的意思[21-23]。
大腸桿菌的大小約 1 μm3，重量約 10-12 g，屬於革蘭氏陰性菌，
為人體內最多的細菌。大腸桿菌在自然界的生存力強，最適合生長的 溫度為 37℃，在冷藏的環境下可存活一個月左右；但不耐熱，以 60
℃作用 15~20 分鐘即可致死。
大腸桿菌製備流程
準備液態 LB 與氨苄青黴素培養菌種大腸桿菌的培養吸光 值的測定準備培養基(固態 LB 與氨苄青黴素) 稀釋塗菌計數
i. 準備液態 LB 與氨苄青黴素:
LB 為 Giuseppe Bertani 所發明的，每 25 g 的 LB Broth
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Miller 中含有 10 g 的胰蛋白腖(tryptone)、5 g 的酵母菌萃取 物(yeast extract)和 10 g 的氯化鈉(sodium chloride)。氨苄青黴 素(ampicillin)是一種抗生素，能滲透革蘭氏陽性菌及部分革 蘭氏陰性菌，阻礙細菌合成細胞壁的第三和最終階段，造成 細胞裂解死亡。
LB 液是細菌的培養液，通常是以每公升溶劑中加入 25 克的 LB Broth Miller 之比例來配置。首先量取 5 g 的 LB Broth Miller 至容積為 250 mL 的血清瓶中，加入二次去離子水至 200 mL，高溫高壓滅菌後放入 4℃的冷藏櫃保存，保存期限 大約為六個月左右。
在培養基中加入抗生素的目的是用來抑制不需要的微生 物，有利所需微生物的生長，而抗生素的配製方式則是在每 毫升的溶劑中加入 50 毫克的氨苄青黴素粉末。
首先量取保存在 4℃冷藏櫃中的氨苄青黴素粉末 0.5 g 至 容積為 15 mL 的離心管中，加入 5 mL 95%的酒精與 5 mL 的 二次去離子水，接著放在振盪機上攪拌直到氨苄青黴素完全 溶解為止。將所配得的溶液倒入前端套有 0.2 μm 過濾篩的針 筒內，分批倒入容積為 1.5 mL 的離心管後放入－20℃的冷凍 櫃保存即完成氨苄青黴素的配製。
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ii. 培養菌種:
我們使用的大腸桿菌菌種是由台大管永恕老師所提供的大 腸桿菌 TOP 10，其內含有質體 pBluescript II SK(+/-)，帶有 能抵抗氨苄青黴素的基因。
若要得生長曲線中對數期的細菌，則必須在實驗前一天培養 所需的菌種，其操作步驟如下：首先取 5 mL 的 LB 液至容積 為 15 mL 的試管中，加入 5 μL 的氨苄青黴素，接著在無菌 操作台內操作，用火烤消毒過後的 tip 挑起培養好的菌落後 連同 tip 一起放入試管內，放入振盪培養箱，在 37℃、200 轉的環境下隔夜培養即完成操作。培養後的菌種若日後還需 使用，可放入 4℃的冷藏櫃保存，保存期限大約為一星期左 右。
iii. 大腸桿菌的培養:
一般養菌是以 1 體積的菌種和 50 體積的溶液來進行培養，
其操作步驟如下：首先取培養好的菌種 100 μL 至容積為 15 mL 的試管中，加入 4.9 mL 的 LB 液與 5 μL 的氨苄青黴素，
接著放入振盪培養箱，在 37℃、200 轉的環境下培養 3~4 個 小時即可得到生長曲線中對數期的菌液。
iv. 吸光值的測定:
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當光照射到細胞上時會發生散射(圖 3.1)，由於細胞個體的大 小基本上是一致的，所以光散射的程度會與細胞的濃度成正 比。穿透光線的強度以透射率(transmittance)來表示，一般儀 器則是以透射率倒數的對數值來表示吸光度(absorbance)，或 稱為光密度(optical density or OD)。在養菌的過程中，若要達 到對數期的 OD600值是在 0.3~0.6 之間。如圖 3.2 所示，一般 要達到 OD600值為 0.3~0.6 所需的時間至少要 180 分鐘。
圖 3.1 濁度與吸光值的測定 [21]
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optical density
time (min) 不同，可分為液態培養基(liquid medium)和固態培養基(solid medium)；若依照用途來劃分，則可分為基礎培養基(minimum medium)、鑑別培養基(differential medium)及選擇培養基 (selective medium)。在培養基中加入抗生素以抑制細菌的生 長是屬於選擇培養基的一類。
