利用雙光子螢光顯微鏡之影像分析肺腺癌細胞核質比

國立臺灣大學理學院物理學研究所 碩士論文

Graduate Institute of Physics College of Science

National Taiwan University Master Thesis

利用雙光子螢光顯微鏡之影像分析肺腺癌細胞核質比 Survey on Lung Adenocarcinoma Cells

Nuclear-to-Cytoplasmic Ratio Analysis for Two-photon Fluorescence Microscopy Images

黃雅琳 Ya-Lin Huang

指導教授：董成淵 博士 Advisor: Cheng-Yuan Dong, Ph.D.

中華民國 105 年 7 月

July, 2016

誌謝

能完成這篇碩論畢業絕對要感謝這⼀路上幫助我的所有⼈，⾸先要感謝的當然 是董成淵教授，也是實驗室的⽼⼤、帥氣的奶爸。感謝他在我研究⽣的兩年裡給予 我絕對的⾃由度，擁有⾜夠的資源與空間，讓我適性發展，對於最後沒幫⽼師發⼀

篇論⽂感到抱歉，但對於⽼師我是寄予深深的感謝。另外也要特別感謝毒理所陳惠

⽂教授，提供我實驗的題⽬⽅向，給予建議跟指導，並從教授那獲取重要的實驗樣 本，讓我了解做此實驗的⽬的與在醫學上的貢獻如何？讓我對教授充滿無限感激。

當然還有感謝參與⼝試的陳永芳、張顏暉教授，給我適當的意⾒，幫助我釐清研究 的問題。

當然還要感謝實驗室的同仁與前輩們：⼀直都很有緣分的健業，沈穩⼜內斂的 可靠男⼦，總是能很有條理的分析問題。搞怪無理頭無極限的旭成，實驗室的開⼼

果、炒熱氣氛的能⼿，有他在實驗室絕對不會冷清，最近每天幸福炫喵讓⼈好⽣羨 慕。可愛的師母 Jen 聲⾳辨識度超⾼，不管⼈在哪絕對無法忽略的存在感，對於實 驗的活躍，也讓實驗不乏味甚⾄多了許多趣味。實驗室救⽕隊李博，專⾨解決各式 疑難雜症，任何問題找他就像⼀盞明燈，指引我⽅向、從他⾝上學到許多做事的⽅

法，同時也是⾺拉松常勝軍，⾵速男⼦。外表看似忠厚⽼實的⼦翔，其實⾻⼦裡總 藏著壞東西，實驗室霸凌由他⽽來，但同時也是個暖男。我的教練柏航，個性溫吞 可愛，但卻是制霸球場的網球王⼦，同是資深費迷，感謝他引領我進⼊網球的世界，

雖然球技還是很菜，希望來⽇約打能有所進步！助理彥妤打理好實驗室其他事務讓

我們能無後顧之憂的做研究，可愛逗趣的個性同時也是⽺⽑氈⼿作名師，到處開班 授課，作品細膩精緻的程度令⼈驚艷。還有寡⾔的林博，雖然沒有太多接觸，但是 個很溫和的⼈。還有常處於三樓較為神秘的 Vova，總是帶著和藹的笑容，當然也感 謝實驗室之前的成員的⼤學⾧志儒、郭博⼠、耀德、康薇、博安學⾧、Rena 等等曾 經幫助過我的⼈，認識你們很開⼼，也學到很多、聽到許多意⾒、做研究的態度與

⽅法，讓我研究⽣活輕鬆愉快。

給兩年來⼀同⾛過的戰友：隨時都充滿活⼒的康甯，總是當我的垃圾桶，有任 何事都可以跟你傾吐，回想⼀路⾛來朝⼣相處的時光，包括修課、實驗都⼀起⾯對，

即便是罕⾒地⼀起運動甩⾁，真的是研所期間交到難能可貴的好姐妹，從你⾝上可 以發掘無數的優點，希望我倆畢業後⼀切順利！很幸運地與冰凍系學聖分配在同⼀

組做研究，雖然總是冰凍我，但也佩服神童的聰明才智，有問題找你討論，你總能 給我具體的⽅向，下次再找你打球，跑步就免了，怕你⼜臉⾊慘⽩。⽭盾的宅男泡 泡，酷愛打電動但同時⼜是泳技驚⼈的游泳教練實在令⼈費解，雖然很愛嗆⼈但是 我的運動良伴，很⾼興能認識你們並⼀起畢業！

最後感謝我的朋友們⼀路來的扶持與陪伴，謝謝⿊⼈江宜蓁當我的精神⽀柱，

明年換你畢業囉！⿊妞佳儒總是聽我吐⼀堆苦⽔，祝你去⽇本求學⼀切順利。胖⼦

俞憓每次聽你講職場的⿊暗⾯都讓我好⽣畏懼啊！我永遠的好室友羅婕，希望你之 後⼝試順利，⼀起來台中⼯作再續前緣啊！還有我的難友許宸維，謝謝你總是陪伴 在我⾝邊，⼀起度過許多關卡，希望未來能⼀起變得更好。

求學的過程⼀路跌跌撞撞，感謝我的家⼈扶持，成為我最⼤的避⾵港，栽培我

⾧⼤成⼈，真⼼感謝你們。

⿈雅琳 於 2016 年 8 ⽉ 5 ⽇

中⽂摘要

肺腺癌屬於⾮⼩細胞癌，主要的來源是肺部外層的表⽪細胞變異，因為早期癌 變的狀態並⾮塊狀或腫瘤，亦無症狀，x-ray 檢測發現的時機通常已是癌末。將癌末 細胞從⼈體取出體外複製培養成具有穩定繼代特性細胞株(cell line)，再依據其轉移 能⼒與惡化程度分成 CL1-0 與 CL1-5。根據病理學，癌細胞的細胞核⼤⼩與細胞成 熟度有關聯，在本研究中，我們利⽤螢光染劑的特性與雙光⼦螢光顯微鏡拍攝平⾯

與不同深度的影像。藉由 ImageJ 分析這些影像資料，圈選細胞核與細胞輪廓得到⾯

積的⽐例關係。發現 CL1-5 的細胞核⾯積較 CL1-0 ⼤，NC ⽐例則是 CL1-0 的⼤於 CL1-5。

關鍵字：肺腺癌、CL1-0、CL1-5、核質⽐、雙光⼦螢光顯微術

ABSTRACT

Adenocarcinoma cancer, a type of non-small cell lung cancer, is caused by the variation of the epithelial cells in the outer layer of lung. Because in the early state, the adenocarcinoma cancer does not form blocks nor cancerous tumor, may also be

asymptomatic, the x-ray detectable cancer is usually in terminal state. The cancer cells derived from patients were replicated in vitro and cultured into cell lines. According to their invasive ability and degree of deterioration, the cell lines were divided into CL1-0 and CL1-5. Based on pathology, the cell nuclei size is associated with the maturity of the cancer cells. In this study, we used fluorescent dye properties and two-photon

fluorescence microscopy to image these two types of cells at different depths. By using ImageJ, we analyzed the image data, circling the nucleus and cell outline to obtain the proportion of nucleus to cytoplasm. In my research the nuclei area of CL1-5 is bigger than CL1-0; the nuclear-to-cytoplasmic ratio (NC ratio) of CL1-0 is greater than CL1-5.

