研究超快雷射照射大腸桿菌之滅菌效率

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(1)國立臺灣師範大學物理研究所碩士論文. 指導教授：賈至達. 博士. (Chih-Ta Chia, Ph.D.) 林宮玄博士 (Kung-Hsuan Lin, Ph.D.) Investigation the efficiency of inactivation of Escherichia coli bacteria irradiated by ultrashort laser pulses 研究超快雷射照射大腸桿菌之滅菌效率. 研究生：郭惟寧撰中華民國一百零三年一月.

(2) 致謝首先誠摯的感謝指導教授賈至達博士及林宮玄博士，兩位老師的教導帶領我進入生物物理的領域，不時的討論並指點我正確的方向，使我在這些年中獲益匪淺。本論文的完成另外亦得感謝周家復老師實驗室的佩宜學姊及 UFO 超快光電研究所郁儒學長大力協助。因為有你們的幫忙，使得本論文能夠更完整而嚴謹。這段日子，實驗室裡共同的生活點滴，學術上的討論，感謝眾位學長姐、同學的共同砥礪，有你們的陪伴讓我的研究生活不孤單。特別感謝杰翰學長不厭其煩的指出我實驗中的缺失，並時常與我討論研究方向且總能在我迷惘時為我解惑，也感謝楊濟源同學的幫忙與支持，多虧有你們的支持讓我順利完成研究。沒有你們的幫助這段日子將是完全不一樣的光景。最後，謹以此文獻給我的父親母親，謝謝父親母親在家境不是特別寬裕的日子也持續支持我取得學位。. i.

(3) 摘要此論文是研究飛秒雷射照射後，大腸桿菌活性降低的效率研究。實驗中利用 30μm 寬的微流道系統與 800μm 寬的毛細管系統 (Capillary system)作為大腸桿菌接受飛秒雷射作用的流道。實驗時使用能量為 250mW、波長為 415nm 的飛秒雷射脈衝照射大腸桿菌。此脈衝是由 100fs，波長 830nm 的鈦-藍寶石雷射經由倍頻輸出而獲得。實驗結果顯示毛細管系統(Capillary system)的細菌量衰減對數 (Log reduction )在 5 小時內可達到 6，也就是說由每毫升3.7 × 107 個大腸桿菌經 5 小時照射後，具有活性的細菌數目小於 10。. 關鍵字：大腸桿菌、微流道系統、飛秒雷射、滅菌、細菌、輻射. ii.

(4) Abstract In this study, the efficiency of inactivation of Escherichia coli by femtosecond laser irradiation is investigated. Utilized the capillary and PDMS micro-molding fluidic system, the dependence of the efficiency of inactivation of Escherichia coli on the fluence of femtosecond laser is reported, and we found the 6-log viability reduction can be reached within 2-hour irradiation by femtosecond laser with laser output 250 mw and 415 nm in wavelength.. Key words: Escherichia coli, micro-molding fluidic system, femtosecond laser, inactivation of bacteria, bacteria, irradiation. iii.

(5) 目錄致謝 ...................................................................................................... I 摘要 ..................................................................................................... II ABSTRACT ....................................................................................... III 目錄 .................................................................................................... IV 圖目錄 ................................................................................................ VI 表目錄 ................................................................................................ IX 第一章緒論........................................................................................ 1 第二章研究背景 ................................................................................ 8 第三章實驗儀器設備及其基本原理 ................................................ 10 3-1 大腸桿菌培養 ............................................................................. 10 3-2 微流道系統(MICRO-FLUID SYSTEM)流道製程 ............................ 17 3-3 毛細管系統(CAPILLARY SYSTEM)流道製程 ................................ 22 3-4 可見光飛秒雷射實驗裝置 .......................................................... 23 3-5 可見連續光殺菌機制 ................................................................. 24 3-6 光通量(FLUENCE)計算 ................................................................ 25 第四章實驗結果與討論 ................................................................... 31 iv.

(6) 4-1 大腸桿菌去活化分析 ................................................................. 31 4-2 臨界能量&臨界光通量 .............................................................. 42 4-3 最佳化設計流道 ......................................................................... 47 第五章結論與未來展望 ................................................................... 49 參考文獻 ........................................................................................... 52. v.

(7) 圖目錄圖 1.1 原生型和突變型沙門氏桿菌細菌量衰減對數對雷射光通量圖[10,12] ............................................................................................. 4 圖 1.2 雙鏈 DNA 做電泳實驗 ......................................................... 5 圖 2.1 用可見光飛秒雷射照射病原體的實驗裝置 ......................... 8 圖 3.1 濁度與吸光值的測定 [21].................................................. 13 圖 3.2 光密度與培養時間關係圖[21] ............................................ 14 圖 3.3 稀釋流程圖.......................................................................... 16 圖 3.4 稀釋 10000 倍的培養基 ...................................................... 17 圖 3.6 微流道尺寸圖...................................................................... 18 圖 3.7 轉速與時間之關係圖 .......................................................... 20 圖 3.8&圖 3.9 曝光量過量&曝光量不足 ...................................... 21 圖 3.10 Micro-fluid 流道完成示意圖 ............................................. 22 圖 3.11 Capillary 流道完成示意圖 ................................................ 23 圖 3.12 實驗光路架設圖 ................................................................ 24 圖 3.13 FWHM 示意圖 .................................................................. 26 圖 3.14 微流道放大示意圖 ............................................................ 26 圖 3.15 Gaussian Beam 示意圖[26]................................................ 28 vi.

(8) 圖 3.16 毛細管系統流道有效作用區域示意圖 ............................. 29 圖 4.1 微流道系統:光通量對數相對於細菌數的對數做圖 .......... 32 圖 4.2 毛細管系統:光通量對數相對於細菌數的對數做圖 .......... 32 圖 4.3 微流道系統&毛細管系統:光通量取對數相對於細菌數的對數做圖 ............................................................................................... 33 圖 4.4 微流道系統固定光通量改變混合速度 .... 錯誤! 尚未定義書. 籤。圖 4.5 微流道系統:消滅單位細菌所需能量對細菌數取對數做圖。 ........................................................................................................... 35 圖 4.6 毛細管系統:消滅單位細菌所需能量對細菌數取對數做圖。 ........................................................................................................... 36 圖 4.7 微流道系統&毛細管系統:消滅單位細菌所需能量對細菌數取對數做圖。 ................................................................................... 37 圖 4.8 微流道系統&毛細管系統:消滅單位細菌所需能量取對數相對於細菌數取對數做圖。 ................................................................ 37 圖 4.9 微流道系統:消滅單位細菌所需脈衝數對於細菌數取對數做圖 ....................................................................................................... 39 圖 4.10 毛細管系統:消滅單位細菌所需脈衝數對細菌數取對數做圖 ....................................................................................................... 40 圖 4.11 微流道系統&毛細管系統:消滅單位細菌所需脈衝數相對 vii.

(9) 於細菌數取對數做圖。 .................................................................... 40 圖 4.12 微流道系統&毛細管系統:消滅單位細菌所需脈衝數取對數相對於細菌數取對數做圖。 ........................................................ 41 圖 4.13 毛細管系統: 臨界光通量示意圖 ..................................... 43 圖 4.14 毛細管系統:臨界能量密度示意圖.................................... 46 圖 4.15 最佳化流道示意圖 ............................................................ 47. viii.

(10) 表目錄. 表 1-1 使用飛秒脈衝雷射（雷射曝光時間=3.6 秒）作用於各種微生物的消滅效率 ·······································································2 表 1-2 超短脈衝雷射可用來可消滅病毒或細菌的臨界能量密度 ........3 表 3.1 清洗步驟 ....................................................................................19. ···························································································································. ix.

