實驗方法

2-1 藥品與儀器

2-1-1 一般敘述 藥品：

菌種培養液藥品購自 Merck、Difco 公司

活性測試用藥品及緩衝液購自 Merck、Aldrich。

各式 Kit 購自 GeneMark、Viogene 儀器：

恆溫培養箱 (EYELA NDO-450ND, RISEN refrigerated circulators) 搖動培養箱 (FIRSTEK SCIENTIFIC B602D, S300R, S302R) UV 吸收光譜儀 (HP 8452A)

高速離心機 (KUBOTA 7820)

電子噴灑式串聯質譜儀 ESI-Q-Tof (Micromass) 超音波震盪器

聚合酶連鎖反應器 (GeneAmp PCR system 2400, 9700) FPLC system (Pharmacia Biotech FPLC)：

層析管柱

HiTrap Desalting column (Pharmacia, 5 mL) HiTrap SP column (Pharmacia, 5 mL)

HiTrap Q column (Pharmacia, 5 mL) HIC (Hydrophobic interaction column) Q column

2-1-2 自製藥品與合成化合物 自製膠狀幾丁質：

10 公克的幾丁質粉末先以 95%酒精潤濕，加入濃鹽酸 50 ~ 100 mL，輕晃使幾丁質粉末與濃鹽酸接觸，在室溫下放置進行酸水解反 應 1 ~ 2 小時，離心去除雜質與未反應完之幾丁質，取上層液加水稀 釋直到沉澱產生，離心取沉澱物，再用水清洗沉澱物數次，以氫氧化 鈉中和，然後繼續水洗沉澱物數次去除鹽類，最後以 20 mM pH 7.0 的磷酸緩衝液調整至約 1%的膠狀幾丁質懸浮液，於 4 ℃下保存。

受質 (β-chitobiosides ) 的合成 ^{(23, 24)}(由實驗室 Mahesh、Keshab 協 助提供)：

本實驗室已建立由 Serratia marcescens 之幾丁質酵素

(ChiA_NCTU) 大量生產幾丁雙糖之方法⁽¹²⁾，利用此法可製備大量幾 丁雙糖以提供合成β-chitobiosides 與抑制劑 N-bromoacetyl chitobiosyl amine 的反應起始物。

乙醯化幾丁雙糖：將乾燥、純的幾丁雙糖放入 50 mL 的

dichloromethane 中，然後加入 40 g 的 acetic anhydride (Ac₂O) 和 19.6 g 的 triethylamine (TEA) 以及 40 mg 的催化劑 DMAP [4-(dimethyl-amino)-pyridin]，在室溫下攪拌 3 小時反應，之後添加過量 dry diethyl ether，繼續攪拌超過 30 分鐘直到 per-acetyl chitobiose 沉澱出來，將 沉澱物過濾，再以過量的 diethyl ether 清洗以移除過量的 TEA 和 Ac2O，於室溫下真空乾燥兩小時得到α-form 與β-form 的 per-acetyl chitobiose 混合物，以 methanol 再結晶之。

α/β-chitobiose 之氯化反應：10 mmole 的 per-acetyl-α/β-chitobiose 與 11 mmole 的 phosphorus pentachloride 在 20 mL 的 dry methylene chloride 中攪拌，加入 10~20 μL 的 boron trifluoride

etherate，攪拌 60 小時之後，低壓下使溶劑揮發，得到 crude per-acetyl-α/β-chitobiosyl chloride。

偶合反應：3 mmole 的 substituted phenol (在 1 mL 的 CH

3CN) 加 入攪拌的 1.5 mmole per-acetyl-α-chitobiosyl chloride 與 12 mmole dry Ag2O 在 10 mL CH3CN 之混合物，攪拌 24 小時後，過濾去除銀鹽，

再將溶劑揮發，產物用過量 ethyl acetate 溶解，然後用水清洗 ethyl acetate 層，以低壓揮發溶劑，得到含 phenyl 之 per-acetyl-β

-chitobioside。

去乙醯化：將 per-acetyl-β-chitobioside 放入 10 mL dry methanol

中，在 4 ℃、氮氣下加入 1 mL acetyl chloride，攪拌 overnight，此時 去乙醯化的衍生物慢慢沉澱出來，低壓去除溶劑，可得最終產物如 下：2,4-dinitrophenyl-β-chitobioside (2,4-DNPCB)、2,5-dinitrophenyl-β-chitobioside (2,5-DNPCB)、3-nitrophenyl-β- chitobioside