Keywords: Adenocarcinoma, CL1-0, CL1-5, nuclear-to-cytoplasmic ratio (NC ratio), Two-photon fluorescence microscopy

⽬錄

誌謝 ... II

中⽂摘要 ... V ABSTRACT ... VI

⽬錄 ... VII

圖⽬錄 ... IX

CHAPTER1 緒論 ... 1

1.1研究動機 ... 1

1.2 惡性腫瘤簡介 ... 1

1.3 細胞的核質⽐ ... 4

CHAPTER2 基本原理 ... 6

2.1顯微術 ... 6

2.1.1 顯微鏡原理 ... 7

2.1.2 光學解析度 ... 8

2.2 單光⼦的螢光原理 ... 10

2.3 雙光⼦的螢光原理 ... 14

2.3其他螢光性質 ... 15

2.4 與共軛焦顯微鏡的⽐較 ... 16

CHAPTER3 實驗架設 ... 18

3.1雷射光源的⾮線性光學顯微鏡 ... 18

3.2光學系統架設 ... 19

3.3螢光染劑介紹 ... 20

CHAPTER4 實驗材料與⽅法 ... 24

4.1 肺腺癌細胞的篩選 ... 24

4.2 細胞培養 ... 26

4.3 細胞染⾊程序 ... 26

4.4 實驗材料介紹 ... 27

4.5 實驗分析⽅法 ... 28

CHAPTER5 實驗結果 ... 32

CHAPTER6 問題討論與未來展望 ... 38

6.1 實驗問題討論 ... 38

6.2 未來展望 ... 39

參考資料 ... 41

圖⽬錄

FIGURE 1 1-1[3]肺部⽰意圖 ... 2

FIGURE 2 1-2惡性腫瘤排列失去極性 ... 3

FIGURE 3 1-3細胞簡化圖 ... 4

FIGURE 4 2-1點擴函數的傅⽴葉轉換 ... 9

FIGURE 5 2-2[6] JABLONSKI能階圖 ... 11

FIGURE 6 2-3雙光⼦點激發⽰意圖 ... 16

FIGURE 7 3-1實驗裝置架構圖 ... 19

FIGURE 8 3-2 HOECHST33342分⼦式與結構⽰意圖 ... 21

FIGURE 9 3-3 CELL TRACKER CMTMR分⼦⽰意圖 ... 21

FIGURE 10 3-4螢光輻射激發波⾧⽐較光譜圖 ... 22

FIGURE 11 3-5 ALEXA FLUOR® 488 PHALLOIDIN 分⼦⽰意圖 ... 23

FIGURE 12 4-1細胞侵襲能⼒分級篩選⽰意圖 ... 24

FIGURE 13 4-2 CL1-0與 CL1-1 對⽐⽰意圖 ... 25

FIGURE 14 4-3 CL1-0與 CL1-5 在 CCD 顯微鏡下影像圖 ... 25

FIGURE 15 4-4細胞染⾊⽰意圖 ... 27

FIGURE 16 4-5[16]肌動蛋⽩被交聯後貼附固定⽰意圖 ... 28

FIGURE 17 4-6將細胞影像換成⼆值影像以有效圈選邊界 ... 30

FIGURE 18 4-7將圈選的細胞核影像與細胞影像做⽐對 ... 30

FIGURE 19 4-8細胞外型/細胞核外型 多變異⽰意圖 ... 31

FIGURE 20 5-1 CL1-5的螢光影像 左圖是CELL TRACKER 右圖是 H^OECHST ... 32

F 215-2CL1-0的螢光影像 左圖是 右圖是 H ... 32

FIGURE 22 5-3針對 CL1-0 與 CL1-5 的核質⽐個別做圖 ... 32

FIGURE 23 5-4 NC RATIO DIAGRAM ... 33

FIGURE 24 5-5 AREA NC RATIO ⽐較表格 ... 33

FIGURE 25 5-6 NUCLEI CIRCULARITY ⽐較表格 ... 33

FIGURE 26 5-7 NUCLEI CIRCULARITY 圖表 ... 34

FIGURE 27 5-8 CYTOPLASM CIRCULARITY ⽐較表格 ... 34

FIGURE 28 5-9 CYTOPLASM CIRCULARITY 圖表 ... 34

FIGURE 29 5-10 CL1-0染 CMTMR 的 Z 軸掃描(由左⽽右、由上⽽下) ... 36

FIGURE 30 5-11 CL1-0細胞核染 H^OECHST的 Z 軸掃描 ... 36

FIGURE 31 5-12 VOLUME NC RATIO ⽐較表格 ... 37

FIGURE 32 6-1[7]螢光強度對 C^ELL TRACKER種類圖 ... 38

FIGURE 33 6-2 NORMAL FIBROBLAST 左：CCD 影像 右：染⾊後螢光影像 ... 39

Chapter1 緒論

1.1 研究動機

⿈帝內經素問《陰陽應象⼤論》內記載：「天氣通於肺」，透過肺進⾏呼吸作⽤，

不斷吸進清氣，排出濁氣，吐故納新，實現⼈體與外界環境的氣體交換，肺主宰著 我們的⽣命，對⼈體的重要性可⾒⼀斑。但因為肺癌的初期症狀並不明顯，往往讓 患者不易察覺⽽錯失早期發現的良機，等發現的時候已轉為癌末。

[1]肺癌是⽬前世界上最常⾒也是最致命的癌症疾病，雖然吸菸⼈⼝消費減少使 得總⼈數有下降的趨勢，但肺癌的發病與死亡率在⼥性⼈⼝仍以驚⼈的速度在發展 中國家增加。肺癌的總體治癒率僅約13%，並且⼤多數治療失敗的患者有遠處轉移。

在腫瘤疾病中，肺癌細胞可⼊侵周圍組織，然後轉移到其他區域與縱隔淋巴結，最 終癌細胞擴散到遠端其他器官，包括肝，⾻，腦。

⽽⼤多數癌症相關死亡皆由轉移引起的，經由⾎液流⾄遠處部位擴散被假定為 這些致命腫瘤的原因。透過細胞檢測與表徵可以提供⼀個有價值的參數，判斷腫瘤 細胞與正常細胞的差異。

1.2 惡性腫瘤簡介

當⾝體某個部位的細胞開始不受控制地⽣⾧，即發⽣癌症。正常細胞會有規律 地分裂和⽣⾧，但癌細胞會不斷增⽣，最後排擠掉正常細胞，使得⼈體很難⽤原有

⽅式運作，雖然癌症有許多種類，但共通點就是細胞會不受控制地⽣⾧。

Figure 1 1-1[3]肺部⽰意圖

[4]特殊類型的癌或⾁瘤的命名是根據外觀與組織發⽣的來源，因此惡性上⽪腫 瘤伴隨腺體狀增⽣被稱為腺狀癌(adenocarcinomas);來⾃平滑肌的⾁瘤被稱為平滑 肌⾁瘤(leiomyosarcomas)。其中缺乏分化是惡性腫瘤的特⾊，根據組織學的特⾊：

a)細胞及其細胞核兩者表現出的多形性(pleomorphism):細胞及其細胞核在⼤⼩及 形狀有所不同。[12]

b)染⾊質過多：⼀般⽽⾔，細胞核深染最常出現在癌細胞中，這是因為癌細胞很活 躍且會不正常分裂，使得細胞核中的 DNA 合成增加，造成核染⾊質增加。所以當細 胞核⼀經染⾊之後，會因為核染⾊質過多的關係，染⾊後所看到的細胞核顏⾊也相 對的⽐較深。

c)細胞核質⽐：核與細胞質(cytoplasm)的⽐例可能逼近1:1⽽⾮正常時的1:4或1:6，

表⽰細胞核有明顯增⼤。

d)豐富的細胞分裂：表⽰增⽣的活性，細胞分裂相可能與正常細胞分裂有所不同，

例如：三倍紡錘絲。

e)巨⼤的腫瘤細胞：偶可⾒得⼀⾮常⼤的多葉核或有多個細胞核。

f) 腫瘤細胞失去極性（loss of polarity）或稱去極化：排列⽅式無層次，⽣⾧⽅向亦 不⼀致。

Figure 2 1-2惡性腫瘤排列失去極性

不同種類的癌症可能有不同的表現，例如，肺癌和乳癌就是兩種⾮常不同的疾 病。這兩種癌症的病程不同、治療⽅法亦不同。這就是為什麼癌症病患需要針對其 癌症種類進⾏治療。