(11) 第一章緒論目前為止儘管已經發展了許多對抗傳染病的抗菌方法，但微生物病原體仍不斷進化且產生抗藥性。此外，新出現的病原體，如 20 世紀 80 年代出現的人類免疫缺陷病毒（HIV）[1]和西尼羅河病毒（West Nile Virus）[2]仍構成威脅。因此，迫切需要新的，更有效的病原體消滅方法。利用超短脈衝雷射（USP Laser）選擇性滅菌是一種很有潛力的滅菌方法。USP 雷射治療已被證明能消滅多種病毒包括愛滋病毒，流感病毒，人類乳頭瘤狀病毒（ HPV ），小鼠諾羅病毒（ Murine Noroviruses），A 型肝炎病毒（HAV），腦心肌炎病毒（EMCV），煙草嵌紋病毒（TMV）和 M13 噬菌體，以及細菌如大腸桿菌，沙門氏桿菌（Salmonella），李斯特氏菌（Listeria）[3-11]。以下是用超短脈衝雷射消滅病原體的優點: ( 1 )一般常規方法，是製造出能對抗新的、突變的微生物。與此相反，超短脈衝雷射能有效地消滅包膜（ enveloped ）病毒、無包膜（non-enveloped）病毒、單鏈 DNA 病毒、雙鏈 DNA 病毒、RNA 病毒、革蘭氏陽性細菌（gram-positive bacteria）、革蘭氏陰性細菌（gramnegative bacteria）[12]。這表示超短脈衝雷射可以消滅病毒與細菌病 1.

(12) 原體，不因結構組成或是突變狀態而失效。在消滅病毒方面，超短脈衝雷射的機制是在病毒外殼上產生力學震動，病毒的蛋白質外殼上脆弱的鍵結受此影響造成病毒失去感染性；在消滅細菌方面，超短脈衝雷射的機制是作用在螺旋狀雙鏈 DNA 上，造成螺旋狀雙鏈 DNA 損傷，進而死亡。如表 1 所示[12]，各種病毒和細菌已被證明可以有效地用超短脈衝雷射消滅。表 1-1 使用飛秒脈衝雷射（雷射曝光時間=3.6 秒）作用於各種微生物的消滅效率 Microorganism. Properties. Load Reduction. Enveloped, single-stranded RNA. 104. Influenza Virus. Enveloped, single-stranded RNA. 105. Encephalomyocarditis Virus (EMCV). Non-enveloped, single-stranded RNA. 103. Murine norovirus (MNV). Non-enveloped, single-stranded RNA. 103. Hepatitis A virus (HAV). Non-enveloped, single-stranded RNA. 103. Human Papillomavirus (HPV) Non-enveloped, single-stranded DNA. 105. Human Immunodeficiency Virus(HIV). M13 bacteriophage. Non-enveloped, single-stranded DNA. 105. Escherichia coli. Gram negative. 104. Salmonella typhi. Gram negative. 105. Listeria monocytogenes. Gram positive. 103. Enterobacter Sakazakii. Gram negative. 103. ( 2 )現有的滅菌方法，例如:紫外光照射、γ 射線照射、UV 光化學、微波吸收和藥學方面的抗病毒藥、抗細菌藥，這些都是無選擇性的，所以隨著治療還會伴隨副作用，而另一方面超短脈衝雷射已經被證實 2.

(13) 可以消滅病毒、細菌等微生物，同時也不會損傷既有的物質例如乳動物細胞和蛋白質[3,6,9]，即是說超短脈衝雷射技術能夠選擇性地滅菌，因此，具有最小的潛在的副作用。表 2 顯示對各種微生物用近紅外光的超短脈衝雷射的選擇性實驗結果[12]。值得一提的是，雷射能量密度 1~10 GW/cm2 是超短脈衝雷射的療效區間（therapeutic window），在這範圍內的能量密度可以消滅各種病原體的同時保持哺乳動物細胞不受傷害，產生選擇性。表 1-2 超短脈衝雷射可用來可消滅病毒或細菌的臨界能量密度 Viruses and Cells M13. TMV. HPV. HIV. Threshold Laser Power Density 0.06 for Inactivation (GW/cm2). 0.85. 1. 1.1. Human Red Human Jurkat. Mouse. Blood Cell. T-cell. Dendritic Cell. 15. 22. 12. ( 3 ) 由於超短脈衝雷射滅菌的性質，超短脈衝雷射的機制對病原體去氧核酸核酸 ( 螺旋植體 DNA ) 突變這微小變化不敏感但易受外殼震動的影響，即是說超短脈衝雷射的機制可用來消滅活原生型（wild-type）、突變型和已產生抗藥性的微生物，例如 M13 噬菌體，其原生型與改造型都可有效地被超短脈衝雷射消滅[9]。這樣的特性使得超短脈衝雷射技術特別適合於快速進化的、產生抗藥性的病毒和細菌，例如 HIV 和 MRSA。 3.

(14) ( 4 ) 目前使用的降低病原體的方法（在在血液中加入藥劑）通常會產生額外的有毒或致癌化學物質。這些化學品會保留在輸血產品內。此外，很可能這些化學物質會與產品本身產生相互作用，改變其結構或功能[13]，而超短脈衝雷射技術在病原體減少過程中不引入化學品。這使得超短脈衝雷射技術這方法安全又環保，而且便於處理那些人類所使用的產品，如血液製品，藥品和疫苗。 2010 年為了深入了解滅菌機制 Kong T. Tsen 用超短脈衝雷射對突變的沙門氏桿菌（Salmonella）進行滅菌實驗。該突變體缺乏 RecA 蛋白（負責的維修受損的 DNA）。換句話說，該突變體對 DNA 的損傷很敏感，圖 1.1 顯示顯示了原生型和突變型沙門氏桿菌被可見光超短脈衝雷射照射後雷射光通量與損傷數量關係[10，12]。. 圖 1.1 原生型和突變型沙門氏桿菌細菌量衰減對數對雷射光通量圖 [10,12]Tsen KT, Tsen et al. :Studies of inactivation of encephalomyocarditis virus, M13 bacteriophage and 4.

(15) Salmonella typhimurium by using a visible femtosecond laser irradiation: Insight into the possible inactivation mechanisms. 一般來說，在接收相同劑量的雷射光通量情況下原生型的細菌衰減量對數會較突變型的高。特別是在光通量為 800J/cm2 時突變型沙門氏桿菌的細菌衰減量對數減少 5，但在接收相同光通量下原生型只減少 0.5，因為兩種沙門氏桿菌的差別只在於是否存在 RecA 蛋白（修復受損 DNA），因此實驗顯示可見光超短脈衝雷射會造成 DNA 損傷隨即使沙門氏桿菌死亡。圖 1.2 顯示結果為:通過電泳方法觀察雙鏈 DNA 經過超短脈衝雷射照射前後的結果[10]，實驗對照組（標記為 NO.1）顯示三條暗帶，分別對應圓型、線型和超螺旋型雙鍊 DNA， NO.2 顯示攪拌會造成輕微的相對暗度改變，而受超短脈衝雷射照射的樣品（標記為 NO.3）顯示三個暗帶的相對暗度被大大改變。. 圖 1.2 雙鏈 DNA 做電泳實驗（NO.1:雙鏈 DNA 的對照組，NO.2: 雙鏈 DNA 的對照組經磁攪拌子攪拌，NO.3: 雙鏈 DNA 經超短脈衝雷射照射以及攪拌） [10，13]。Tsen KT, Tsen et al. Studies of inactivation of 5.

