Figure 16 4-5[16]肌動蛋⽩被交聯後貼附固定⽰意圖
3. 膠原蛋⽩原液(TypeⅠCollagen)：染⾊的培養玻⽚使⽤前會先貼附⼀層膠原蛋⽩
溶液，成份是由豬萃取純化過的膠原蛋⽩原液（Sunmax Biotechnology Co. Ltd.），
濃度為 3mg/mL，儲存在 4℃，使⽤前稀釋 20 倍 2ml 去貼附在培養⽫內的玻⽚ 24hr 以上。
4. ProLong® Gold Antifade Reagent with DAPI：是⼀種固定細胞、抑制螢光頻譜漂
⽩的膠著劑，能對螢光標記的標靶分⼦螢光訊號達到有效率的儲存，以便細胞能被 適當地⾧時間保存。
4.5 實驗分析⽅法
做實驗之前會使⽤螢光標準⽚對雷射光源強度進⾏校正，使⽤雷射光源強度為
300mW-500mW對樣品進⾏激發，將掃描接收到的訊號經由光電倍增管放⼤成為電 訊號，再傳送到電腦處理。
影像數位化後，所得到的影像資料乃是⼀個個「像素」(Pixel)所組成的，每個
像素都有特定的座標，且相對應於物體上的⼀個點。每個像素的值，⼀般稱作「灰 度值」(Gray Level)，其值由所對應物體的亮度來決定，灰度值愈⼤，表⽰亮度愈⾼。
假如每個像素的灰度值由 8 位元來表⽰，則代表 2 的 8 次⽅，則亮度變化區間介於
0⾄ 255 間。
[12]⼆值影像(Binary image,1 bpp(bits per pixel))是將彩⾊影像的每⼀像素 (pixel)先轉成灰階值(gray)後，再與事先給定的⾨檻值(threshold)相⽐，如果計算得 到的灰階值⼤於或等於該⾨檻值，則將此點的顏⾊設為⽩⾊;如果計算得到的灰階值 是⼩於該⾨檻值,則將此點的顏⾊設為⿊⾊。本實驗分析時使⽤⼆值圖像，不討論灰 度值（與強度變化有關），先決定出細胞的邊界再利⽤[15]影像處理軟體 ImageJ 計 算圈選出的邊界⼤⼩，並計算其⾯積或體積。
像素⼤⼩(Pixel size)指的是個別感測像素的實際⼤⼩尺⼨(⾧ x 寬)，像素愈⼤，
則所需曝光成像時間較短，但會犧牲空間解析度。反之，像素愈⼩，則需較久的曝 光成像時間，成像之後的影像解析度則較好。本實驗影像選⽤ 512x512pixels 也就 是 16 位元的影像，所以曝光時間固定，我們以 μm 為計量單位，本實驗影像使⽤
Nikon, 20x, NA 0.75, Fluor, WD1.0的物鏡，16 位元，實際⼤⼩是 340nmx340nm，
所以 1pixel ⾧度是 0.665μm 之後使⽤此條件進⾏換算。
Figure 17 4-6將細胞影像換成⼆值影像以有效圈選邊界
Figure 18 4-7將圈選的細胞核影像與細胞影像做⽐對
細胞外形的多變異/細胞核外形的多變異
我們主要是看細胞外形及細胞核外形的畸形程度利⽤計算細胞⾯積與細胞周⾧，為 簡單的判別細胞外型，我使⽤圖形圓形率(Circularity)對兩種細胞做計算，定義圓形
率為： ;也就是對細胞或細胞核⾯積除以圖形周⾧再乘
以 。直觀的來看細胞的相對外型的圓形率，若外形愈不規則，變異數越⼤，則其 圓形率越⼩;反之，外型愈規則、變異數越⼩，則越接近 1。
circularity≡ 4π ×
[Area][Perimeter]2
4
π
Figure 19 4-8細胞外型/細胞核外型 多變異⽰意圖
Chapter5 實驗結果
Figure 20 5-1 CL1-5的螢光影像 左圖是 cell tracker 右圖是 Hoechst
Figure 21 5-2 CL1-0的螢光影像 左圖是 cell tracker 右圖是 Hoechst
Figure 22 5-3針對 CL1-0 與 CL1-5 的核質⽐個別做圖