[3]⼤多數肺癌都發⽣在⽀氣管內層，但也可能發⽣在肺部的其他部位。肺癌通 常是經過多年形成的，⾸先肺部可能有部位處於癌前變化的狀態，這些變化不是塊 狀或腫瘤，因此 X 光檢查不出來，也不會產⽣症狀。經過⼀段時間後，這些處於癌 前狀態的部位可能會發展成真正的癌症，⽣成化學物質導致新的⾎管在周圍形成。

這些新⾎管可供給癌細胞營養，使腫瘤得以形成，最後腫瘤變⼤到可經 X 光檢查出 來，很快地，癌細胞可能會脫離並擴散⾄⾝體其他部位，這種情形稱為轉移。肺癌 是⼀種致命疾病，因為癌細胞常在發現之前即已擴散。

肺癌主要可分成兩類：⼩細胞癌(SCLC) 與⾮⼩細胞肺癌(NSCLC) 。肺癌約有

85%⾄ 90%是屬於⾮⼩細胞肺癌。⾮⼩細胞肺癌⼜可細分成 3 種亞型，這些亞型的 癌細胞在⼤⼩、形狀或化學構造⽅⾯都不同。

鱗狀上⽪細胞癌:肺癌約有 25%⾄ 30%屬於這種類型。這種肺癌與吸煙有關，通常在 肺部中央接近⽀氣管處發現。

腺癌:這種類型約佔肺癌的 40%，通常在肺的外層部分發現。

⼤細胞(未分化)癌:肺癌約有 10%⾄ 15%屬於這種類型，這可能發⽣在肺部的任何部 位，這種癌症通常發展和擴散快速，因此較難治療。

1.3 細胞的核質⽐

Figure 3 1-3細胞簡化圖

[8]根據病理學的研究，癌細胞與正常細胞相⽐算是未成熟的細胞，⽐正常細胞

還要⼤，如果細胞成熟，其核⼤⼩通常降低，所以核質⽐可⽤來標⽰⼀個細胞的成 熟度。所以提出尋找細胞的核質⽐在正常細胞與癌症細胞中的⽐較，核質⽐在癌症 細胞的⽐值是較⼤的，利⽤它來辨識癌症的嚴重程度與疾病的階段，⾸先被⽤來查 找⽪膚癌細胞的與⽪膚⽼化細胞受影響的程度，要找出提升其快速與精準分割⽅

法。

本實驗透過雙光⼦螢光顯微鏡取得的影像，可以較精準的標記細胞的⼤⼩與型 態，針對細胞的核質⽐做計算，希冀能有效地統計歸納出⼀個有價值的參考數據，

使核質⽐可⽤來診斷癌症的⼀些組織，並使他在臨床的應⽤是有效的。本實驗在結 果分析使⽤的核質⽐計算⽅式定義為：

NCratio =

{N}

1

∑

{C} ; N ∈NucleiArea,C ∈CellArea

個別細胞內所有的細胞核⾯積除以圈選的細胞⾯積(此處定義細胞質的⾯積有包含 細胞核)，因為癌細胞算是未成熟的細胞，所以 DNA 處於不穩定複製增⽣狀態，每 個細胞會有數量⼤於⼀個細胞核的情形，所以結論計算的細胞核⼤⼩是以個別細胞 為單位去做量化。

Chapter2 基本原理

2.1 顯微術

顯微鏡的發明可追溯到 16 世紀末期，⼀對荷蘭的眼鏡製造商⽗⼦ Hans Janssen 與 Zacharias Janssen 製作了⼀個垂直架在銅三⾓架上，⼤約 21/2 呎⾧的儀器，其 中主要的管徑為⼀、⼆吋，底座是⿊檀⽊製作的圓盤，⼀端是凹透鏡，另⼀端為凸 透鏡；不同透鏡的組合使此儀器可以折射光線，可將原來的樣品影像放⼤約⼗倍，

因此揭開了顯微鏡的序幕。約莫 50 年後，Henry Power 是第⼀個發表⽤顯微鏡得出 實驗結果的科學家，Marcello Malphigi 在西元 1611 年利⽤顯微鏡發現青蛙內臟的

⽑細⾎管，提出⾎液循環理論決定性的證據。

Robert Hooke針對顯微鏡的原始設計做出改進，並將⾃⼰⽤顯微鏡觀察所得的 結果寫成《顯微術》，發明了「細胞」⼀詞，在科學界激盪起精彩的⽕花。後來荷蘭 的科學家 Anton van Leeuwenhoek 改良了顯微鏡，將⼩玻璃球拋光成⼀透鏡，成功 地使⽤單⼀透鏡將樣品放⼤ 270 倍，可以看到從⽛⿒上刮下細屑中的細菌。陸續有 許多改良的顯微鏡，但多數透鏡的設計仍為模糊的影像與光學上的像差所苦，到了

⼗九世紀初期，Joseph Jackson Lister改善球⾯像差的問題，發明第⼀部複式顯微鏡，

接著玻璃組成的精進與消⾊物鏡的發展，使光學有了突破性的進步，消⾊物鏡更有 效地降低透鏡的球形像差，不會有顏⾊上的扭曲。

然⽽⼗九世紀中葉，德國科學家 Ernst Abbe 提出繞射極限概念，觀察者與被觀

察者在遠場光學的範圍中（即遠⼤於⼀個量測波⾧的距離時），無法避免由於光的波 動性質所造成的⼲涉與繞射效應。以⼈眼最敏感的綠光來說，能分辨的最⼩距離約 為 250 nm，即使將放⼤率不斷提升，影像也無法更清楚，讓⼈們瞭解光學顯微鏡的 鑑別率極限約在半個波⾧左右。

⼆⼗世紀初，因為 de Broglie 物質波的理論，促成了德國物理學家 Ernst Ruska 在西元 1931 年發明了電⼦顯微鏡，利⽤⾼能電⼦束的極短波⾧來成像，空間解析 度可達到奈⽶級，因此獲得諾⾙爾物理學獎。由於數位影像、解析度、對⽐技術、

螢光標⽰等新穎的技術不斷被開發，使得同時期各領域如物理、化學、⽣物、材料 科學、微電⼦⽅⾯的顯微技術都相繼提出創新，掀起⼀波波科學界的波瀾。

顯微術的種類繁多，如電⼦顯微鏡、原⼦⼒顯微鏡、正⼦斷層掃描、核磁共振 顯影……等，其中光學顯微鏡在歷史上扮演的⾓⾊最為悠久，種類也最繁雜，光學 顯微技術可提供的主要優勢之⼀在於⾮破壞性的檢測，樣品的製備也相對容易，這 點對於需要觀察活體細胞組織的⽣物醫學應⽤格外重要。此外⼀般的細胞對於光照 是相對透明，因此光學顯微的技術能提供相對於其他樣本較深的穿透深度，約可到 達數釐⽶的穿透等級。

2.1.1 顯微鏡原理

⽇常⽣活中我們接收到的光學性質⼤多為線性的近似情況，但⾃從⾼能量密度 的雷射被發明後，許多⾮線性的修正項就必須被考慮，⾮線性光學的特性不同於以 往傳統光學特性，為⽣醫領域提供突破性發展，在⽪膚、⾓膜等表⾯組織都能有絕

佳的應⽤。

2.1.2 光學解析度

影像的品質決定於影像的放⼤、解析、對⽐、穿透等性質。影像的放⼤率主要 來⾃於⽬鏡與物鏡兩個影像放⼤效果，可由簡單的幾何光學折射定律與拋物透鏡的 成像法則推得物體的放⼤率，放⼤率越⼩，則視野越⼤，對於⼤範圍地搜尋⽬標較 容易;放⼤率越⼩，則視野越⼩，相對⽽⾔⽤來觀察細微⽬標物較為適當。