(16) encephalomyocarditis virus, M13 bacteriophage and Salmonella typhimurium by using a visible femtosecond laser irradiation: Insight into the possible inactivation mechanisms. 這些數據顯示，可見光飛秒雷射照射主要造成超螺旋雙鏈 DNA 鬆開，以產生環狀雙鏈 DNA。因為強制改變 DNA 的超螺旋狀態可以破壞細胞代謝，從而導致細胞死亡，這種使細菌內部超螺旋 DNA 鬆開從而死亡的方法是其中一種可見光超短脈衝雷射照射細菌使其死亡的機制。已經知道，在連續波可見光照射下細菌內細胞中的卟啉分子（porphyrin molecules）受到光刺激導致產生活性氧（ROS），活性氧主要成分是單重態氧（singlet oxygen），因此會損傷 DNA 造成細菌死亡[14-19]。因此可見光超短脈衝雷射消滅細菌的另一個機制是光照射下產生活性氧（ROS）。目前較廣為人知的殺菌機制就是以上討論的兩種機制。本論文其他章節大綱介紹如下：第二章為研究背景，探討過去用超短脈衝雷射技術對沙門氏桿菌（Salmonella）所做的殺菌效率成果。第三章為實驗樣品製備、儀器設備及其基本原理，包含大腸桿菌介紹與製備流程、塗佈機、曝光機（Mask aligner）、臭氧機、飛秒脈衝雷射。第四章為實驗結果與討論，我們著重於光通量、脈衝數、對殺菌效果的數據分析，探討不同劑量 6.

(17) 對殺菌率的影響，從而找出最佳化流道設計，提高殺菌效率。第五章為結論與未來展望。. 7.

(18) 第二章研究背景. 2007 年 Shaw-Wei D. Tsen 與 K.T. Tsen 用可見光飛短脈衝雷射對大腸桿菌做殺菌實驗[20]，其效率為每小時能處理 100μl 的菌液（細菌衰減量對數達到 2.45）。在這項實驗中所用的雷射光源是二極管幫浦連續波鎖模-鈦-藍寶石（Ti-sapphire）雷射。該雷射可產生連續的寬度為80 × 10−15 秒的脈衝（脈波重複率為80 × 106 赫茲）。. mirror. Laser 850nm vial. mirror magnetic stir plate. 圖 2.1 用可見光飛秒雷射照射病原體的實驗裝置如圖 2.1 所示，鈦-藍寶石（Ti-sapphire）雷射輸出光照射在樣品上。此雷射選定的工作波長為 800nm，平均能量為 100mW，其脈衝的半高寬（full-width at half maximum =FWHM ）為80 × 10−15 秒， 8.

(19) 一個可消色差的透鏡將雷射聚焦成約直徑 100μm 的光束且打在樣品上（將 100μml 的菌液裝在 Pyrex 小玻璃瓶中）。為了使雷射與病原體大腸桿菌間的交互作用更順利，在瓶（vial）中放入磁攪拌子，經由攪拌使沙門氏桿菌與光子能順利進行交互作用。樣品的雷射照射時間為一小時，溫度為 25˚C，大腸桿菌的數目為 300 個，大腸桿菌的的存活測定為計算在瓊脂上生長的菌落數。大腸桿菌的殺菌實驗結果如圖 2.2 所示，只要尖峰能量密度在 1GW/cm2 以上，一小時的照射時間內可處理 100μl 的菌液使其細菌衰減量對數達到 2.45。因此我們將以此效率做基準，設計新的系統，以相同時間內處理更大量菌液為目標。. 圖 2.2 菌落數目對雷射能量密度做圖 9.

(20) 第三章實驗儀器設備及其基本原理本次實驗主要分為光通量與脈衝數對殺菌數目分析，接下來我們將介紹所使用的儀器以及運作原理。. 3-1 大腸桿菌培養大腸桿菌的學名為 Escherichia coli，通常簡寫爲 E. coli，是由德國細菌學家 Theodor Escherich 發現，而將其名字拉丁化為 Escherichia，至於 coli 是指大腸(colon)的意思[21-23]。大腸桿菌的大小約 1 μm3，重量約 10-12 g，屬於革蘭氏陰性菌，為人體內最多的細菌。大腸桿菌在自然界的生存力強，最適合生長的溫度為 37℃，在冷藏的環境下可存活一個月左右；但不耐熱，以 60 ℃作用 15~20 分鐘即可致死。. 大腸桿菌製備流程. 準備液態 LB 與氨苄青黴素培養菌種大腸桿菌的培養吸光值的測定準備培養基(固態 LB 與氨苄青黴素) 稀釋塗菌計數. i.. 準備液態 LB 與氨苄青黴素: LB 為 Giuseppe Bertani 所發明的，每 25 g 的 LB Broth 10.

(21) Miller 中含有 10 g 的胰蛋白腖(tryptone)、5 g 的酵母菌萃取物(yeast extract)和 10 g 的氯化鈉(sodium chloride)。氨苄青黴素(ampicillin)是一種抗生素，能滲透革蘭氏陽性菌及部分革蘭氏陰性菌，阻礙細菌合成細胞壁的第三和最終階段，造成細胞裂解死亡。 LB 液是細菌的培養液，通常是以每公升溶劑中加入 25 克的 LB Broth Miller 之比例來配置。首先量取 5 g 的 LB Broth Miller 至容積為 250 mL 的血清瓶中，加入二次去離子水至 200 mL，高溫高壓滅菌後放入 4℃的冷藏櫃保存，保存期限大約為六個月左右。在培養基中加入抗生素的目的是用來抑制不需要的微生物，有利所需微生物的生長，而抗生素的配製方式則是在每毫升的溶劑中加入 50 毫克的氨苄青黴素粉末。首先量取保存在 4℃冷藏櫃中的氨苄青黴素粉末 0.5 g 至容積為 15 mL 的離心管中，加入 5 mL 95%的酒精與 5 mL 的二次去離子水，接著放在振盪機上攪拌直到氨苄青黴素完全溶解為止。將所配得的溶液倒入前端套有 0.2 μm 過濾篩的針筒內，分批倒入容積為 1.5 mL 的離心管後放入－20℃的冷凍櫃保存即完成氨苄青黴素的配製。 11.

(22) ii.. 培養菌種: 我們使用的大腸桿菌菌種是由台大管永恕老師所提供的大腸桿菌 TOP 10，其內含有質體 pBluescript II SK(+/-)，帶有能抵抗氨苄青黴素的基因。若要得生長曲線中對數期的細菌，則必須在實驗前一天培養所需的菌種，其操作步驟如下：首先取 5 mL 的 LB 液至容積為 15 mL 的試管中，加入 5 μL 的氨苄青黴素，接著在無菌操作台內操作，用火烤消毒過後的 tip 挑起培養好的菌落後連同 tip 一起放入試管內，放入振盪培養箱，在 37℃、200 轉的環境下隔夜培養即完成操作。培養後的菌種若日後還需使用，可放入 4℃的冷藏櫃保存，保存期限大約為一星期左右。. iii.. 大腸桿菌的培養: 一般養菌是以 1 體積的菌種和 50 體積的溶液來進行培養，其操作步驟如下：首先取培養好的菌種 100 μL 至容積為 15 mL 的試管中，加入 4.9 mL 的 LB 液與 5 μL 的氨苄青黴素，接著放入振盪培養箱，在 37℃、200 轉的環境下培養 3~4 個小時即可得到生長曲線中對數期的菌液。. iv.. 吸光值的測定: 12.

(23) 當光照射到細胞上時會發生散射(圖 3.1)，由於細胞個體的大小基本上是一致的，所以光散射的程度會與細胞的濃度成正比。穿透光線的強度以透射率(transmittance)來表示，一般儀器則是以透射率倒數的對數值來表示吸光度(absorbance)，或稱為光密度(optical density or OD)。在養菌的過程中，若要達到對數期的 OD600 值是在 0.3~0.6 之間。如圖 3.2 所示，一般要達到 OD600 值為 0.3~0.6 所需的時間至少要 180 分鐘。. 圖 3.1 濁度與吸光值的測定 [21]. 13.