(3-NPCB)、4-nitrophenyl-β-chitobioside (PNPCB)、4-cyanophenyl-β -chitobioside (4-CNPCB)、4-chloro-2-nitrophenyl-β-chitobioside

(4Cl-2NPCB)。NMR 圖譜於附錄二。

抑制劑的合成 ⁽²⁵⁾(由實驗室 Mahesh、Keshab 協助提供)

將乾燥的幾丁雙糖，於 30 ℃下，飽和碳酸銨溶液中反應 7 天，

用過量的 DMF 溶解生成的α/β-chitobiosyl amine，再以丙酮或 diethyl ether 將其沉澱。

0.25 g 的α-chitobiosyl amine 在過量 DMF 中攪拌，將存在 DMF 中的 0.15 g bromoacetic anhydride 緩慢加入，反應 20 分鐘後，加入過 量的 diethyl ether 將生成的 N-bromoacetyl chitobiosyl amine 沉澱。

NMR 圖譜於附錄二。

2-1-3 表現載體來源：

本實驗室由 B. cereus NCTU2 選殖(clone)的幾丁質酵素先前已將 含訊息月生肽的全長 ChiNCTU2 基因建構於表現載體 pET-22b(+)之 Nde I 與 Xho I 限制酶切位中，且 pelB leader 已被移除，命名為

pET22/chi-sp，本實驗即利用此質體做為後續表現與定點突變 (site-directed mutagensis)用。

2-2 幾丁質酵素誘導與純化

質體 pET22/chi-sp 被轉型至大腸桿菌勝任細胞 BL21 (DE3)，在 500 mL 含 0.1 mg/mL Ampicillin 的 LB 培養液中，於 37 ℃培養箱，

轉速 120 rpm 下培養約 16 小時。

6500 rpm 轉速離心 500 mL 培養液，以 20 mM pH 7.0 的磷酸緩 衝液 5 mL 回溶沉降菌體，使用超音波震盪打破菌體 (冰上進行)，再 以轉速 15000 rpm 高速離心取得胞內酵素後，以高速液相層析系統 ( fast purification liquid chromatography, FPLC) 進行純化工作。

2-2-1 Phenyl Sepharose High Performance (Hydrophobic interaction column, HIC) 層析

先以蒸餾水流洗 HIC，再用 pH 7.0 含銨鹽的磷酸緩衝液 [20 mM Na

₂

HPO

₄

含 1 M (NH

₄

)

₂

SO

₄

] 平衡 HIC。

將胞內酵素緩慢注入 HIC 中，利用銨鹽梯度 (1 ~ 0 M) 進行酵素 分離。以流速 1 mL/min 流洗 HIC，每三分鐘收集一管流洗液，收集 的流洗液分別取樣做活性測試，測得活性的流洗液再以蛋白質電泳膠 片 (SDS-PAGE) 估計其均質度 (homogeneity)。

2-2-2 Q Sepharose High Performance 層析

2-3-1 DNS (3, 5-Dinitrosalicylic acid) 酵素活性測試方法

待測樣品中加入少許的 1％膠狀幾丁質，與等量體積 DNS 試劑 於 95 ℃加熱 10 分鐘顯色，測量波長 540 nm 的吸收值。

DNS 試劑（避光）: 等量體積的酒石酸鉀鈉溶液與 DNS 溶液混勻。

60% (W/V) 酒石酸鉀鈉溶液 (Potassium Sodium Tertrate) DNS solution：0.96 % DNS (3,5-Dinitrosalicylic acid)

3.07 % Sodium Hydroxide 反應機構：

Potassium Sodium Tertrate

3-amino-5-nitrosalicylic acid (紅棕色)

2-3-2 以 PNPCB 為受質之活性測定

以適量酵素與 PNPCB 作用，觀測 p-nitrophenol 之釋放速率，觀 測波長為 p-nitrophenol 與 p-nitrophenolate 之等吸光點 (348 nm)^(附錄三) 或 p-nitrophenolate 之最大吸光點 (400 nm)。

2-4 定點突變

以質體 pET22/chi-sp 為模板，利用 Quik-change 的方法作定點突 變，為能快速初步篩選已突變之基因，引子 (primer) 序列中已包含

E145G-B

5’ -- AAT ACC GGA TCC AAG GTC GAT ATC TAT TCC ATC --3’

Y213F-F

5’ -- CCA ATT ATT TTC GGA GTG AAC GAT AAG CTT ACA TAC --3' Y213F-B

5’ -- GTA TGT AAG CTT ATC GTT CAC TCC GAA AAT AAT TGG --3'