而固態培養基的配製方法為在液態培養基中加入一些
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凝固劑即可，目的在於方便活菌的計數及菌種的保存，在此 實驗中是在每公升液態 LB 中再加入 15 克的瓊脂(agar)。
首先量取 12.5 g 的 LB Broth Miller 和 7.5 g 的瓊脂至容 積為 1000 mL 的錐形瓶中，加入二次去離子水至 500 mL，
高溫高壓滅菌後待溫度回到 40~50℃時，再加入預先配好的 氨苄青黴素500 μL。將溶液倒入培養皿，每盤大約 10 mL，
靜置一天後放入 4℃的冷藏櫃保存，保存期限大約為二、三 個月左右。
vi. 稀釋&塗菌&計數:
將稀釋適當的樣品塗布在固態 LB 上，培養後活細胞能 形成清晰的菌落，透過計算菌落數就可知道樣品中的活菌數。
在菌落與菌落間互不接觸的情況下，則可認定每一個菌落是 源於一個細胞。在計數的過程中，樣品的稀釋度控制在菌落 數為 30~300 個範圍內時，將能得到最好的結果。
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圖 3.3 稀釋流程圖
稀釋的步驟如下：如圖 3.3 所示，取吸光值達 0.6 的菌液 100 μL 與 900 μL 的 LB 液均勻混合，接著在無菌操作台內操 作，用 70%酒精和火烤消毒過後的塗佈玻棒將混合均勻的菌 液 100 μL 塗抹在固態 LB 上，放入振盪培養箱，在 37℃的環 境下隔夜培養即可得到稀釋 10 倍的菌落數。重複上述的步驟 依序可得稀釋 100 倍、1000 倍、10000 倍及 100000 倍的菌落 數。圖 3.11 是稀釋至 10000 倍的培養基。實驗得知，每 100 μL 的菌液中大約有 107數量級的大腸桿菌。
OD = 0.6 的菌液 1 mL
10 X 取 100 μL 的菌液 + 900 μL LB
取 100 μL 塗在固態 LB 上
取 100 μL 稀釋 10 倍的菌液 + 900 μL LB
100 X 取 100 μL 塗在固態 LB 上
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圖 3.4 稀釋 10000 倍的培養基
3-2 微流道系統(Micro-fluid system)流道製程
隨著微機電製程技術的發展，利用此技術製成各式微小元件(EX:
微流道系統)以應用於各項醫療領域上，傳統上微型元件多以矽晶片 當作基材，但矽基材雖然精確性高，卻有昂貴、製程複雜且與生物相 容性不高等缺點，長期而言具有生物毒性加上材料不透光，不易觀察 及訊號檢測，而玻璃以及高分子材料具有良好的透光性、生物相容性、
抗化學腐蝕以及製程方式簡單等優點，故本實驗採用玻璃以及高分子 材料製作微型流道以用於滅菌。
由於本次實驗所使用的雷射其尖峰能量密度相當高，原本期望凡 是接受過飛秒雷射脈衝照射過的大腸桿菌能立即死亡，故設計尺寸相 當於雷射聚焦光點的微流道系統，使所有通過系統的大腸桿菌都能接 收飛秒雷射脈衝。以下將介紹微流道系統製程。
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首先由 Auto-CAD 軟體設計並繪製微流道尺寸且製作成塑膠 光罩，其解析度可達 4000~25000dpi，最小線徑可達 10μ m；再以光 微影技術進行 SU-8 光阻在矽晶圓基材上的微流道結構成型，來製作 SU-8 光阻微細流道面板，進而翻鑄成微流道模具[24]。
本製程中的設備是利用中央研究院黃光室設備(圖 3.5)，利用曝 光機進行各項參數控制以得到高深寬比、高均勻性及表面粗糙度良好 的微細流道面板，設計的微流道尺寸如圖 3.6。
圖 3.5 曝光機(型號: EV620)，臭氧清洗機
圖 3.6 微流道尺寸圖
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7. 曝光：曝光主要之目的是使負光阻產生鍵結，曝光時間其理論公 式為： 曝光時間 = 曝光劑量 / 曝光機功率 ，若顯影後 線寬較所設計之線寬小，則是曝光過度，反之，若顯影後 線寬過大，則是曝光不足（如圖 3.8、圖 3.9）；本實驗所選 擇之曝光劑量為 160 mJ/cm2。經光度能量計量測得汞燈功 率為 13 mW/cm2，因此預測曝光時間為 12-13 秒之間。