(24) 0.7. optical density. 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0. 50. 100 150 time (min). 200. 250. 圖 3.2 光密度與培養時間關係圖[21] 楊盛行等譯，Lansing M. Prescott, John P. Harley, and Donald A.Klein 著 v.. 準備培養基(固態 LB 與氨苄青黴素): 培養基(culture medium)是適合微生物生長繁殖的營養物質，無論是以微生物為材料的研究，還是利用微生物生產的生物製品，都必須先進行培養基的配製。根據物理狀態的不同，可分為液態培養基(liquid medium)和固態培養基(solid medium)；若依照用途來劃分，則可分為基礎培養基(minimum medium)、鑑別培養基(differential medium)及選擇培養基 (selective medium)。在培養基中加入抗生素以抑制細菌的生長是屬於選擇培養基的一類。而固態培養基的配製方法為在液態培養基中加入一些 14.

(25) 凝固劑即可，目的在於方便活菌的計數及菌種的保存，在此實驗中是在每公升液態 LB 中再加入 15 克的瓊脂(agar)。首先量取 12.5 g 的 LB Broth Miller 和 7.5 g 的瓊脂至容積為 1000 mL 的錐形瓶中，加入二次去離子水至 500 mL，高溫高壓滅菌後待溫度回到 40~50℃時，再加入預先配好的氨苄青黴素 500 μL。將溶液倒入培養皿，每盤大約 10 mL，靜置一天後放入 4℃的冷藏櫃保存，保存期限大約為二、三個月左右。 vi.. 稀釋&塗菌&計數: 將稀釋適當的樣品塗布在固態 LB 上，培養後活細胞能形成清晰的菌落，透過計算菌落數就可知道樣品中的活菌數。在菌落與菌落間互不接觸的情況下，則可認定每一個菌落是源於一個細胞。在計數的過程中，樣品的稀釋度控制在菌落數為 30~300 個範圍內時，將能得到最好的結果。. 15.

(26) 取 100 μL 的菌液 + 900 μL LB. 取 100 μL 塗在固態 LB 上 10 X. OD = 0.6 的菌液 1 mL 取 100 μL 稀釋 10 倍的菌液 + 900 μL LB. 取 100 μL 塗在固態 LB 上 100 X. 圖 3.3 稀釋流程圖稀釋的步驟如下：如圖 3.3 所示，取吸光值達 0.6 的菌液 100 μL 與 900 μL 的 LB 液均勻混合，接著在無菌操作台內操作，用 70%酒精和火烤消毒過後的塗佈玻棒將混合均勻的菌液 100 μL 塗抹在固態 LB 上，放入振盪培養箱，在 37℃的環境下隔夜培養即可得到稀釋 10 倍的菌落數。重複上述的步驟依序可得稀釋 100 倍、1000 倍、10000 倍及 100000 倍的菌落數。圖 3.11 是稀釋至 10000 倍的培養基。實驗得知，每 100 μL 的菌液中大約有 107 數量級的大腸桿菌。. 16.

(27) 圖 3.4 稀釋 10000 倍的培養基. 3-2 微流道系統(Micro-fluid system)流道製程隨著微機電製程技術的發展，利用此技術製成各式微小元件(EX: 微流道系統)以應用於各項醫療領域上，傳統上微型元件多以矽晶片當作基材，但矽基材雖然精確性高，卻有昂貴、製程複雜且與生物相容性不高等缺點，長期而言具有生物毒性加上材料不透光，不易觀察及訊號檢測，而玻璃以及高分子材料具有良好的透光性、生物相容性、抗化學腐蝕以及製程方式簡單等優點，故本實驗採用玻璃以及高分子材料製作微型流道以用於滅菌。由於本次實驗所使用的雷射其尖峰能量密度相當高，原本期望凡是接受過飛秒雷射脈衝照射過的大腸桿菌能立即死亡，故設計尺寸相當於雷射聚焦光點的微流道系統，使所有通過系統的大腸桿菌都能接收飛秒雷射脈衝。以下將介紹微流道系統製程。 17.

(28) 首先由 Auto-CAD. 軟體設計並繪製微流道尺寸且製作成塑膠. 光罩，其解析度可達 4000~25000dpi，最小線徑可達 10μ m；再以光微影技術進行 SU-8 光阻在矽晶圓基材上的微流道結構成型，來製作 SU-8 光阻微細流道面板，進而翻鑄成微流道模具[24]。本製程中的設備是利用中央研究院黃光室設備(圖 3.5)，利用曝光機進行各項參數控制以得到高深寬比、高均勻性及表面粗糙度良好的微細流道面板，設計的微流道尺寸如圖 3.6。. 圖 3.5 曝光機(型號: EV620)，臭氧清洗機. 圖 3.6 微流道尺寸圖. 18.

(29) 製程原理藉由曝光機上汞燈所產生的光源照射於光罩上之圖案，使光罩上之圖案轉移至負型光阻( Photoresist )上面，並經由顯影( Develop )後，光阻圖案會和光罩上之圖案完全相同。製程步驟 1. 清洗晶片：去除晶片上之微粒、油漬與有機污染，增加光阻與基材之附著性。清洗步驟如表 3.1。表 3.1 清洗步驟步驟程序. 清洗液. 溫度. 時間. 備註. 步驟1. 去離子水. 室溫. 1 分鐘. 清洗. 步驟2. 丙酮. 室溫. 1 分鐘. 清洗油漬（超音波震洗）. 步驟3. 甲酫. 室溫. 1 分鐘. 清洗丙酮（超音波震洗）. 步驟4. 去離子水. 室溫. 1 分鐘. 清洗甲酫. 步驟5. 氮氣. 室溫. 1 分鐘. 吹乾水氣. 2. 去除晶片上之水分子：避免晶圓表面可能吸附水分，造成後續步驟形成薄氧化層而影響製程結果，以溫度 120℃ 加熱晶片約 5 分鐘。 3. 塗佈 SU-8 2025 光阻：光阻塗佈主要是將基材置於旋塗機腔體內，並利用真空幫浦於旋塗軸心抽真空以使基材固定，再利用高速的旋轉速度，使旋轉時產生的離心力，促使光阻由中心部分逐漸往外圍移動，以達到光阻劑均勻塗佈的目的。光阻的厚度與旋轉塗佈時的轉速成反比；最高轉速為 4000rpm，塗佈時間為 30 秒，轉 19.

(30) 速與時間之關係如圖 3.7 所示。 4. 靜置：SU-8 為高黏滯性之光阻且為熔融狀態，為使光阻表面能夠光滑平整，可將已塗佈好之晶片放置於平臺上，在軟烤步驟前先靜置，利用光阻本身的可流動性，來取得表面之光滑平整。. 轉速對時間作圖 4500 4000. 轉速(rpm/s). 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0. 10. 40. 60. 90. 120. 時間(s) 圖 3.7 轉速與時間之關係圖 5. 軟烤：以 3 分鐘由室溫慢慢加熱至 90℃後，再以 6 分鐘在 90℃ 進行軟烤，將光阻內部之溶劑以加熱方式來蒸發，並且可以帶走光阻內細小之氣泡。 6. 降溫：為了降低光阻內部之熱應力，所以在升降溫的階段都必須要格外的注意，特別是在降溫時，降溫太快會使熱應力加大，降溫要愈慢愈好，因此將其置放於加熱板上，使其慢慢降至室溫。 20.

