力學最快速而有效的方法，以 p-NP-(GlcNAc)n [4-nitrophenyl-(N-acetyl-D-glucosamine)n] 和螢光標識的 4-MU-(GlcNAc)n [4-methyl-umbelliferyl-(N-acetyl-D-glucosamine)n] 最常被使用。然而此等反應受 質價格極為昂貴，且種類有限，因而大大限制了反應動力學之測定。
近年來，由於本實驗室已開發完成大量生產幾丁雙糖之系統
(12)，使得利用此昂貴的雙糖進行各式人造受質的合成變成可行。合成 反應是先將幾丁雙糖乙醯化得到 per-acetyl-α/β-chitobiose 之混合 物，再將之氯化成 per-acetyl-α/β-chitobiosyl chloride(23)，經偶合反 應後可得到具各種苯酚離去基之受質前驅物 (24)，最後去乙醯化得到
Chlorination Coupling
Deacetylation
圖 3-1 各類β-幾丁雙糖衍生物受質的合成流程
另外，我們還利用幾丁雙糖合成出可能具有活性中心親和性之不 可逆抑制劑 N-bromoacetyl chitobiosyl amine (NBACA)(25)。合成反應 是將幾丁雙糖經 amination 生成 chitobiosyl amine，再經偶合反應生成 NBACA，產率約 80 ~ 90%，合成流程如圖 3-2 所示。
Amination
Coupling
R： 4-cyano phenyl, 3-nitro phenyl, 4-nitro phenyl, 2,5-dinitro phenyl, 4-chloro2-nitro phenyl,
O
phenols/Ag
2O CH
3CN
CH
3COCl/CH
3OH
(NH
4)
2CO
3(BrCH
2CO)
2O
DMF
3-2 酵素的過量表現、純化與性質分析
至目前為止已知有三株 Bacillus cereus(2, 3, 11) 之幾丁質酵素被選 殖出來，但皆尚未被成功表現出有活性的重組酵素。過去，本實驗室 曾嘗試將去除訊息月生肽之 ChiNCTU2 (成熟蛋白) 建構於 pRSET A 表 現載體中，但表現所得的酵素為包涵體 (inclusion body)，此包涵體以 尿素溶解後進行 rescue，仍未成功恢復酵素活性。
圖 3-4 ChiNCTU2 經 HIC 層析分離後之 SDS-PAGE 圖
為去除少許之不純物，上述分離所得之流洗液再以陰離子層析管 柱 (Q sepharose) 進一步純化，如圖 3-5 所示。由流洗液的活性測試 得知 ChiNCTU2 與 Q sepharose 沒有作用力，而在無鹽之流洗液下被 沖提出。此層析管柱雖可除去少部分不純物，但對酵素之純度未明顯
由 SDS-PAGE 之分析可估計重組 ChiNCTU2 分子量約為 36 kDa，經由電灑式液相層析質譜儀 (LC/ES/MS) 分析，進一步確認其 分子量為 36236 Da (圖 3-6)，與成熟蛋白的理論計算值 36235 Da 吻
Micromass Q-Tof 16-MAY-2003
chitinase
30000 31000 32000 33000 34000 35000 36000 37000 38000 39000 40000 41000 42000 43000 44000
mass 0
100
%
QSIN_0516 876 (43.891) M1 [Ev-32068,It20] (Gs,0.750,1055:2174,1.00,L33,R33); Cm (869:899) TOF MS ES+
1.83e3 36236.00
36208.00 31169.00 33397.0033819.00 34984.00
36258.00
36280.00 37529.00 36339.00
38427.00 39569.00 40989.0041348.00 43512.0043946.00
Micromass Q-Tof 20-MAY-2003
chitinase-product-23hr
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z
0 100
%
qsin_0520 129 (5.599) Cm (100:167) TOF MS ES+
3.21e3
341.14350.97 419.02 448.22
515.21
529.22 582.97 650.93 814.96
732.96
重組酵素之性質研究
為進一步深入探討重組 ChiNCTU2 的催化性質與反應機構，我 們首先測試其一般性質。