在顯微術裡解析度是⼀個重要的參數，可以⽤來決定能觀察到多細微的物體、

辨別相距多近的光點都是由解析度決定的。⽽影像解析度取決於聚光度（即⼊射光 被物鏡匯聚的程度），其限制條件成因來⾃波的繞射性質，當⼀個同調光的雷射穿射 物鏡的孔洞後會聚焦產⽣點擴函數（PSF, point spread function），點擴函數是⽤來描 述繞射極限的⼀種數學形式，以單狹縫（或點光源）的繞射圖形為例，單狹縫的繞 射圖形（sinc²函數如圖）即為狹縫空間函數（⽅波）的傅⽴葉轉換，經⼀⾯透鏡可 將此繞射圖形由無限遠處移⾄透鏡焦點。由此可看出點光源經透鏡聚焦後，焦點光 場強度截⾯將會形成⼀個⼆維的 sinc²圖形，也就是所謂的艾瑞盤(Airy disk)。以三 維空間來說，點光源經聚焦後的空間分佈我們稱為點擴散函數(PSF, point spread function)，PSF 越⼩，代表系統解析度越好 。

Figure 4 2-1點擴函數的傅⽴葉轉換

透過 Huygens-Fresnel 原理可知，每個波前的都可當成⼀個新的點光源，然後 各個新波再由重疊原理彼此⼲涉相消，於透鏡後聚焦呈現⼀繞射圖紋，我們試著去 估算其繞射條紋在空間中光強度的分佈，將透鏡上每點貢獻的光強度積分起來，由 Max Born可以得到被聚焦光點⾼斯光束強度的空間分佈為：

I(u, υ) = 2 J

( υ, ρ)e

ρ dρ

0

∫

2

此即為點擴函數，I 表⽰光的強度，

^{u = 4kzsin}

^{( a}

2 )

再做傅⽴葉轉換後得出的結果即為繞射圖形，且繞射⾓度和樣本的空間頻率有 關，⽽透鏡聚焦成像只是把無窮遠處的繞射圖形移到焦點處，所以我們可以說透鏡 焦點的光場分佈就是物體空間分佈的傅⽴葉轉換結果。

為了要計算徑向解析度，我們考慮在垂直光軸的平⾯(即 z=0 的焦平⾯)令 u=0，

I

2

就是所謂的 Airy disk 所以我們可以得到第⼀個零點出現在：

ν = ±3.8317 = krsin(a)

d

sin(a)=1.22λ

N.A.

I

(u, 0) = I

sin u u 4 4

2

如圖⽰，第⼀個零點出現在

^u

4 =

(N.A.)² 為軸向解析度。

根據上式軸向解析度與徑向解析度，可以得到透鏡在三維空間中的聚焦點⼤⼩，亦 可發現相同條件下，軸向⽐徑向解析度差。

在實際成像系統中，物鏡就像⼀個空間上的低通濾波器，收光時的⾓度有限⽽

損失許多⾼頻的部分，因⽽造成樣品細微部分的成像無法被看清楚。所以樣品上有 細微的變化量，在空間頻率上的變化會很明顯，會產⽣越⼤⾓度的繞射光偏折，理 論上若能將所有⾼頻折射光收集成像的話，就會越接近樣品原本的⾯貌。

2.2 單光⼦的螢光原理

螢光是⼀種受激發光的光學現象，透過吸收較短波⾧的⼊射光⼦，再經過⼀些 熱能的耗損後迅速放出較⾧波⾧的光⼦。⼀般物質分⼦上如圖⽰有許多能階態，將 這些能階態依電⼦⾃旋性質分成單態與三重態：電⼦⾃旋⽅向相反，⾃旋量⼦數為 零的狀態稱單態；電⼦⾃旋⽅向相同，⾃旋量⼦數為 1 稱為三重態。

根據 Jablonski 圖(Jablonski energy diagram)可以來解釋螢光機制，在基態 S⁰的

電⼦吸收滿⾜能階差的⼊射光⼦，再依據選擇規則躍遷⾄較⾼的單重態能(S1,S2,…) 或其他振動能態，通常處於⽐第⼀激發態更⾼階的電⼦容易被鄰近的分⼦因碰撞造 成能量損耗，（藉由熱來釋放能量回到初始態）⽽產⽣無輻射的內部轉換(internal

conversion)或振動弛豫(vibrational relaxation)（分⼦精細結構的能階損耗），電⼦迅 速降⾄第⼀激發態的最低震動能階，然後在此能階停留約 10^-9秒後，降回基態的各 級震動能階，同時釋放出能量，發出某波段範圍的光⼦，此發光機制即為螢光。

Figure 5 2-2[6] Jablonski能階圖

螢光的⽣命週期⾮常短，⼤約為 10^-5-10^-8秒。但若在第⼀激發態的電⼦經由另

⼀內系統轉換的機制，先降⾄三重態的能階，在分⼦光譜中，不同總⾃旋態的躍遷 是被禁⽌的，但還是有很⼩的機率可能發⽣，其⽣命期較⾧，從 10^-4秒⾄數分鐘、

甚⾄數⼩時都是有可能的。

接下來我們利⽤量⼦⼒學所學，加上微擾理論可推出單光⼦（線性）的吸收機 率，並可推廣到雙光⼦或其他多光⼦的吸收機率。

利⽤與時間相關的 Schrodinger ⽅程式:

(1) 若在無外界的⼲擾下，為未受激發影響原⼦的 Hamiltonian:

但現在我們對物質照射⼀雷射光源，則 Hamiltonian 需加⼊電磁波的電場效應。假設

⼊射電磁波的震盪電場所帶的位能為 V(t),則 Hamiltonian 變成:

代表⾃由電⼦的 Hamiltonian， 代表電⼦與電磁場交互作⽤的能量。

將展開成此組基底的線性組合 代⼊(1)

構成完整集合性質(complete set)，滿⾜正交歸⼀條件(orthonormal condition)

，且⼊射光源為單頻的弦波 可得:

(2)

其中 為交互作⽤項的矩陣元,

(2)通常無法精確解出，需藉助微擾法(perturbation)求解。

將V_mn寫成λV_mn，其中 λ 設為微擾參數，其值介於 0 和 1 之間，當 λ ＝1 時，即為 現實的物理現象。然後再將 Cm(t)以 λ 的冪級數展開：

C

(t) = C

(t) + λ C

(t) + λ

C

(t) +...

i!

( )

∂t = ˆ

Hψ !r,t ( )

H

H

H

H

H

V (t)

ψ r!

( )

^C

∑

^E

ϕ_n(r! , t)

ϕ^*m

( ) r, t

( ) r, t ^d

^{r =}

∫ ^{!E t ( ) = Ee}

^{+ E}

^e

i

dC

dt

C

( ) t ^V

e

∑

V

=

r !

( ) , 0 ^{V t ˆ ( )}

∫

( ) ^{r ! , 0 d}

^r

⁼

⁻

代回(2)可得C_m(t)的遞迴關係:

∑

=

n

t i mn mN

m N _{m n}

e V t dt C

t

i dC

) (

) ) (

( _{ω ω}

! (3)

的冪次 N 對應著 N 個光⼦的吸收機制，單光⼦的吸收為線性的激發⾏為，可由第

⼀階（N=1）描述。Cm(1)(t)定義為原⼦吸收單光⼦後從能階 g 躍遷到能階 m 的總機 率振福。我們先求出 Cm(1)(t)，再反覆帶回以求出 Cm(2)(t)和 Cm(3)(t)。

所以在(N=1)無外加光場下，電⼦絕⼤部分處於基態(ground state):C_!^! 𝑡 = 1 ， C_ℓ^! 𝑡 = 0(ℓ ≠ g)。且若要看⼀個原本處在基態(g)的原⼦被電磁波激發到任⼀激發 態(l)，則其對應的 V^mg為:

V_!" = 𝑢_!^∗ 𝑟 𝑉𝑢_! 𝑟 𝑑𝑟^! = 𝑢_!^∗ 𝑟 𝜇𝐸𝑢_! 𝑟 𝑑𝑟^! = 𝜇_!"(𝐸𝑒^!!"#+ 𝐸^∗𝑒^!"#) 所以(3)變成:

iℏ^!!!_!"^!(!)= −𝜇_!" 𝐸𝑒^!(!!"!!)!+ 𝐸^∗𝑒^{! !!"!! !} , 左右積分可得

C_!^! t = 𝑖

ℏ𝜇_!" ^!𝑑𝜏 𝐸𝑒^!(!!"!!)!+ 𝐸^∗𝑒^{! !!"!! !}

!