(31) 7. 曝光：曝光主要之目的是使負光阻產生鍵結，曝光時間其理論公式為：曝光時間 = 曝光劑量 / 曝光機功率，若顯影後線寬較所設計之線寬小，則是曝光過度，反之，若顯影後線寬過大，則是曝光不足（如圖 3.8、圖 3.9）；本實驗所選擇之曝光劑量為 160 mJ/cm2。經光度能量計量測得汞燈功率為 13 mW/cm2，因此預測曝光時間為 12-13 秒之間。. 圖 3.8&圖 3.9 曝光量過量&曝光量不足 8. 曝後烤：負光阻通常都會較正光阻多一道曝後烤程序，因為負光阻需要使其受光部分的鍵結更加完全，才不至於使圖形在顯影時被溶解掉；利用 65℃與 90℃兩階段之溫度進行曝後烤。 9. 顯影：底部之光阻會因厚度的增加而較難顯影；因此為了幫助顯影，可利用超音波振盪器來幫助顯影。 10. 定影：將浸置完顯影液之晶圓放入異丙醇(i sopropano1, IPA)一分鐘，將已顯影後之微結構做定影，再用去離子水(DI water ) 沖洗之後用氮氣槍吹乾，即可完成定影程序。但是如果於定影時發現晶圓上有白色液體，則表示顯影時間不足，需再回到顯影與定影之程序，直至無白色液體產生為止。 21.

(32) 11. 硬烤：以 120℃來進行硬烤，使光阻能堅固的依附在晶片的表面上。 12. 填充 PDMS：在純矽 wafer 上做完流道圖形再用 PDMS(比例 10:1) 填充，靜置一夜使其固化(也可放置 60 ℃ 烤箱內加速固化)。 13. 清洗流道：第二天將固化的 PDMS 剝離並打洞，再將 PDMS 與載玻片放入臭氧 plasma cleaner，通氣 15 分鐘。 14. 黏合：盡快將 PDMS 與蓋玻片黏合，並於 60 ℃烤箱靜置一夜即可完成，完成示意圖如圖 3.10。. 圖 3.10 Micro-fluid 流道完成示意圖. 3-3 毛細管系統(Capillary system)流道製程由於微流道系統尺寸小單位時間能處理的菌液量少、耗費時間、並沒有完整的利用雷射光束且製程仍稍嫌繁瑣，故想到將流道尺寸加大，期望單位時間處理的菌液量增加、妥善利用雷射光束且簡化製程，因此設計毛細管系統(Capillary system)。 22.

(33) 實驗步驟 1. 準備材料：準備塑膠器皿與毛細管，將毛細管黏在塑膠器皿底部。 2. 填充 PDMS：用 PDMS(比例 10:1)填充入塑膠器皿中，靜置一夜使其固化(也可放置 60 ℃ 烤箱內加速固化)。 3. 清洗流道：第二天將固化的 PDMS 剝離並打洞，再將 PDMS 與載玻片放入臭氧 plasma cleaner，通氣 15 分鐘。 4. 黏合：盡快將 PDMS 與蓋玻片黏合，並於 60 ℃烤箱靜置一夜即可完成，完成示意圖如圖 3.11。. 圖 3.11 Capillary 流道完成示意圖. 3-4 可見光飛秒雷射實驗裝置本實驗所使用的雷射系統為 Mode-Locked Femtosecond Titanium : Sapphire Laser ( 型號為 Model Trestles –LH6)，能量輸出為 800mW，波長為 830nm，經由倍頻系統可以輸出波長為 415nm 能量為 250mW 的光，而實際上樣品接收到的能量強度由功率計測量。實驗裝置圖如圖 3.12。 23.

(34) 圖 3.12 實驗光路架設圖 SH Generator : 倍頻系統( second harmonic generator ). 3-5 可見連續光殺菌機制最強的可見光和連續長時間照射的可見光會導致光氧化作用 (photooxidation)而殺死微生物細胞，一種稱為光敏劑(photosensitizer) 的色素和氧參與這個過程。微生物都具有色素，如葉綠素(chlorophyll)、菌綠素(bacteriochlorophyll)、細胞色素(cytochrome)和黃素(flavin)等。這些色素可以吸收光能並被活化成激發態的光敏劑(P)，激發態的光敏劑會將能量傳遞給氧產生單重態氧 (singlet oxygen) ( 反應如下)[25]。 24.

(35) 可見光. P →. P (激發態). P (激發態) + O2 → P + 1O2 單重態氧是強氧化劑，會攻擊細胞內的脂肪分子，迅速破壞細胞造成菌體的死亡。許多空氣傳播性微生物或生活在暴露於物體表面的微生物會利用類胡蘿蔔素(carotenoid)來保護它們免於受到光氧化作用的破壞。類胡蘿蔔素可以吸收單重態氧的能量並使其轉變成原來的基態氧，有效紓解單重態氧的傷害。. 3-6 光通量(Fluence)計算微流道系統. 光通量(Fluence)定義為單位面積接收到的能量，與照射時間相關。由於光通量是生物領域常用單位，前人論文多用此單位討論實驗結果，故本次實驗也將討論殺菌率與光通量關係，期望能互相比較。要算光通量首先要測量雷射光點大小( 使用刀片量法，取雷射強度為最大值一半時的寬度，即為 FWHM。如圖 3.13 )，並假設流道中所有細菌接收到的雷射強度相同( 因為流道深度只有 15μm，經光譜儀測定 O.D.值的變化在 15μm 的距離內是可接收的 )。圖 3.14 為流道放大示意圖。 25.

(36) (xc,yc). (yc-y0)/2. FHWM. y0 xc 圖 3.13 FWHM 示意圖. 圖 3.14 微流道放大示意圖橘色細菌 : 還未被雷射光照射細菌紫色細菌 : 已被雷射光照射細菌由圖 3.14 可以看出照射時間也就是曝光時間為乃是從細菌粒子進入雷射光點算起直到流出雷射光點所需的時間，也就是雷射光點直徑除以細菌流速，不考慮流道內管壁黏滯現象，公式如下曝光時間(Exposure time) =. 光點直徑(cm) 流速(ml⁄s)⁄流道截面積 (cm2 ) 26. (3.1).

(37) 其中流道截面積(cm2) 為深度 × 寬度。以光點直徑為 30μm，以流速 0.2ml/Hour 為例計算. 帶入(3.1): 曝光時間(Exposure time) =. =. 0.003(𝑐𝑚) 0.2(𝑚𝑙⁄𝐻𝑟)⁄30 × 15(𝜇𝑚2 ). 0.003(𝑐𝑚) 0.0000056 (𝑚𝑙⁄𝑠) ⁄ 0.0000045(𝑐𝑚2 ). =. 0.003(𝑐𝑚) = 0.000243(s) 12.346(𝑐𝑚⁄𝑠). 光通量(Fluence)計算公式 ∶ 光通量(Fluence) = 曝光時間(Exposure time) × 能量密度(Power density) (3.2). 其中雷射能量密度 =. 能量(mW) 光點大小(cm2 ). =. 120(𝑚𝑊) 0.0015 × 0.0015 × 𝛱(𝑐𝑚2 ). = 17000(𝑊 ⁄𝑐𝑚2 ) (3.3) 因此光通量(Fluence) = 0.000243 × 17000 = 4.12(𝐽⁄𝑐𝑚2 ). 毛細管系統每次實驗使用的菌液量為 1ml，要算光通量要先測量雷射光點大小( 使用刀片量法，取雷射強度降到最大值的 1/e2 倍時的寬度。如圖 27.

(38) 3.15[26] )，且由於流道中不同位置接收到的雷射能量大小不相同，只有接收到的功率密度大於臨界尖峰功率密度( 臨界尖峰功率密度等於 1GW/cm2 [12] )的區域才是能被滅菌的區域，故須先計算能被滅菌的作用區域大小( active region )。圖 3.16 為毛細管系統流道示意圖。其中尖峰功率密度(W⁄cm2 ) ≡. 雷射輸出能量(W) 光點面積(cm2 ) × 脈衝重複頻率(Hz) × 脈衝時間寬度(s) 100. Percent Irradiance. 80. 60. 40. 20 13.5. 0 w. Radius. 圖 3.15 Gaussian Beam 示意圖[26]. 28. w.

