1-1 幾丁質
1-1-1 幾丁質 (Chitin) 簡述
幾丁質 (圖 1-1) 是自然界最豐富且重要的多醣類之一，由單體
N-acetyl-
D-glucosamine (GlcNAc, 即 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucose) 經β-(1,4) 鍵結而成，為直鏈、堅硬、不可溶的碳水聚合物，是構成 高度的生物合成 (biosynthesis) 與氮的循環。自然界的幾丁質可以被 chitinases (EC 3.2.1.14, family 18、19 註) 與β-N-acetylhexosaminidases (EC 3.2.1.52, family 3、20) 降解為可溶性的 GlcNAc 單體 (4)。圖 1-1 幾丁質的化學結構
圖 1-2 纖維素的化學結構
註：O-Glycoside hydrolases (醣類水解酵素, EC 3.2.1.-) 是一群水解 glycosidic bond 之酵素，
O
1-1-2 昆蟲的幾丁質 (5)
昆蟲的幾丁質結構經 X-ray 繞射分析推測為一多型態物質
(polymorphic substance)，分為α-、β-和γ-三種晶格修飾 (crystalline modifications) 的幾丁質，主要不同在於幾丁質鏈數的水合 (hydration) 程度。
α-形式約是 20 個幾丁質單鏈組成，且所有幾丁質鏈都呈現 anti-parallel 方向，造成緊密的 microfibrils 摺疊，具有許多的分子內 與分子間氫鍵，所以結構很穩定。β-形式的所有幾丁質鏈都呈現 parallel 排列，γ-形式則是由兩條 parallel strands 伴隨一條 anti-parallel strand。β-和γ-形式因為缺乏緊密的摺疊與較少的分子間氫鍵，增 加了與水分子的氫鍵作用，較高的水合程度與摺疊緊密程度的降低導 致柔軟、柔韌的幾丁質結構。此三種晶格修飾均存在於昆蟲的幾丁質 結構中。例如α-形式普遍存在幾丁質組成的表皮，而β-和γ-形式則 通常存在於繭的構造中。
此外，幾丁質非結晶型的過渡態 (transient states) 也曾經在黴菌 系統中被報導過。
1-2 幾丁質酵素
1-2-1 幾丁質酵素 (chitinases) 簡述
Chitinases (EC 3.2.1.14) 是一種醣類水解酵素，可以催化幾丁質 水解，被定義為切斷幾丁質上兩個 GlcNAc 殘基中 C1 與 C4 之間
O-glycosidic bond 的酵素。其廣泛存在於許多有機體中 (即使是沒有
幾丁質做為結構組成的有機體)，包括細菌、黴菌、酵母菌、植物、甲殼類動物、節肢動物、脊椎動物等，在各有機體中角色各不相同 (2,
6)。
黴菌利用幾丁質酵素修飾做為細胞壁重要組成的幾丁質；細菌產 生幾丁質酵素分解幾丁質作為氮源與碳源；昆蟲在脫殼時期更是分泌 幾丁質酵素分解老舊外骨骼，而在較高等植物中幾丁質酵素的產生被 認為是用來防禦黴菌病原體的侵略，此些幾丁質酵素在幾丁質的分解 中扮演很重要的生態角色 (2, 6)。
幾丁質酵素最方便取得的來源卻是微生物，最被大家所熟知的有
Aeromonas、Serratia、Vibrio、Streptomyces、Bacillus 等，可生產大量
幾丁質水解酵素 (7)。近年來才有哺乳類動物的幾丁質酵素被發現。第一個被發現的人 類幾丁質酵素是由吞噬細胞表現，最近幾年更在腸胃中發現豐富的酸 性哺乳類動物幾丁質酵素 (acidic mammalian chitinase, AMCase)，可 能是被用來抵抗病原體的入侵 (8)。
與幾丁質分解有關的酵素為內切型幾丁質酵素 (endochitinase)、
外切型幾丁質酵素 (exochitinase)、endo-β-N-acetylglucosaminidase (EC.3.2.1.96) 與 exo-β-N-acetylglucosaminidase (EC.3.2.1.52)。內切型 幾丁質酵素催化幾丁質長鏈內部的水解，外切型幾丁質酵素則由幾丁 質長鏈一端催化水解，放出幾丁二醣