= 𝜇_!"𝐸

ℏ(𝜔_!"− 𝜔) 𝐸𝑒^!(!!"!!)!− 1 + 𝜇_!"𝐸^∗

ℏ(𝜔_!" + 𝜔) 𝐸𝑒^!(!!"!!)!− 1 上式的物理意義代表位於初始狀態原⼦上的電⼦躍遷⾄被激發後的能階，若電⼦狀 態⼀開始處於基態，則接收⼀激發電磁波後躍遷⾄ m 能階即單光⼦吸收項的情形由 上式第⼀項表⽰；倘若⼀開始電⼦狀態不為基態⽽是⼀⾼於基態的暫穩態，則接受

⼀激發電磁波後躍遷⾄較低的 m 能階情形由第⼆項來表⽰。第⼀項代表著吸收機制，

第⼆項代表受激發射(stimulated emission)是當能階 g 低於能階 m 才需考慮。

λ

平⽅後得到在時間 t 時，原⼦處於電⼦被躍遷⾄ m 能階狀態的狀態機率為:

P_!^! t = 𝐶_!^! 𝑡 ^! = 𝜇_!" ^! ℏ^!

𝑒^{! !!"!! !} − 1 𝜔_!"− 𝜔

!

𝐸 ^!

= 𝜇_!" ^! ℏ^!

4𝑠𝑖𝑛 𝜔_!"− 𝜔 𝑡 2

𝜔_!"− 𝜔 ^! 𝐸 ^!

因為光源強度與電場平⽅成正⽐，所以由上式可知，對於線性的吸收機制⽽⾔，電

⼦的躍遷機率和⼊射激發光源的強度成正⽐。

2.3 雙光⼦的螢光原理

[5]雙光⼦顯微術在 1990 年由 Denk 所率領的團隊提出，將雙光⼦激發螢光顯微 術結合超快脈衝雷射，此技術與共軛焦顯微術的基本架構類似，不同的是使⽤在短 時間內發出極⾼強度光⼦量的脈衝式雷射，⼀次以兩個較⾧波⾧的光⼦激發⼀個螢 光分⼦。因為螢光的⽣命週期（約 10^-5-10^-8秒）⾮常短，光⼦激發要在⽣命週期(約 10^-16秒)內吸收多顆光⼦才會發⽣反應。雙光⼦激發即必須在此間尺度內吸收兩個 光⼦，理論上我們可從前⾯量⼦⼒學加上微擾理論導出的光⼦吸收遞迴公式(2)，考 慮⾮線性的吸收機制(N=2)，同樣只保留雙光⼦吸收項:

iℏ𝑑𝐶_!^! (𝑡)

𝑑𝑡 = 𝐶_!^! 𝑡 𝑉_!"𝑒^!!!!"!

!

代⼊之前所推得的 Cm(1)(t)並積分可得:

C_!^! 𝑡 = 𝜇_!"𝜇_!"𝐸^! ℏ^!(𝜔_!"− 𝜔)

!

𝑒^!(!!"!!!)!− 1 𝜔_!"− 2𝜔 則電⼦被躍遷⾄ m 能階的機率為:

P_!^! 𝑡 = 𝐶_!^{(!) !} = 1 ℏ^!

𝜇_!"𝜇_!"

𝜔_!"− 𝜔

!

! 𝑒^{!! !!"!!! !}− 1 𝜔_!"− 2𝜔

!

𝐸 ^! 我們定義雙光⼦的躍遷機率：

R

P

t

因此我們可以得到初階的⾮線性吸收機制，電⼦的躍遷機率和⼊射機發光源強度的

⼆次⽅成正⽐。因此⼤為降低了焦點附近的激發作⽤，可達到點狀激發。

2.3 其他螢光性質

消光效應（quenching effect）：

螢光分⼦與其他分⼦間的交互作⽤是造成消光效應的主因，螢光分⼦與其他分⼦結 合後，經由激發光照射所帶來的能量可能會轉移到其他分⼦上⽽⾮⽤來激發螢光分

⼦，因此造成螢光⼤幅減弱，降低螢光分⼦的量⼦效率（quantum yield），減少螢光 光⼦數⽽不改變螢光光譜的形狀。

光漂⽩效應（photobleaching effect）：

發⽣在 2.2.1 提過的三重態，當電⼦被激發經過內部系統跨越到三重態，此時分⼦有 能⼒與其他分⼦發⽣複雜的化學變化，若螢光分⼦與氧分⼦發⽣反應，螢光分⼦將 被永久破壞並產⽣具有孤⽴電⼦的氧形成氧⾃由基(free radicals)，⽽被破壞的螢光 分⼦將不再被激發產⽣螢光。所以過⾼的激發光強度或是氧分⼦濃度會造成較嚴重 的光漂⽩效應。

2.4 與共軛焦顯微鏡的⽐較

Figure 6 2-3雙光⼦點激發⽰意圖

由於雙光⼦激發要求較⾼的光⼦量，幾乎沒有焦點外的螢光分⼦會被激發，所 以雙光⼦顯微術不需要像共軛焦顯微鏡⼀樣在另⼀側的對應焦點上⽤針孔濾除背景，

所以 z 軸⽅向的⾼對⽐度為雙光⼦顯微術的最⼤優點。

⼀般傳統上，若要穿透可觀厚度⽽獲得⽣物組織內的細胞資料，切⽚⽅法可提 供⾼解析度的影像。但是切⽚每次只能探測⼀個⼆維的平⾯且有可能破壞三維的結 構，同時切⽚的樣品必須經過化學處理及固定，無法觀測活體。以上的缺點都可改

⽤共焦顯微術與雙光⼦顯微術克服。

點激發的優點:

(1)因只在焦點處激發，所產⽣的熱破壞侷限在焦點處，⽽不會對其他地⽅產⽣破壞，

產⽣光漂⽩(受激發的分⼦若在發光前遭其他碰撞⽽減少螢光的產⽣)效應。對活體

的⽣物組織承受⼒較強，不僅⼤幅提升觀測深度，也給予活體進⾏⾧時間觀測的能

⼒。

(2)因點狀激發所以可確保取得的訊號必來⾃焦點區域，可避免以往⽤單光⼦共軛焦 顯微鏡會在焦點外激發，收到的訊號會混雜交點前後的光，⼤幅改善了成像品質。

(3)不需要像共軛焦顯微鏡在光路上架設 pinhole，掃描組織三維的影像即可達到「光 切⽚」的效果。

以往需要在紫外光波段才能激發的螢光分⼦(如 DAPI)，現利⽤近紅外光波段(約 780nm)的光⼦即可激發，近紅外光波段的光⼦具備以下特點:

(1)近紅外光⽐起紫外光較不易被⼀般⽣物組織吸收，因此可提⾼聚焦影像的深度;

同時⽣物組織也不易吸收此波段光⼦，所以可降低對⽣物樣品的破壞。

(2)波⾧較⾧的近紅外光，在固定光程差下產⽣的相位差較⼩，因此可以縮⼩球⾯像 差，提⾼辨識性。

Chapter3 實驗架設

3.1 雷射光源的⾮線性光學顯微鏡

實驗使⽤的激發光源「laser」是受激輻射之光放⼤（light amplification by stimulated emission of radiation），利⽤原⼦或分⼦能階間的躍遷來產⽣輻射，再藉 由內部光學鏡腔之迴授(feedback)以激發雷射介質產⽣更多的光⼦，⽽受誘導所輻 射出的光⼦與⼊射光⼦具有相同的頻率、相位和⽅向，形成同調光。正因如此可有