(39) 圖 3.16 毛細管系統流道有效作用區域示意圖 W0 為光腰=12μm 橘色細菌 : 還未被雷射光照射細菌紫色細菌 : 已被雷射光照射細菌有效區域(active region) 等於尖峰功率密度( peak power ) 大於 1GW/cm2 的區域，計算公式如下 𝑧(𝑤 ′ ). = ∫ 𝜋 𝑤(𝑧)2 𝑑𝑧 = 𝑤02 𝜋 [𝑧(𝑤 ′ ) + 𝑧(𝑤0). 𝑧(𝑤 ′ )2 𝑧(𝑤 ′ )3 + ] (3.4) 𝑧𝑅 3𝑧𝑅2. 其中 i.. 𝑤 ′ 等於尖峰功率密度為 1GW/cm2 處雷射半徑 29.

(40) ii.. ZR ( Rayleigh range) :在此距離內雷射光散射因數為√2，計算公式如下 𝑤02 𝑍𝑅 = 𝜋 ∙ ( ) = 1416μm (3.5) 𝜆𝑛. iii.. 𝑤(𝑧)在位置 z 時雷射光的半徑，計算公式如下 𝑧 𝑤(𝑧) = 𝑤0 ∙ √1 + ( ) 2 (3.6) 𝑧𝑅 以雷射能量為 250mW 為例計算，因為w’ = 0.00239(cm)，. 𝑧(𝑤 ′ ) = 0.24(𝑐𝑚)，因此有效區域的體積等於4.05 × 10−6 (cm3 )。. 曝光時間(Exposure time)(s) =. active region(ml)×HR×60×60 1(ml). 帶入光通量公式(3.2) 光通量(Fluence) = Exposure time × Power density = 350 (. 𝐽 ) − 1HR 𝑐𝑚2. 30. (3.7).

(41) 第四章實驗結果與討論 4-1 大腸桿菌去活化分析本論文目的為改善殺菌效率，故希望能用較少能量、較少時間消滅較多細菌，故本節內容以光通量所能消滅細菌數、消滅單位細菌所需要的能量以及消滅單位細菌所需要的脈衝數三方面來探討隨時間變化的實驗結果。 1. 隨著照射時間增加，光通量取對數與所消滅細菌數取對數的變化細菌或病毒在一段時間內單位面積獲得的能量是很常被研究且可用來分析殺菌效率的物理量，在生物實驗中我們稱它為光通量。瀏覽文獻後我們發現不同的殺菌方法下，殺菌效率各有不同，但與光通量都有一定關係，例如 2008 年 Natasha Vermeulen 使用 458nm 可見光連續波雷射對 0.1ml 體積的大腸桿菌照射，在光通量取對數為 2.5 時有 90%的殺菌量[27]。2009 年 Michelle Maclean 使用 405nm 發光二極管陣列對 2ml 體積的大腸桿菌照射，在光通量取對數為 2.03 時有 90%的殺菌量[28]。因此我們設計此實驗希望結果是更有效率的。. 31.

(42) 微流道系統(大腸桿菌菌液處理量為 0.1ml). Log(cfu/ml). 7.5. 7.0. 6.5. 6.0 0.0. 0.4. 0.8. 1.2. 1.6. 2.0. 2. Log Fluence (J/cm ). 圖 4.1 微流道系統:光通量對數相對於細菌數的對數做圖. 毛細管系統(大腸桿菌菌液處理量為 1ml). 8 7. Log(cfu/ml). 6 5 4 3 2 1 0 0. 1. 2. 3. 4. 5. 2. Log Fluence (J/cm ). 圖 4.2 毛細管系統:光通量對數相對於細菌數的對數做圖. 32.

(43) 微流道系統&毛細管系統. 8. Capillary Micro-fluid. Log(cfu/ml). 7 LD(90):6.56 6 5 4 3 2 1 0 0. 1 1.61 2 3 1.25 Log Fluence (J/cm2). 4. 5. 圖 4.3 微流道系統&毛細管系統:光通量取對數相對於細菌數的對數 y=Ax+B. 做圖 Acapillary. -2.8. BCapillary. 11. Amicro-fluid. -0.9. Bmicro-fluid. 7.7. A 代表每增加 10 倍光通量，細菌數的衰減量取對數 Bmicro-fluid 代表細菌數取對數的實驗初始值，約為 7.56。 BCapillary 等於 11 並非為細菌數取對數的實驗初始值，這是由於毛細管系統中存在臨界光通量的現象(見章節 4.2 有較詳細說明)，故在光通量取對數為 1.32 時帶入的求得的 BCapillary 才是細菌數取對數的實驗初始值。由圖 4.1、4.2 和 4.3 可看出三件事情 i.. 兩個系統在光通量取對數相對於細菌數取對數做圖方面都是線 33.

(44) 性的負相關(由於是雙對數圖故可知為非線性吸收)，而在毛細管系統中，需要超過臨界的光通量才會有顯著的殺菌效果。 ii.. 本實驗細菌數取對數的初始值為 7.56，在殺菌率達到 90% 也就是細菌數取對數的值為 6.56 ( 見圖 4.3 中 LD 90:6.56 紅色橫向虛線 )時，微流道系統需要的光通量取對數為 1.25(見圖 4.3 中紅色縱向虛線)即光通量為 17.8 J/cm2，而毛細管系統需要的光通量取對數為 1.61(見圖 4.3 中紅色縱向虛線)即光通量是 40 J/cm2。推測是由於毛細管系統處理的菌液量是微流道系統的十倍，故毛細管系統對光通量的利用率較低。. iii.. 雖然毛細管系統對光通量的利用率較低但一次可處理較多體積的菌液，比前人的殺菌效果都要好，達到預期的改善殺菌效率的目標。而微流道系統對光通量的利用率較高但一次可處理的菌液體積較少，殺菌效率沒有達到預期目標，但由於此系統尺度較小在光通量小於 10 時仍可做出精確的數據，可補全毛細管系統數據的不足，故以下實驗仍會繼續討論。. 2. 隨著照射時間增加，平均一隻細菌所接收到的能量變化上一個實驗我們算出殺菌率達 90%時，脈衝雷射所需的能量以及照射時間的乘積，也就是光通量的數據。但光通量這個物理單位對一般人而言並不直觀，因此我們將橫軸光通量單位轉為平 34.

(45) 均一隻細菌所接收受的能量，如此可直觀感受到在我們實驗中單一細菌所需的能量非常小即可達到 90%殺菌效果。微流道系統(大腸桿菌菌液處理量為 0.1ml). Log(cfu/ml). 7.5. 7.0. 6.5. 6.0 0. 500. 1000. 1500. 2000. 2500. nJ/per bacteria (nJ). 圖 4.4 微流道系統:消滅單位細菌所需能量對細菌數取對數做圖。. 35.

(46) 毛細管系統(大腸桿菌菌液處理量為 1ml). 8 7 Log(cfu/ml). 6 5 4 3 2 1 0.0. 5.0E4. 1.0E5. 1.5E5. 2.0E5. nJ/per bacteria (nJ). 圖 4.5 毛細管系統:消滅單位細菌所需能量對細菌數取對數做圖。. 36.

(47) 微流道系統&毛細管系統. 8 Capillary Micro-fluid. 7 Log(cfu/ml). 6 5 4 3 2 1 0.0. 5.0E4. 1.0E5. 1.5E5. 2.0E5. nJ/per bacteria (nJ). 圖 4.6 微流道系統&毛細管系統:消滅單位細菌所需能量對細菌數取對數做圖。. 8. Capillary Micro-fluid. Log(cfu/ml). 7 LD(90):6.56 6 5 4 3 2 1 1. 2. 2.77 3 3.18. 4. 5. 6. Log(nJ/per bacteria). 圖 4.7 微流道系統&毛細管系統:消滅單位細菌所需能量取對數相對於細菌數取對數做圖。. y=Ax+B Acapillary. -2.94. BCapillary. 16. Amicro-fluid 37. -0.9. Bmicro-fluid. 9.