Figure 23 5-4 NC ratio diagram
CL1-0 CL1-5 Nuclei Area (µm2) 192.9±99.29 206.5±119.61 Cytoplasm Area (µm2) 241.6±129.85 440.0±263.12 NC ratio 0.83±0.224 0.50±0.174
Figure 24 5-5 Area NC ratio ⽐較表格
直觀的看細胞外型變異，透過計算其圓周率，得出如下結果：
CL1-0 CL1-5
Nuclei Circularity≤ 0.3 5.5% 80.6%
Nuclei Circularity 0.3-0.5 25.5% 16.1%
Nuclei Circularity 0.5-1 69% 3.3%
Figure 25 5-6 Nuclei Circularity ⽐較表格
Figure 26 5-7 Nuclei Circularity 圖表
CL1-0 CL1-5
Cytoplasm Circularity≤ 0.3 24.5% 69.9%
Cytoplasm Circularity0.3-0.5 40.9% 24.7%
Cytoplasm Circularity 0.5-1 34.6% 5.4%
Figure 27 5-8 Cytoplasm Circularity ⽐較表格
Figure 28 5-9 Cytoplasm Circularity 圖表 Nuclei Circularity
0.3 Nuclei Circularity
0.3-0.5 Nuclei Circularity 0.5-1
CL1-0 5.50% 25.50% 69%
CL1-5 80.60% 16.10% 3.30%
0.00%
Circularity 0.3 Cytoplasm
Circularity 0.3-0.5 Cytoplasm Circularity 0.5-1
CL1-0 24.50% 40.90% 34.60%
CL1-5 69.90% 24.70% 5.40%
0.00%
本實驗統⼀使⽤ ImageJ 內建的偵測邊緣的函數，去計算圈選細胞的周⾧，得出 的結果再分成三級。可以發現 CL1-5 較 CL1-0 細胞變異性⼤，不只是細胞核、細胞 外型也相對變異⼤。
計算的結果⼤致符合預期，如果癌細胞代表不成熟細胞的假設成⽴，那麼癌化 越嚴重的細胞成熟度越低，細胞核分化越明顯也就越⼤。由前⾯數據計算平⾯的細 胞⾯積結果可得 CL1-5 相對於 CL1-0 的細胞核較⼤，但在細胞整體⽽⾔佔的⽐例較 低，核質⽐(NC ratio)較 CL1-0 低。
使⽤雙光⼦螢光顯微鏡對 Z 軸做深度的掃描，每 1μm 取⼀張影像，總共取 30 張影像，做成 3D 的⽴體圖去做細胞圈選，得出細胞與細胞核的體積。三維的核質
⽐與平⾯核質⽐相較之下會來得有意義，因為再取平⾯的影像時常常無法完整量化 細胞核的⼤⼩，可能只是切平⾯上其中⼀個截⾯，所以得出的結果也與平⾯核質⽐
不同。[9]
Figure 29 5-10 CL1-0染 CMTMR 的 Z 軸掃描(由左⽽右、由上⽽下)
得到 CL1-5 體積的結果與平⾯有很⼤的不同，但核質⽐的分佈仍然是 CL1-5 較⼤
Figure 30 5-11 CL1-0細胞核染 Hoechst 的 Z 軸掃描
CL1-0 CL1-5 Nuclei Volume (µm3) 4587.2±1994 1814.7±913 Cytoplasm Volume (µm3) 4676.3±1834 2150.2±1151
NC ratio 1.03±0.4 0.85±0.2
Figure 31 5-12 Volume NC ratio ⽐較表格