⾼功率、⾼同調性與⽅向性。

此外雷射的輸出可分為兩種，⼀是連續輸出，稱為連續波雷射(CW laser);第⼆

種為不連續的脈衝輸出，稱為脈衝雷射(Pulse laser)，本實驗室選⽤的雷射即為脈衝 雷射，摻鈦藍寶⽯⾶秒雷射系統是⼀經由固態⼆極體雷射激發產⽣波⾧為 690-1080

nm的基頻雷射光，再經由鎖模(mode lock)技術將雷射變成約 75fs 的超短脈衝雷射 出光。

鎖模(mode lock)是⼀種將連續雷射轉換成極短脈衝雷射的技術，脈衝寬度可達

10^-15s，甚⾄可達 10^-18s。「模」就是指在共振腔內不同的共振頻率的波，雷射的波

⾧因激發物質的特性本⾝就會有⼀個頻帶，⽽共振腔的⾧度會限制容許內部個頻波 間隔的條件，因此每個雷射的共振腔內會有其所能容許的模。將各個模的相位關係 固定起來做⼲涉效應，然後達到短脈衝的雷射。若相位是雜亂變化的，則雷射輻射 會被平均成連續輸出的雷射光;⽽若是將彼此相位固定住，則會互相⼲涉⽽產⽣⼀週

期性的脈衝雷射光，⽽若越多模參與作⽤，則脈衝週期會越⾧，脈衝光的振幅會越

⾼，可達到瞬間極⾼功率的效果，有利於雙光⼦的激發。

3.2 光學系統架設

Figure 7 3-1實驗裝置架構圖

如附圖本實驗室使⽤⼆極體雷射（Millennia X, Spectra Physics）激發鈦藍寶⽯

脈衝式鎖模雷射（Ti: sapphire, Tsunami, Spectra Physics, Mountain View, CA） 做為 輸出光源，我們調控雷射波⾧在 780nm、垂直⽅向震盪的線偏振光，脈衝寬度約為 75fs，脈衝頻率約為 80MHz。經由⼆分之⼀波⽚（half wave plate）、線偏振⽚（linear polarizer）。實驗的雷射強度可藉由調整偏振元件的旋轉⽅向或直接改雷射出光強度 來調控光源強度，⽽透過 x-y 軸的鏡組（MicroMax™ Series 670 Single Axis Board Level Mirror Positioning System, Cambridge Technology, Cambridge MA）調控微⼩

⾓度⽽改變反射聚焦點位置來達到 x-y 平⾯快速掃描。雷射光經過 x-y 掃描鏡後再 經由擴束器（beam expander）以填滿物鏡的後孔鏡（back aperture）確保達到物 鏡最⾼的 NA 值，最後⼊射光在進⼊倒⽴式顯微鏡（Nikon TE-2000U, Japan）後藉 由 45°擺放的主分光鏡（main dichroic mirror）反射⼊射光訊號進⼊物鏡後在樣品 上聚焦。所以焦點處產⽣的螢光訊號被物鏡接收後穿過主分光鏡再進⼊⾃製訊號接 收箱，內由⼀組⾧波⾧穿透的分光鏡 416 560 493 分離不同波段光源，再分別通過 四⽚光學濾⽚ band pass filters：HQ390/18（通過波⾧為 381nm-399nm）、HQ630/92

（通過波⾧為 584nm-676nm）、HQ525/50（通過波⾧為 500nm-550nm）、HQ457/50

（通過波⾧為 432nm-482nm）以濾掉不必要的雜訊和將激發光源分成⼆倍頻訊號 及可⾒光波段的紅、綠、藍頻道，最後由光電倍增管（photon-multiplier tube, R7400P, Hamamatsu, Japan）作為偵測器，將光訊號轉成電訊號傳送⾄電腦中分析。

3.3 螢光染劑介紹

細胞核染劑 Hoechst33342

[10]在細胞凋亡的早期，發現有染⾊體濃縮 (chromosome condensation)的情況，

染⾊質會聚集成半⽉狀沿著核膜周圍分佈，以及出現細胞核萎縮 (pyknosis); 晚期 時細胞膜皺褶、失去原有細胞⾻架但胞器仍在，胞膜及胞漿保持完整，去氧核糖核 酸 (DNA) 會斷裂成特定⼤⼩⽚段 (180-200 base pair) ，以及有凋亡⼩(apoptosis bodies) 的產⽣，最後被鄰近的細胞清除。

Hoechst33342是⼀種螢光染劑，分⼦式為 C²⁷H37Cl3N6O4_，能夠滲透細胞膜且與 DNA核酸的鹼基對結合，受到 350nm 激發後放出 461nm 波⾧的藍⾊激發光，因此 我們可以利⽤這種特性去針對染⾊體做標定並偵測其含量。

Figure 8 3-2 Hoechst33342分⼦式與結構⽰意圖

Copyright © 2016 Bio-Rad Laboratories, Inc. All rights reserved.

細胞質染劑 cell tracker CMTMR

[7]分⼦式 C³²H28ClN3O4的橙⾊ CellTracker™ CMTMR 螢光染劑被設計為能⾃由地通 過細胞膜傳遞到細胞中，與細胞質中的胞漿酶結合，裂解成螢光團轉換成細胞膜⾮

透性的反應產物，染劑顯⽰出理想的追蹤性能;它是穩定的，在⼯作濃度內能很好地 保留在細胞中，受到 545nm 激發後放出直 565nm 波⾧的橘⾊激發光，適合⽤於監 測細胞的運動或型態。

Figure 9 3-3 cell tracker CMTMR分⼦⽰意圖

Figure 10 3-4螢光輻射激發波⾧⽐較光譜圖

利⽤螢光染劑分佈在不同波⾧，能有效分辨不同位置訊號

Alexa Fluor® 488 Phalloidin

[7]是⼀種分⼦探針，⽣物標記性的⿁筆環肽，是從具有致命毒性的蕈菇萃取出來的，

由兩個氨基酸殘基組成的雙環肽，親和⼒⾼，能夠重複與 F 肌動蛋⽩(F-actin)位點 結合，形成⼀個內部環狀的結構，此聚合物⾮常穩定，不太會受到升⾼溫度⽽產⽣

的解聚合反應，⼤⼩約為 12-15Å，且分⼦量⼩於 2000，並可在受到 495nm 激發出

518nm波⾧的螢光被觀察。極易溶於⽔，⽅便使⽤於組織或細胞的染⾊過程，但對 於環境的 PH 值較敏感，若 PH 值提⾼，將會降低結合。細胞⾻架(Cytoskeletal)的 微絲蛋⽩富含肌動蛋⽩成分，所以廣泛地⽤此探針來標記，觀察細胞的型態。

Figure 11 3-5 Alexa Fluor® 488 Phalloidin 分⼦⽰意圖

Chapter4 實驗材料與⽅法

4.1 肺腺癌細胞的篩選

[2]此實驗使⽤的⼈類肺腺癌細胞系 cell line 的建⽴，是由中⽼年病⼈⾝上取出 低分化率的肺癌細胞，保存在 RPMI-1640 培養液（內含 10%FBS）中，被繼代超過

60代傳遞，並經實驗證明經由轉植⼊在裸⿏⾝上誘發的腫瘤依然保有肺腺癌本⾝特 性。根據細胞的侵⼊、遷移的能⼒(invasive ability)做分級的命名，將⼀種含有許多

⼋毫⽶孔洞的聚碳酸脂膜(membrane)，其上塗佈含有基底膜凝膠及膠原蛋⽩，置放 在含有⼤⼩孔板之間，⽤來分離兩室的腔室(Transwell Invasion Chamber )作為細胞 培養盤，再將培養中的細胞懸浮於 RPMI 培養液(內含 10% NuSerum)放⼊並置⼊

37.8℃的環境 72 ⼩時，穿透膜並遷移到下⽅腔室的細胞被收集，繼續同樣⽅法進⾏

第⼆輪的篩選，被隔離的細胞命名為 CL1-0，第⼀輪穿透的細胞則命名 CL1-1，接 續命名為 CL1-2,-3,-4,-5，使⽤此⽅式建⽴細胞系的遷移能⼒分級。

Figure 12 4-1細胞侵襲能⼒分級篩選⽰意圖

CL1細胞有⼀個⾮常典型的上⽪樣細胞形態（如附圖 1）;⽽經過篩選的 CL1-1 細胞與之相⽐，更⼩且更圓，貼附能⼒較低，較容易從組織培養⽫除去（如附圖 2）。

Figure 13 4-2 CL1-0與 CL1-1 對⽐⽰意圖

Chu, Y.-W., et al. (1997). "Selection of invasive and metastatic subpopulations from a human lung adenocarcinoma cell line." American journal of respiratory cell and molecular biology 17(3):

353-360.