(chitobiose)，endo-β-N-acetylglucosaminidase 將 glycoprotein 水解放出 GlcNAc 單醣，而 exo-β-N-acetylglucosaminidase 從非還原端水解放出 GlcNAc 單醣 (7)。
1-2-2 幾丁質酵素的分類與結構
依據胺基酸序列，幾丁質酵素被歸類在醣類水解酵素 family 18 和 19，兩家族幾丁質酵素的結構與機制均不相同 (3)。
Family 19 幾丁質酵素目前僅發現於植物 endochitinases 與細菌幾
丁質酵素 Streptomyces griseus HUT 6037 ChiC，可水解導致構形反轉 (inversion) 的α-anomeric 組態產物。催化區有豐富的α螺旋與α+β 摺疊成分，結構與溶解酵素 (lysozyme) 相似 (3, 4)。
Family 18 幾丁質酵素則廣泛分布在其他生物體，包含其他細菌 (endochitinases 與部分 exochitinases)、黴菌、植物、昆蟲、病毒和哺 乳類動物，水解產生構形保留 (retention) 的β-anomeric 組態產物
(3)。根據 Suzuki et al.對於 29 個細菌幾丁質酵素的疏水性群
(hydrophobic cluster) 的分析與研究發現，family 18 細菌幾丁質酵素全 部序列的相似度雖然不高，但催化區 (catalytic domain, CaD) 有相同 的(β/α)8 筒狀 (TIM barrel) 構形組成。在起始的六個β-strands 上有 一些保留的胺基酸殘基，包含分別在第三和第四個β-strand 上的 SXGG 與 DXDXE，SXGG 序列對於催化反應的作用尚不清楚，但 DXDXE 序列被認為位在催化的活性中心，其中 E 作為參與反應的催 化酸，在 Alteromonas sp. O-7 Chi85 與 Bacillus circulans WL-12 ChiA1 研究中曾藉由定點突變導致其活性喪失證實 (2, 3)。而活性中心凹槽上 的一連串芳香族胺基酸則是用來協助受質與酵素結合 (3, 9, 10)。
Watanabe et al. (1993) 根據催化區胺基酸序列的獨特性質，再將 family 18 原核幾丁質酵素其分為 subfamily A, B, and C，彼此在第七 與第八個β-strand 之間區域差異很大 (2, 3)。Bacillus cereus NCTU2 ChiNCTU2 屬於 subfamily B，S. marcescens ChiA 屬於 subfamily A。
圖 1-3 為 S. marcescens ChiA 的 3 D 結構 (12)，中心位置有八個β /α所構成的筒狀結構，這八條β摺板經由α螺旋連結形成平行排列 圍成筒狀柵欄，而α螺旋則圍繞在外側，圖右上方的β摺板區域為幾 丁質鍵結區 (chitin-binding domain, ChBD)。
圖 1-3 Serratia marcescens ChiA 的 3D 結構 (12)
此外，family 18 幾丁質酵素結構上的些微差異，可能導致作用 特性的不同，例如酵素與受質之間的鍵結、醣殘基被水解切除的模 式、反應機制等，其中由寡醣降解的 time course，分析受質鍵結缺口 (substrate binding cleft) 的自由能分佈可以了解鍵結的穩定性，因而推 論醣殘基被水解切除的模式。而活性中心受質鍵結位置 (subsite)，以 圖 1-4 為例，從水解切除的位置算起，切下的雙醣為+1、+2，反邊為 -1 ~ -4。
圖 1-4 以分子動力模擬 (GlcNAc)6在 S. marcescens ChiA 中，
當–1 位置為 boat 形式時之最低能量構形
1-2-3 細菌幾丁質酵素胺基酸序列分析
細菌幾丁質酵素的胺基酸序列顯示，幾丁質酵素通常具有一些常 見的作用區域 (functional domains)，包括訊息月生肽 (signal peptide)、