(48) A 代表每增加 10 倍能量，細菌數的衰減量取對數。 Bmicro-fluid 代表細菌數取對數的實驗初始值，約為 7.56。 BCapillary 等於 16 並非為細菌數取對數的實驗初始值，這是由於毛細管系統中存在臨界光通量的現象(見章節 4.2 有較詳細說明)，故在能量取對數為 2.9 時帶入的求得的 BCapillary 才是細菌數取對數的實驗初始值。. 由圖 4.4、4.5、4.6 和 4.7 可看出三件事情 i.. 兩個系統在殺死一隻細菌所需能量取對數相對於細菌數取對數做圖方面都是線性的負相關(由於是雙對數圖故可知為非線性吸收)，特別地是在毛細管系統中，需要吸收超過臨界能量才會有顯著的殺菌效果。. ii.. 本實驗細菌數取對數的初始值為 7.56，在殺菌率達到 90% 也就是細菌數取對數的值為 6.56 ( 見圖 4.7 中 LD 90:6.56 紅色橫向虛線 ) 時，微流道系統平均每隻細菌所接收的能量取對數為 2.77(見圖 4.7 中紅色縱向虛線)即能量為 589nJ，而毛細管系統平均每隻細菌所接收的能量取對數為 3.18(見圖 4.7 中紅色縱向虛線)即能量為 1513nJ。推測是由於毛細管系統處理的菌液量是微流道系統的十倍，故毛細管系統對能量的利用率較低。. iii.. 2008 年 Natasha Vermeulen 對 0.1ml 體積的大腸桿菌照射，平均每 38.

(49) 隻細菌所接收的能量為 10625nJ 時有 90%的殺菌量，2009 年 Michelle Maclean 對 2ml 體積的大腸桿菌照射，平均每隻細菌所接收的能量為 3600 時有 90%的殺菌量，與毛細管系統相比，相同的殺菌效果下，毛細管系統所需的能量較小，顯示我們的系統提高了能量利用率。. 3. 隨著照射時間增加，殺死一隻細菌所需的脈衝數前兩個實驗探討能量與殺菌率的關係，而要提高效率我們還希望能縮減實驗時間也就是縮減所需打的脈衝數，故接下來我們將橫軸換成脈衝數做討論。微流道系統(大腸桿菌菌液處理量為 0.1ml). Log(cfu/ml). 7.5. 7.0. 6.5. 6.0 0.0. 5.0E4. 1.0E5. 1.5E5. 2.0E5. # of pulse/per bacteria. 圖 4.8 微流道系統:消滅單位細菌所需脈衝數對於細菌數取對數做圖. 39.

(50) 毛細管系統(大腸桿菌菌液處理量為 1ml) 7 6. Log(cfu/ml). 5 4 3 2 1 0.0. 5.0E7. 1.0E8. 1.5E8. 2.0E8. # of pulse/per bacteria. 圖 4.9 毛細管系統:消滅單位細菌所需脈衝數對細菌數取對數做圖微流道系統&毛細管系統. 8 Capillary Micro-fluid. 7. Log (cfu/ml). 6 5 4 3 2 1 0.0. 5.0E7. 1.0E8. 1.5E8. 2.0E8. # of pulse/per bacteria. 圖 4.10. 微流道系統&毛細管系統:消滅單位細菌所需脈衝數相對於. 細菌數取對數做圖。. 40.

(51) 8 Capillary Micro-fluid. Log (cfu/ml). 7 LD(90):6.56 6 5 4 3 2 1. 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 6.11 4.77 Log(# of pulse/per bacteria). 圖 4.11. 微流道系統&毛細管系統:消滅單位細菌所需脈衝數取對數 y=Ax+B. 相對於細菌數取對數做圖。 Acapillary. -2.78. BCapillary. 23.5. Amicro-fluid. -0.9. Bmicro-fluid. 10.8. A 代表每增加 10 倍脈衝數，細菌數的衰減量取對數 Bmicro-fluid 代表細菌數取對數的實驗初始值，約為 7.56。 BCapillary 等於 11 並非為細菌數取對數的實驗初始值，這是由於毛細管系統中存在臨界光通量的現象(見章節 4.2 有較詳細說明)，故在脈衝數取對數為 5.75 時帶入的求得的 BCapillary 才是細菌數取對數的實驗初始值。. 由圖 4.8、4.9、4.10 和 4.11 可看出三件事情 i.. 兩個系統在殺死一隻細菌所需脈衝數取對數相對於細菌數取對數做圖方面都是線性的負相關(由於是雙對數圖故可知為非線性 41.

(52) 吸收)。 ii.. 本實驗細菌數取對數的初始值為 7.56，在殺菌率達到 90% 也就是細菌數取對數的值為 6.56 ( 見圖 4.11 中 LD 90:6.56 紅色橫向虛線 )時，微流道系統每隻細菌所接收的脈衝數取對數為 4.77(見圖 4.11 中紅色縱向虛線)即脈衝數為 53700 個，而毛細管系統每隻細菌所接收的脈衝數取對數為 6.1(見圖 4.11 中紅色縱向虛線) 即脈衝數為 1288000 個。推測是由於毛細管系統處理的菌液量是微流道系統的十倍，故毛細管系統對脈衝數的利用率較低。. iii.. 脈衝數除以脈衝重複頻率即為曝光時間，故殺菌率達到 90%時，微流道系統每隻細菌平均受照射時間為 0.655ms，毛細管系統每隻細菌平均受照射時間為 15.7ms。微流道系統中單一細菌所需的處理時間較短，以單一細菌所需的處理時間作為效率最重要考量的話微流道系統較有效率。. 4-2 臨界能量&臨界光通量臨界光通量由圖 4.1 和 4.3 可知在毛細管系統中，需要超過某個特定的光通量才會有顯著的殺菌效果，此值即為臨界光通量。如圖 4.12 所示。計算結果顯示臨界光通量取對數為 1.32 ，即臨界光通量 =21(J/cm2)。 42.

(53) 7.56. 8 7. Log (cfu/ml). 6 5 4 3 2 1 0. 1 1.32. 2. 3. 4. Log Fluence (J/cm2). 圖 4.12 毛細管系統: 臨界光通量示意圖 A. y=Ax+B -2.8 B. 11. A 代表每增加 10 倍光通量，細菌數的衰減量取對數。因為在毛細管系統中存在臨界光通量的現象，故光通量取對數(x)為 1.32 時帶入的求得的 BCapillary 為細菌數取對數的實驗初始值。. 在微流道系統中沒有發現臨界光通量的現象，而是直接呈負的線性關係遞減，推測在毛細管系統中一開始實驗時間太短且處理的菌液量較多，細菌儘管被照射過，但累積的能量不足，故不能造成死亡，拉長實驗時間累積足夠能量才會顯現殺菌效果。. 43.

(54) 臨界能量做固定光通量改變照射時間與照射能量密度實驗時，原本預期殺菌數不變，但實驗結果顯示，在低於某個能量值，殺菌效率會顯著下降，此值即為臨界能量，雷射能量要超過臨界能量，細菌數取對數與光通量取對數的關係圖才會是線性。如圖 4.13 所示。實驗項目為 1. 固定光通量為 810(J/cm2) 能量 (mW). 照射時間(小時). 250 125 50 25. 0.5 1 2.5 5. 使用能量為 250mW 的脈衝雷射照射 0.5 小時、使用能量為 125mW 的脈衝雷射照射 1 小時、使用能量為 50mW 的脈衝雷射照射 2.5 小時以及使用能量為 25mW 的脈衝雷射照射 5 小時這四項實驗。 2. 固定光通量為 125(J/cm2) 能量 (mW). 照射時間(小時). 50 25 10 5. 0.5 1 2.5 5. 使用能量為 50mW 的脈衝雷射照射 0.5 小時、使用能量為 25mW 的 44.