由研究顯示重組 ChiNCTU2 有不錯的穩定性，於 4 ℃下可保存 數個月而不至於喪失活性。其 Michaelis-Menten 參數可以雙倒數作圖 法，圖 3-8 所示，算出 Km為 0.27 mM，kcat為 66.0 s-1。另外，室溫 下，重組 ChiNCTU2 在不同酸鹼值中，亦維持相當好穩定性。圖 3-9 是重組酵素於 pH 3.8 ~ 9.0 緩衝液中保存一小時之活性測試，其活性 均可維持 80%以上。最佳反應 pH 值約在 pH 5.5 左右，見圖 3-10，
有趣的是當 pH＞7 與 pH＜4 時，此酵素活性降到 50%以下，而 完整的酵素活性與酸鹼度關係呈現一鐘型曲線 (bell-shaped curve) 趨勢，且由 pK1=4.26 ± 0.05，pK2=6.81 ± 0.04 所操控。由一般動力學 理論得知此鐘型曲線意味酵素活性由兩個顯示 pK
a
(apparent pKa
) 操 控，在許多酵素研究中，此兩個 pKa
反應出兩個胺基酸殘基在催化中 扮演重要角色，當此兩胺基酸均處於質子化 (EH2) 的狀況，即低 pH 值之下，酵素活性下降，同樣的，當其皆為去質子化時 (E2-)，即高 pH 值下，酵素為無活性狀態，當其一為質子化而另一個為去質子化 時 (EH-)，酵素才是真正活化的。EH 2 EH
-E
2-但這與一般推測 family 18 幾丁質酵素僅有一個在水解反應中做 為 general acid/base 胺基酸的理論不符。可能的原因是此酵素有著與 過去推測不同的反應機制，或是酵素部分胺基酸上的側鏈因為 pH 變 化造成整體結構的些微改變，以致於活性的喪失。此鐘型曲線所顯示
pK1 pK2
兩 pKa是整體酵素在不同酸鹼度中表現出來的總活性變化趨勢，並非
圖 3-10 ChiNCTU2 的最佳 pH 活性測試
10 8
6 4
60
40
20
0
pH
V e lo c it y , n M /s
3-3 反應機構探討
已知 family 18 之幾丁質酵素為保留型酵素 (retention enzyme)，
其水解作用機制為雙步驟置換反應，如圖 3-11 所示，反應過程中先
3-3-1 BrØnsted plot
由不同β-chitobioside 反應受質與 ChiNCTU2 的活性測試結果 (表 3-1)，得到的 log kcat與 log kcat/Km對不同離去基之 pKa作圖 (圖 3-12、3-13)，結果為皆呈一水平線之 BrØnsted plot，這代表水解反應 速率不受離去基 pKa的影響，所以離去基離去而形成反應中間體的步 驟不是催化反應之速率決定步驟 (rate-limiting step)，而水分子參與水 解反應中間體才是此反應的速率決定步驟。
如果 breakdown 速率更慢，則反應中間體的累積似乎是有機會發 生的，若能因而觀測到反應中間體，對於反應機制的推測會是一大突 破。
表 3-1 ChiNCTU2 對於不同離去基的受質之動力學研究 條件：50 mM pH 6.5 之 Na2HPO4緩衝液
phenol subsituent pKa Km
(mM)
kcat(s
-1)
log kcat log kcat/Km 2,4-dinitro 3.96 0.89 97.67 1.99 5.04 2,5-dinitro 5.51 0.40 111.9 2.05 5.44 4-chloro-2-nitro 6.45 0.55 57.07 1.76 5.01 4-nitro 7.18 0.79 117.6 2.07 5.17 3-nitro 8.39 1.28 97.04 1.99 4.88 4-cyano 8.49 0.31 48.18 1.68 5.19kcat/Km：M-1s-1
pKaof phenols
圖 3-12 BrØnsted plot：log kcat對受質離去基之 pKa作圖
pKaof phenols
圖 3-13 BrØnsted plot：log kcat/Km對受質離去基之 pKa作圖
9 8
7 6
5 4
3 2.5
2
1.5
1
0.5
0
9 8
7 6
5 4
3 5.5
5
4.5
4
3.5
3
lo g k
catlo g k
cat/K
m3-3-2 N-bromoacetyl chitobiosyl amine (NBACA) 之抑制作用
N-bromoacetyl glycosyl amine 已被成功用以標識許多醣類水解酵
素的重要胺基酸殘基，如本實驗室曾以 N-bromoacetyl glucosyl amine 為活性中心親和抑制劑，結合 LC/MS/MS 月生肽定序技術而成功地將 family 3 之β- glucosidase 的一般酸/鹼基 (general acid/base) 胺基酸 明確的鑑定出來 (16)。在本研究中，我們也企圖利用此類化合物N-bromoacetyl chitobiosyl amine (NBACA) 對 ChiNCTU2 進行標識，