催化區與幾丁質鍵結區 (chitin-binding domain, ChBD)，此外還有一些 較少見的作用區與 CaD 連接，如 type III fibronectin-like domain (Fn3D)、Pro/Thr rich linker、cadherin-like domain 以及纖維素鍵結區 (cellulose-binding domain, CBD) 等 (2, 3)。圖 1-5 為 ChiNCTU2 與其他 幾丁質酵素作用區域組成之示意圖 (11)。
圖 1-5 ChiNCTU2 與細菌幾丁質酵素的作用區組成之示意圖 (11)
訊息月生肽
訊息月生肽為幾丁質酵素分泌所必需，通常具有一個帶正電區、一
(ChBD)
個疏水區，和一個斷裂位置 (cleavage site)(2)。有研究發表指出，外來 的含訊息月生肽幾丁質酵素在被轉型至大腸桿菌 (E coli.) 系統中，可成 功被運送通過細胞膜，其中包括 Streptomyces plicatus, Aeromonas
caviae, Aeromonas hydrophila, Serratia marcescens, Enterobacter
agglomerans, Bacillus circulans 和 Janthinobacterium lividum 產生的胞
外幾丁質酵素。至於幾丁質酵素是如何將被輸出至 periplasm 或分泌 到培養液中仍不甚明白，因為這些幾丁質酵素的訊息月生肽序列並不相 似，因此僅能推測訊息月生肽可能具有一些在原核生物的蛋白質分泌可 被普遍利用的構形特徵 (conformational feature)(3)。催化區
催化區為水解幾丁質中連結 GlcNAc 單體間的β- (1,4) glycosidic bonds 所需。少數幾丁質酵素僅含訊息月生肽與催化區，而不具有其他 的作用區，如 ChiNCTU2。
幾丁質鍵結區
一般研究認為幾丁質鍵結區可與不可溶的幾丁質聚合物結合而 有效水解、以增強催化活性，然而，由於此區域不會與可溶的幾丁質 寡醣或衍生物鍵結，所以對此類受質的活性不影響。
Bacillus circulans WL-12 之 chitinase A1 的 ChBD
ChiA1為一個緊密 的球形結構，核心區域由疏水性殘基與芳香族殘基組成，導致整體結 構堅硬而緊密，而 Watanabe et al. (1994) 就是由 ChBDChiA1的缺失對 不溶膠狀幾丁質活性的降低推測 ChBD 與不溶受質鍵結，而促使其水解 (2, 3)。但經由 Serratia marcescens ChiA 的 ChBD 與 ChBDChiA1比對
發現，無相似序列存在，因此若要闡明 ChBD 與幾丁質的鍵結機制與 在催化活性上扮演的角色，必須有三維蛋白質結構輔助。
雖然 ChBD 對於不溶性受質可增進水解能力，但對於幾丁質酵素
催化活性並不一定需要，所以常見細菌中較高分子量的幾丁質酵素經 post-translational modification (cleavage) 形成一缺乏 ChBD 或 Fn3D 的 較低分子量幾丁質酵素，例如 Serratia marcescens 2170 chitinase C2 僅含 CaD，是 chitinase C1 切除 C 端的 ChBD 與 Fn3D 所產生；Serratia
marcescens KCT2172 的 Chi52 也同樣將 ChBD 與 Fn3D 經 proteolytic
cleavage 生成低分子量的 Chi35(3)。纖維素鍵結區
具有 cellulose-binding domain (CBD) 的 Bacillus cereus CH 之 chitinase B 對於不溶膠狀幾丁質比可溶受質有更好的活性，因此 CBD 可能促使著不溶受質的吸附 (2)，所以常被認為與 ChBD 有相似作用。
Erwinia chrysanthemi 的 CBD