之後將篩選後的細胞系複製培養後，植⼊⼩⿏中觀察腫瘤的⽣成情形，發現遷 移能⼒越好的細胞，同時腫瘤成⾧速度也越快，可間接使⽤此分級代表細胞系惡化 的情形。本實驗所使⽤的細胞系 CL1-0 與 CL1-5 來源為台⼤醫學院陳惠⽂教授所提 供。

Figure 14 4-3 CL1-0與 CL1-5 在 CCD 顯微鏡下影像圖

左圖為使⽤ CCD 拍攝的細胞系 CL1-0（偏圓形）與右圖細胞系 CL1-5（紡錘形）

4.2 細胞培養

1.使⽤ RPMI1640內含 10%Fetal Bovine Serum(FBS)與 1%的 P/S 做為成⾧配

⽅，在 T-15ml 的細胞培養瓶中單層⽣⾧。

2.加⼊ 1ml 的 Trypsin-EDTA 置於 37℃20sec，⽤微量吸管抽吸掉廢液，加⼊

5ml的 PBS 將吸附在瓶壁上的細胞打下再吸⼊ 15ml 的錐形管中。

3.⽤ 5 分鐘 1000r.p.s 轉速離⼼後，吸出上懸液並加⼊培養液後 2-3ml 攪拌均 勻，取 10ul 進⾏細胞計數，再⽤培養液稀釋到 1^X10⁵個細胞數/ml。

4.⽤酒精將玻⽚消毒後置⼊⼩培養⽫中，加⼊ type-l collagen 進⾏表⾯貼附 24⼩時以上，吸出廢液種⼊稀釋過的細胞 2ml。

5. 待 24 ⼩時細胞貼附後進⾏細胞染⾊。

4.3 細胞染⾊程序

1.吸出廢液後加⼊ 2µM cell tracker (in RPMI)與 1.5µg/ml Hoechst 33342(in RPMI)2ml染⾊置於 37℃避光 30 分鐘。

2.吸出染劑後使⽤ PBS 沖洗兩次，使⽤ 3.7%福⾺林(formaldehyde)1ml 固定細胞 10 分鐘。

3.吸出廢液後，使⽤ PBS 沖洗三次後加⼊ Tx-100 0.1% 1ml，靜置三分鐘，破壞細 胞膜，以便染劑滲⼊。

4.吸出廢液後，使⽤ PBS 沖洗兩次後，將貼附細胞的玻⽚覆蓋在滴有 200nM

Phalloidin488 100ul的 parafilm 上，確保完全貼附靜置 30 分鐘待染劑滲⼊細胞與 其肌動蛋⽩結合。

5.將玻⽚夾起，以 PBS 沖洗三次後，使⽤ ProLong® Gold 10µl 進⾏封⽚，可延⾧保 存期限於 4℃。

Figure 15 4-4細胞染⾊⽰意圖

4.4 實驗材料介紹

1. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA.4Na)：Trypsin 為胰蛋⽩酵 素，其作⽤為分解細胞與瓶壁之附著蛋⽩，EDTA 為 chelating agent，其作⽤為去除 Ca²⁺、Mg²⁺等離⼦，trypsin 與 EDTA ⼆者共同作⽤，可使附著之細胞⾃瓶壁脫落，

此為收集吸附型細胞常⽤之⽅法。本為⼤體積包裝，分裝於 15ml 無菌試管中，保 存於-20℃，避免反覆冷凍解凍造成 trypsin 之活性降低，並可減少污染之機會，使

⽤前放在 37℃恆溫⽔槽中回溫。

2. 福⾺林(formaldehyde)：實驗中加⼊福⾺林(formaldehyde)的⽤途是固定細胞，

細胞的肌動蛋⽩可以被交聯(crosslinks)，細胞將維持其樣貌與型態，完整貼附在玻

⽚上(如下圖)。

Figure 16 4-5[16]肌動蛋⽩被交聯後貼附固定⽰意圖

3. 膠原蛋⽩原液(TypeⅠCollagen)：染⾊的培養玻⽚使⽤前會先貼附⼀層膠原蛋⽩

溶液，成份是由豬萃取純化過的膠原蛋⽩原液（Sunmax Biotechnology Co. Ltd.），

濃度為 3mg/mL，儲存在 4℃，使⽤前稀釋 20 倍 2ml 去貼附在培養⽫內的玻⽚ 24hr 以上。

4. ProLong® Gold Antifade Reagent with DAPI：是⼀種固定細胞、抑制螢光頻譜漂

⽩的膠著劑，能對螢光標記的標靶分⼦螢光訊號達到有效率的儲存，以便細胞能被 適當地⾧時間保存。

4.5 實驗分析⽅法

做實驗之前會使⽤螢光標準⽚對雷射光源強度進⾏校正，使⽤雷射光源強度為

300mW-500mW對樣品進⾏激發，將掃描接收到的訊號經由光電倍增管放⼤成為電 訊號，再傳送到電腦處理。

影像數位化後，所得到的影像資料乃是⼀個個「像素」(Pixel)所組成的，每個

像素都有特定的座標，且相對應於物體上的⼀個點。每個像素的值，⼀般稱作「灰 度值」(Gray Level)，其值由所對應物體的亮度來決定，灰度值愈⼤，表⽰亮度愈⾼。

假如每個像素的灰度值由 8 位元來表⽰，則代表 2 的 8 次⽅，則亮度變化區間介於

0⾄ 255 間。

[12]⼆值影像(Binary image,1 bpp(bits per pixel))是將彩⾊影像的每⼀像素 (pixel)先轉成灰階值(gray)後，再與事先給定的⾨檻值(threshold)相⽐，如果計算得 到的灰階值⼤於或等於該⾨檻值，則將此點的顏⾊設為⽩⾊;如果計算得到的灰階值 是⼩於該⾨檻值,則將此點的顏⾊設為⿊⾊。本實驗分析時使⽤⼆值圖像，不討論灰 度值（與強度變化有關），先決定出細胞的邊界再利⽤[15]影像處理軟體 ImageJ 計 算圈選出的邊界⼤⼩，並計算其⾯積或體積。

像素⼤⼩(Pixel size)指的是個別感測像素的實際⼤⼩尺⼨(⾧ x 寬)，像素愈⼤，

則所需曝光成像時間較短，但會犧牲空間解析度。反之，像素愈⼩，則需較久的曝 光成像時間，成像之後的影像解析度則較好。本實驗影像選⽤ 512x512pixels 也就 是 16 位元的影像，所以曝光時間固定，我們以 μm 為計量單位，本實驗影像使⽤

Nikon, 20x, NA 0.75, Fluor, WD1.0的物鏡，16 位元，實際⼤⼩是 340nmx340nm，

所以 1pixel ⾧度是 0.665μm 之後使⽤此條件進⾏換算。

Figure 17 4-6將細胞影像換成⼆值影像以有效圈選邊界

Figure 18 4-7將圈選的細胞核影像與細胞影像做⽐對

細胞外形的多變異/細胞核外形的多變異

我們主要是看細胞外形及細胞核外形的畸形程度利⽤計算細胞⾯積與細胞周⾧，為 簡單的判別細胞外型，我使⽤圖形圓形率(Circularity)對兩種細胞做計算，定義圓形