(55) 脈衝雷射照射 1 小時、使用能量為 10mW 的脈衝雷射照射 2.5 小時以及使用能量為 5mW 的脈衝雷射照射 5 小時這四項實驗。 2. Fixed Fluence to 810 J/cm 6. Log ( cfu/ml). 5 4 3 2 1 0 0. 50. 100. 150. 200. 250. Power (mW). y=Ax+B A. 0.001. B. 6.5. A 代表隨著能量改變，細菌數取對數值的變化，在此圖中 A 趨近於零，代表細菌數取對數的值不隨能量改變。 B 顯示目前能量下(50mW-250mW)照射一小時後細菌數取對數值。. 45.

(56) 2. Fixed Fluence to 125 J/cm 120. Viability (%). 100 80 60 40 20 0. 10. 20. 30. 40. 50. Power (mW). 圖 4.13 毛細管系統:臨界能量密度示意圖臨界能量為 25mW(尖峰能量密度為 0.66GW/cm2) -cx. A c. y=Ae +B 137 B -0.13. 27. 此圖趨勢線為指數衰減，c 代表生存率衰減程度，等於每增加 1mW 能量殺菌率提升的百分比。由圖 4.13 可看出能量小於 25mW 時殺菌效果顯著下降，能量超過 25mW 以後殺菌效果則與光通量相關。由於 25mW 換算出尖峰能量密度為 0.66GW/cm2，回顧 2007 年 Shaw-Wei D. Tsen 與 K.T. Tsen 用可見光飛短脈衝雷射對大腸桿菌做殺菌實驗[20]其結果約在尖峰能量密度為 0.6GW/cm2 時產生臨界值，與我們的實驗結果相符。. 46.

(57) 4-3 最佳化設計流道利用 4-1 與 4-2 所做實驗，我們得到結論，首先雷射能量要大於臨界值 25mW，並妥善利用雷射光束即可得效率的流道設計。毛細管系統中能量的利用率較低是因為流道太深，且菌液經過來回抽取易有已死亡的細菌與尚未死亡的細菌混合不均勻的現象，使目前毛細管系統的效率只能達到 5 個小時殺菌 1ml 的菌液(相當於 1 小時殺菌 200μl)，而微流道系統中脈衝數利用率較低是因為流道太淺，故每次雷射脈衝能打到的細菌太少。結論是要設計新的系統，其尺寸介於毛細管系統與微流道系統之間。如圖 4.14 所示 Spot size. Width: 24µm. depth: 2400µm. Inlet. Outlet Length: 24µm. 圖 4.14 最佳化流道示意圖設計新流道寬度與雷射光點大小相同，深度擴增為 2400μm，此時的截面積將為最大(能量均在尖峰能量 = 1GW 以上)。由圖 4.16 可知原本微流道系統在流速為 0.02ml/Hour(光通量 =64.5(J/cm2))時殺菌效果為 LD99 (細菌衰減量對數 Log reduction = 2)，故重複流 2 趟細菌衰減量對數(Log reduction) 可達到 4。由於截面積增加，此時新流道在相同光通量、相同殺菌率(LD99) 47.

(58) 下流速可增加為 160 倍達到 3.2 ml/Hour。由於要流 2 趟才能達到細菌衰減量對數(Log reduction) = 4，故每小時能殺菌的菌液體積約為 1.6ml，比照 2007 年 Shaw-Wei D. Tsen 與 K.T. Tsen 用可見光飛短脈衝雷射對大腸桿菌做殺菌實驗[20]，其效率為每小時能處理 100μl 的菌液（細菌衰減量對數達到 2.45）。只要能克服製成問題，順利製作流道我們的效率即可增加超過 30 倍。. 100. Survival Rate (%). 80. 18. 60. 40. 20. 0 0.0. 0.1 0.2. 0.4. 0.6. 0.8. 1.0. Velocity (ml/hour). 圖 4.15 微流道系統流速對生存率作圖若需達成的殺菌效果在細菌衰減量對數 2 以內，可參考此圖，只要得知所需達成的殺菌效果，即可找到對應的流速，再根據新流道尺寸即可計算出單位時間可處理的菌液量。. 48.

(59) 第五章結論與未來展望本論文研究兩個系統毛細管系統與微流道系統在不同照射時間、不同脈衝數和不同光通量情況下的殺菌效果。並根據結果設計出較高效率的流道。實驗結果可以歸納為以下三點結論：第一，由圖 4.1~4.11 可知隨著照射時間增加，單位光通量所能消滅細菌數的實驗結果、平均一隻細菌所接收能量的實驗結果以及平均一隻細菌所接收脈衝數的實驗結果在兩個系統中皆呈現線性的負相關(由於是雙對數圖故可知為非線性關係)，以 LD90 時的數據來看，毛細管系統中一開始效率較低，推測是因為處理的菌液量是微流道系統的十倍，總細菌數較多，但兩個系統的利用率都比前人的實驗來的高，達成提高效率的目標。第二，由圖 4.13 可知在固定光通量實驗中，若雷射能量低於臨界能量(Power:25mW)，殺菌效率會顯著下降，而 Power 等於 25mW 時尖峰能量密度為 0.66GW/cm2 與 2007 年 Shaw-Wei D. Tsen 與 K.T. Tsen 用可見光飛短脈衝雷射對大腸桿菌做殺菌實驗[20]結果相符。第三，在討論脈衝數與殺菌效果的關係時，可肯定即便單位脈衝能量再大，細菌也絕非一個脈衝所能殺死的，推測是因為一個細菌有許多 DNA，一個脈衝能量再大也只能打斷一條 DNA，故須累積一定 49.

(60) 數量的脈衝才能破壞多數 DNA，造成細菌死亡。根據這三點結論我們設計出效率增加超過 30 倍的流道。以下以血液製品-新鮮冷凍血漿做範例討論新鮮冷凍血漿內含有效成份: 血漿 120ml；所有凝血因子 100ml；無血小板。一單位為 135ml。解凍後不能退回血庫，應於六小時之內輸用。現有的血液製品消毒技術 MirasolTMa InterceptTMa [29] 可達到細菌衰減量對數下降約為 2.5 也就是生存率為 0.3%，我們以此為標準，對照圖 4.15 可知在舊流道時流速 0.02 ml/Hour 時生存率為 1%，流速 0.25 ml/Hour 時生存率為 30%，用 0.02 ml/Hour 流完再用 0.25 ml/Hour 流過，即可達到細菌衰減量對數下降 2.5 的菌液。改用截面積較大的新流道時先用流速 3.2 ml/Hour 流一遍，再用 40ml/Hour 的流速消毒一次，即可達到生存率下降為 0.3%的殺菌效果，消毒一單位所需的時間為 45.5 小時。若病人情況緊急，只能進行 4.5 小時手術，則需準備 3W 聚焦光點半徑 100μm 的脈衝雷射，如此一來流道設計也擴大為寬度 200μm 深度 2.8mm，由於截面積又增加了 10 倍，故流速可再提高，先用 32ml/Hour 流一遍，再用 400ml/Hour 的流速消毒一次，即可達到生存率下降為 0.3%的殺菌效果，消毒一單位所需的時間為 4.5 小時。 50.

(61) 未來可以使用 Mode-Locked Femtosecond Titanium : Sapphire Laser ( 型號為 Model Trestles –LH6)所輸出的波長 830nm，能量 800mW 的雷射進行實驗，因為能量較大，可以加大流道尺寸設計，預期可以有更高的效率，只是可見光殺菌機制主要由色素吸收雷射光，產生單態氧進而破壞脂肪分子造成細菌死亡，其中色素對 830nm 的光吸收率不高，故選擇提高能量而降低吸收率造成的效率是否比較高仍須研究。. 51.

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