ChiN與 Bacillus circulans WL-12 之 chitinase A1 的 ChBDChiA1整體形式相似，都有芳香族殘基協助酵素與 受質鍵結，但線性比對發現 ChBDChiA1缺乏 CBDChiN上三個暴露在溶 劑中的芳香族殘基，其可能與纖維素鍵結有關，因此 CBD 與 ChBD 雖然具有相似的作用角色，但鍵結的機制可能不同。Cellulases 的 CBDs 在水解反應進行時，推測是藉由集中纖維素 表面的 cellulases 而增強活性，此外可能也瓦解部分非共價鍵的交互 作用，包括兩鄰近葡萄糖單體之間的氫鍵。部分 cellulases 的 CBD 有 相似序列外，Streptomyces lividans, Streptomyces plicatus, 和
Streptomyces coelicolor 的幾丁質酵素也具有類似的區域，特別是某些
芳香族殘基的高度保留，經由 Cellulomonas fimi 的β-1,4- glycanase 的 CBD 核磁共振 (nuclear magnetic resonance, NMR) 光譜推測此些芳 香族殘基可能與受質的鍵結有關 (2)。此外，也有部份的 CBDs 具有與 可溶 cello-oligosaccharides、幾丁質鍵結的能力。其他作用區
在一些幾丁質酵素 (Bacillus circulans WL-12 的 chitinase A1 與 chitinase D)、pullulanases 與 cellulases 的 Fn3D 序列比對發現高度保 留區塊，從這些區塊的移除 (deletion) 研究發現 Fn3D 可能扮演著維 持 CaD 與 ChBD 之間最理想距離與方位的重要結構角色 (2)。
1-2-4 Family 18 幾丁質酵素水解反應機制的推測與研究
傳統構形保留的醣類水解為兩步置換 (double displacement) 機制 (圖 1-6)，例如 egg-white lysozyme 和 Flavobacterium β-Glucosidase
(12)，通常牽涉兩個 carboxylates，一個 carboxylate 當作催化反應的一 般酸/鹼基 (general acid / base)，於水解反應時先將醣苷鍵上的氧質子 化，使形成好的離去基，另一個 carboxylate 作為親核基 (nucleophile) 形成共價鍵中間體或提供離子對以穩定 oxocarbonium 中間體，並輔 助離去基離去，當離去基擴散離開活性中心後，水分子進入，行親核
在過去研究中，同為構形保留的 family 18 幾丁質酵素也被認為 應該有如上述的兩步置換水解反應機制，具有兩個參與催化反應的 carboxylate (Serratia marcescens ChiA 被推測是 Glu315 與 Asp391)，
但是在 family 18 幾丁質酵素的 X-ray 晶體結構中，只發現一個作為 一般酸/鹼基的 carboxylate，而沒有用來穩定中間體的第二個
carboxylate 在推測的位置附近，這暗示著中間體可能被其他方法穩 定。受質上的 N-acetyl group 可能是一種分子內穩定的方法，稱為 anchimeric assistance 或 neighboring group participation，可能經由電荷 的交互作用或形成共價鍵 oxazoline 中間體而穩定 (17, 18)。
許多的研究便致力於 family 18 幾丁質酵素水解反應的中間體結 構、受質扭曲現象以及酵素與受質在活性中心的鍵結等。其中有分子 動力 (molecular dynamics, MD) 模擬在活化位置-1 位置的 boat 形式 之 oxocarbonium 與 oxazoline 兩中間體，結果相似，且都較-1 位置的 chair 形式之 oxocarbonium 穩定，因而推測水解反應時，鍵結在-1 位
許多的研究便致力於 family 18 幾丁質酵素水解反應的中間體結 構、受質扭曲現象以及酵素與受質在活性中心的鍵結等。其中有分子 動力 (molecular dynamics, MD) 模擬在活化位置-1 位置的 boat 形式 之 oxocarbonium 與 oxazoline 兩中間體，結果相似，且都較-1 位置的 chair 形式之 oxocarbonium 穩定，因而推測水解反應時，鍵結在-1 位