率為： ;也就是對細胞或細胞核⾯積除以圖形周⾧再乘

以 。直觀的來看細胞的相對外型的圓形率，若外形愈不規則，變異數越⼤，則其 圓形率越⼩;反之，外型愈規則、變異數越⼩，則越接近 1。

circularity≡ 4π ×

[Perimeter]²

4

Figure 19 4-8細胞外型/細胞核外型 多變異⽰意圖

Chapter5 實驗結果

Figure 20 5-1 CL1-5的螢光影像 左圖是 cell tracker 右圖是 Hoechst

Figure 21 5-2 CL1-0的螢光影像 左圖是 cell tracker 右圖是 Hoechst

Figure 22 5-3針對 CL1-0 與 CL1-5 的核質⽐個別做圖

Figure 23 5-4 NC ratio diagram

CL1-0 CL1-5 Nuclei Area (µm²) 192.9±99.29 206.5±119.61 Cytoplasm Area (µm²) 241.6±129.85 440.0±263.12 NC ratio 0.83±0.224 0.50±0.174

Figure 24 5-5 Area NC ratio ⽐較表格

直觀的看細胞外型變異，透過計算其圓周率，得出如下結果：

CL1-0 CL1-5

Nuclei Circularity≤ 0.3 5.5% 80.6%

Nuclei Circularity 0.3-0.5 25.5% 16.1%

Nuclei Circularity 0.5-1 69% 3.3%

Figure 25 5-6 Nuclei Circularity ⽐較表格

Figure 26 5-7 Nuclei Circularity 圖表

CL1-0 CL1-5

Cytoplasm Circularity≤ 0.3 24.5% 69.9%

Cytoplasm Circularity0.3-0.5 40.9% 24.7%

Cytoplasm Circularity 0.5-1 34.6% 5.4%

Figure 27 5-8 Cytoplasm Circularity ⽐較表格

Figure 28 5-9 Cytoplasm Circularity 圖表 Nuclei Circularity

0.3 Nuclei Circularity

0.3-0.5 Nuclei Circularity 0.5-1

CL1-0 5.50% 25.50% 69%

CL1-5 80.60% 16.10% 3.30%

0.00%

10.00%

20.00%

30.00%

40.00%

50.00%

60.00%

70.00%

80.00%

90.00%

Nuclei Circularity

Cytoplasm

Circularity 0.3 Cytoplasm

Circularity 0.3-0.5 Cytoplasm Circularity 0.5-1

CL1-0 24.50% 40.90% 34.60%

CL1-5 69.90% 24.70% 5.40%

0.00%

10.00%

20.00%

30.00%

40.00%

50.00%

60.00%

70.00%

80.00%

Cytoplasm Circularity

本實驗統⼀使⽤ ImageJ 內建的偵測邊緣的函數，去計算圈選細胞的周⾧，得出 的結果再分成三級。可以發現 CL1-5 較 CL1-0 細胞變異性⼤，不只是細胞核、細胞 外型也相對變異⼤。

計算的結果⼤致符合預期，如果癌細胞代表不成熟細胞的假設成⽴，那麼癌化 越嚴重的細胞成熟度越低，細胞核分化越明顯也就越⼤。由前⾯數據計算平⾯的細 胞⾯積結果可得 CL1-5 相對於 CL1-0 的細胞核較⼤，但在細胞整體⽽⾔佔的⽐例較 低，核質⽐(NC ratio)較 CL1-0 低。

使⽤雙光⼦螢光顯微鏡對 Z 軸做深度的掃描，每 1μm 取⼀張影像，總共取 30 張影像，做成 3D 的⽴體圖去做細胞圈選，得出細胞與細胞核的體積。三維的核質

⽐與平⾯核質⽐相較之下會來得有意義，因為再取平⾯的影像時常常無法完整量化 細胞核的⼤⼩，可能只是切平⾯上其中⼀個截⾯，所以得出的結果也與平⾯核質⽐

不同。[9]

Figure 29 5-10 CL1-0染 CMTMR 的 Z 軸掃描(由左⽽右、由上⽽下)

得到 CL1-5 體積的結果與平⾯有很⼤的不同，但核質⽐的分佈仍然是 CL1-5 較⼤

Figure 30 5-11 CL1-0細胞核染 Hoechst 的 Z 軸掃描

CL1-0 CL1-5 Nuclei Volume (µm³) 4587.2±1994 1814.7±913 Cytoplasm Volume (µm³) 4676.3±1834 2150.2±1151

NC ratio 1.03±0.4 0.85±0.2

Figure 31 5-12 Volume NC ratio ⽐較表格

Chapter6 問題討論與未來展望

6.1 實驗問題討論

1. 要獲取好的實驗影像圖必須使影像強度夠⾼，才能與背景閾值有⾼對⽐度以利邊 緣化的圈選。所以⽬標是使影像每個像素值有 100photon counts 以上的強度。根據 實驗使⽤的螢光染劑應該可以嘗試更換更好標⽰的細胞質染劑，根據[7]Hand Book 顯⽰的此螢光染劑相對於其他染劑的螢光強度是較弱的，若能嘗試別種類的染劑試 驗，未嘗不是個⽅法。

Figure 32 6-1[7]螢光強度對 Cell Tracker 種類圖

1.calcein AM, 2.BCECF AM (B1150), 3.fluorescein diacetate (FDA, F1303), 4.carboxy fluorescein diacetate (CFDA, C1354) and 5. CellTracker™ Green CMFDA (5-chloromethyl-fluorescein diacetate, C2925, C7025).

2. 因為癌細胞屬於未成熟的細胞，有包含許多不規則的細胞核，所以⾃動圈選細胞 的時候，需要⼀⼀篩選確認位置吻合，此細胞中是否包含兩個以上的的細胞核，這 部分需要另外搭配寫⾃動化圈選的程式以便分析更快速更流暢順利。

3. 計算體積使⽤的套件有將體積算⼤的疑慮，因為 Z 軸解析度不夠好，僅 1.78um，

且掃圖時是以每張間隔 1um 去進⾏計算，⾃然辨別度不夠，無法得出準確的圖。且 計算體積的 ImageJ 套件在圈選的演算法過程有可能會有辨別錯誤的問題，[9]例如 在分層的影像內有可能包含⼀顆以上的細胞，所以 ImageJ 進⾏圈選時有可能⾼估其 體積，在計算上就無法達到完全精準。

6.2 未來展望

在本實驗中計算細胞核質⽐確實提供印證了形態學與病理學的假設，也提供了

⼀個可參考的變數來對癌細胞做了解，[9]但細胞核質⽐的計算會因為不同研究團隊 對⾨檻閥值的設定不同⽽各有所差異，有可能有⾼估的情形發⽣，所以若能統⼀其 研究⽅法來對⽐數據，相信是更有效的參數。我們也對病⼈罹癌周圍的正常肺部纖 維母細胞(Normal Fibroblast)做染⾊，可以清楚看到其型態與癌細胞迥異，預計之 後會針對細胞型態做分析，再將分析結果與癌細胞數據做⽐較。

Figure 33 6-2 Normal Fibroblast 左：CCD 影像 右：染⾊後螢光影像

根據肺腺癌細胞侵襲轉移能⼒的分級是否完全區隔其細胞特性有待商確，因為 其細胞株經過不斷複製、繼代培養與⼈體內實際的癌細胞轉移能⼒與體內免疫系統

運作的機制仍有不⼩的落差，若能針對對腫瘤組織做⽴體跟深度的掃描，能幫助我 們更了解癌細胞侵襲與轉移的機制，⽬前實驗室在搭建的 3D 切⽚技術，預計在不 久的將來可運⽤在更深⼊的研究，能更瞭解癌細胞真實運作的機制。

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