2-5 蛋白質濃度測定

由 BCA assay 方法建立的蛋白質檢量線^(附錄四)A562 (OD) = 3.8471×

10^-2 × [BSA 濃度] + 8.6419×10^-2，配合μυ吸收光譜，可計算得 ChiNCTU2 在波長 280 nm 下的 E^1%= 13.9 OD，因此爾後測量幾丁質 酵素在波長 280 nm 的吸收值便可計算得濃度。

2-6 酵素分子量與水解反應的產物分析 分子量之測定以液相層析質譜分析為主。

2-6-1 電灑式-質譜儀 (Electron-spray ionization MASS, ESI/MASS) 偵 測酵素分子量

將少量 (約 5~10μg) 已純化的酵素注入 C-18 管柱中，以 0.08 mL/min 之流速，先注入 H

₂

O：CH

₃

CN：1% HCOOH = 80：10：10 混合液流洗出管柱內鹽類，再注入(CH₃)2CHOH：CH

₃

CN：HCOOH = 10：10：4 之混合液將酵素由管柱流洗入質譜儀偵測，所得一系列之 質/荷比峰，經換算可得蛋白質分子量。

Bam HI

Hind III

Hind III

2-6-2 電灑式-質譜儀測定酵素水解產物

取 1%自製膠狀幾丁質約 10 ~ 20 μL 與少許 ChiNCTU2 於 37 ℃ 下反應數小時，使用電灑式-質譜儀分析反應最終產物。

2-7 動力學條件

2-7-1 K

_m

和 k

_cat

之測定

6.38 nM 的 ChiNCTU2 在 50 mM pH 6.5 Na

₂

HPO₄緩衝液下，分 別和 PNPCB (15.2μM ~ 0.30 mM，Δε：5088 M^-1cm^-1，觀測波長為 400 nm)、2,4-DNPCB (3.0μM ~ 23.8μM，Δε：29326 M^-1cm^-1，觀 測波長為 400 nm)、2,5-DNPCB (18.3μM ~ 0.22 mM，Δε：4725 M^-1cm^-1，觀測波長為 440 nm)、4Cl-2NPCB (48.8μM ~ 0.29 mM，

Δε：2744 M^-1cm^-1，觀測波長為 425 nm)、3-NPCB (0.18 mM ~ 0.93 mM，Δε：224 M^-1cm^-1，觀測波長為 385 nm)、4CNPCB (18.9μM ~ 0.11 mM，Δε：3101 M^-1cm^-1，觀測波長為 270 nm)，進行水解反應，

以μυ吸收光譜儀觀察適當波長的吸收值變化，計算反應的初始速率 (initial velocity, Vo)。並以雙倒數圖 (double-reciprocal plot) 求 K_m與 k_cat之值。

2-7-2 ChiNCTU2 的最佳 pH 活性 (optimal pH activity) 測試

以等吸收點 348 nm 做為觀測波長，測量不同 pH 緩衝液下，6.38 nM 的 ChiNCTU2 與 42.5μM 的 PNPCB 反應之初始速率。

不同 pH 的緩衝液分別為 50 mM NaOAc (pH 3.5、4.0、4.5、5.0、

5.5)、50 mM MES (pH 6.0)、50 mM Na

₂

HPO₄(pH 6.5、7.0)、50 mM HEPES (pH 7.5、8.0)、50 mM Tris (pH 8.5、9.0)。

2-7-3 ChiNCTU2 在不同酸鹼值下的穩定性 ( pH stability)

以等吸收點 348 nm 做為觀測波長，將定量 ChiNCTU2 置於不同 pH 緩衝液中，在第 1、15、35、65 分鐘時取出與 59.0μM 的 PNPCB 在 50 mM pH 6.0 MES 中反應，測量反應的初始速率。(ChiNCTU2 之 最終濃度為 8.57 nM)

不同 pH 的緩衝液為 50 mM NaOAc (pH 3.5、4.0、4.5、5.5)、50 mM Na

₂

HPO4(pH 6.5)、50 mM HEPES (pH 7.5、8.0)、50 mM Tris (pH 9.0)。

2-7-4 抑制作用、Sodium azide activation

緩衝液下，固定濃度的 PNPCB 與 ChiNCTU2 在不同濃度的抑制 劑或 Sodium azide 下進行反應，測量反應初始速率。

在文檔中 仙人掌桿菌幾丁質酵素的過量表現與催化反應機制的探討 (頁 26-35)