圖 3.8&圖 3.9 曝光量過量&曝光量不足
8. 曝後烤：負光阻通常都會較正光阻多一道曝後烤程序，因為負光 阻需要使其受光部分的鍵結更加完全，才不至於使圖形 在顯影時被溶解掉；利用 65℃與 90℃兩階段之溫度進行 曝後烤。
9. 顯影：底部之光阻會因厚度的增加而較難顯影；因此為了幫助顯 影，可利用超音波振盪器來幫助顯影。
10. 定影：將浸置完顯影液之晶圓放入異丙醇(i sopropano1, IPA)一分 鐘，將已顯影後之微結構做定影，再用去離子水(DI water ) 沖洗之後用氮氣槍吹乾，即可完成定影程序。但是如果於 定影時發現晶圓上有白色液體，則表示顯影時間不足，需 再回到顯影與定影之程序，直至無白色液體產生為止。
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11. 硬烤：以 120℃來進行硬烤，使光阻能堅固的依附在晶片的表面 上。
12. 填充 PDMS：在純矽 wafer 上做完流道圖形再用 PDMS(比例 10:1) 填充，靜置一夜使其固化(也可放置 60 ℃ 烤箱內 加速固化)。
13. 清洗流道：第二天將固化的 PDMS 剝離並打洞，再將 PDMS 與 載玻片放入臭氧 plasma cleaner，通氣 15 分鐘。
14. 黏合：盡快將 PDMS 與蓋玻片黏合，並於 60 ℃烤箱靜置一夜即 可完成，完成示意圖如圖 3.10。
圖 3.10 Micro-fluid 流道完成示意圖
3-3 毛細管系統(Capillary system)流道製程
由於微流道系統尺寸小單位時間能處理的菌液量少、耗費時間、
並沒有完整的利用雷射光束且製程仍稍嫌繁瑣，故想到將流道尺寸加 大，期望單位時間處理的菌液量增加、妥善利用雷射光束且簡化製程，
因此設計毛細管系統(Capillary system)。
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實驗步驟
1. 準備材料：準備塑膠器皿與毛細管，將毛細管黏在塑膠器皿底部。
2. 填充 PDMS：用 PDMS(比例 10:1)填充入塑膠器皿中，靜置一夜使 其固化(也可放置 60 ℃ 烤箱內加速固化)。
3. 清洗流道：第二天將固化的 PDMS 剝離並打洞，再將 PDMS 與載 玻片放入臭氧 plasma cleaner，通氣 15 分鐘。
4. 黏合：盡快將 PDMS 與蓋玻片黏合，並於 60 ℃烤箱靜置一夜即 可完成，完成示意圖如圖 3.11。
圖 3.11 Capillary 流道完成示意圖
3-4 可見光飛秒雷射實驗裝置
本實驗所使用的雷射系統為 Mode-Locked Femtosecond Titanium : Sapphire Laser ( 型號為 Model Trestles –LH6)，能量輸出為 800mW，
波長為 830nm，經由倍頻系統可以輸出波長為 415nm 能量為 250mW 的光，而實際上樣品接收到的能量強度由功率計測量。實驗裝置圖如 圖 3.12。
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圖 3.12 實驗光路架設圖
SH Generator : 倍頻系統( second harmonic generator )
3-5 可見連續光殺菌機制
最強的可見光和連續長時間照射的可見光會導致光氧化作用 (photooxidation)而殺死微生物細胞，一種稱為光敏劑(photosensitizer) 的色素和氧參與這個過程。微生物都具有色素，如葉綠素(chlorophyll)、
菌綠素(bacteriochlorophyll)、細胞色素(cytochrome)和黃素(flavin)等。
這些色素可以吸收光能並被活化成激發態的光敏劑(P)，激發態的光 敏 劑 會 將 能 量 傳 遞 給 氧 產 生 單 重 態 氧 (singlet oxygen) ( 反 應 如 下)[25]。
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P 可見光→ P (激發態) P (激發態) + O2 → P + O1 2
單重態氧是強氧化劑，會攻擊細胞內的脂肪分子，迅速破壞細胞 造成菌體的死亡。許多空氣傳播性微生物或生活在暴露於物體表面的
單重態氧是強氧化劑，會攻擊細胞內的脂肪分子，迅速破壞細胞 造成菌體的死亡。許多空氣傳播性微生物或生活在暴露於物體表面的