可惜的是，以 25 mM NBACA 和 ChiNCTU2 作用 3 天後，以 LC/MS 分析 ChiNCTU2 分子量並未發現有親和性標識的現象。為進一步分 析所使用的 NBACA 是否可有效與 ChiNCTU2 結合，我們進行可逆 抑制作用的研究，由實驗結果顯示 NBACA 是 ChiNCTU2 的可逆抑 制劑，其 Ki 值為 0.64 mM，因此在 25 mM 濃度下，估計所有 ChiNCTU2 均與 NBACA 結合，由此可見 NBACA 無法與 ChiNCTU2 進行親和 性共價反應。另一類含 epoxide 之幾丁雙糖衍生物，如圖 3-14 所示，
或許有機會當作 ChiNCTU2 之親和性標識劑，目前我們已著手合成 此類化合物。
X：O 或 C 圖 3-14 β-幾丁雙糖的 epoxide 衍生物
O
OH HO
OH
O
OH O
OH
NH
O
NH
O
X O
3-3-3 ChiNCTU2 之催化作用的重要胺基酸
由於 NBACA 無法用以鑑定 ChiNCTU2 之重要胺基酸殘基，因 此利用定點突變尋找此類胺基酸為唯一的選擇。首先，我們將數種 family 18 之幾丁質酵素進行胺基酸序列比對，其比對結果於附錄一，
其中 ChiNCTU2 之 E145 與 Y213 與 S. marcescens ChiA 中之 E315 與 Y390 (已被鑑定為重要殘基) 均在相同保留位置。
我們以 Quik-change 之定點突變法將 E145 分別突變為 E145G、
E145C 和 E145Q，而 Y213F 則突變成 Y213F，並分析其活性與
Michaelis 常數，整理比較於表 3-2。結果發現突變株 E145G、E145C、
E145Q 的 Km有變小的趨勢，且 k
cat
值相較於野生株酵素，突變株 E145G 下降 3900 倍，E145C 下降 9100 倍，E145Q 下降 4800 倍，kcat
/Km
值比較，則分別下降 2900 倍，5300 倍和 3100 倍。因此 E145 證 實為 ChiNCTU2 的反應重要胺基酸，此與所有已知 family 18 幾丁質 酵素相吻合。然而，令人意外的是，突變株 Y213F 的k
cat
、Km
與kcat
/Km
之 值與野生株相近，並未造成酵素活性的喪失，Y213F 未如預期是 ChiNCTU2 水解反應的重要基團之一。我們推測 ChiNCTU2(subfamily B) 與 S. marcescens (subfamily A) 和其他幾丁質酵素可能 有不同的結構與催化反應機制。此論點亦可由胺基酸比對之結果得到 佐證，在 S. marcescens ChiA 中，與-1 和+1 位置醣殘基結合區之胺基 酸大都並未存在 ChiNCTU2 之比對保留區中 (請參閱緒論 1-3 胺基酸 比對)。
表 3-2 野生株 ChiNCTU2 與突變株的活性比較
條件：50 mM pH 6.0 之 MES 緩衝液，觀測波長 348 nm
K
m(mM)
kcat relative
kcat kcat/Kmrelative
kcat/K
m WILD TYPE 0.27 66.0 1 244.4 1E145G 0.20 0.017 0.00026 0.085 0.00035 E145C 0.15 0.0071 0.00011 0.047 0.00019 E145Q 0.18 0.014 0.00021 0.078 0.00032 Y213F 0.61 123.4 1.87 202.3 0.83
kcat/Km：M-1s-1
3-3-4 反應中間體之探討
如果可以直接觀測到反應中間體，對於反應機制幾乎一目了然，
而 ChiNCTU2 水解反應的中間體到底是形成共價性中間體，還是
N-acetyl group 參與反應的 anchimeric assistance？
為了解開疑惑，我們期望由突變株 E145G 的水解反應中可以看 到中間體的累積，於是將突變株 E145G 與 2,4-DNPCB 作用。由 time course 反應圖 (圖 3-15)，可發現其為一雙相之動力反應現象 (biphasic kinetic)，此種反應現象顯示有中間體累積於反應中，可能為
glycosyl-enzyme 中間體或 oxazoline 中間體，而酵素與受質作用呈現 兩種不同的反應速率，第一相之快速反應 (前 150 秒左右) 應為形成 中間體的速率，第二相的低反應速率步驟應為中間體水解速率，此結 果與 BrØnsted plot 一致，即中間體之水解步驟為速率決定步驟。
為分析中間體，我們嘗試以 LC/MS 分析可能累積之 oxazoline 小 分子或 glycosyl- enzyme 中間體，結果發現突變株 E145G 未被反應中 間體標識，所以水解反應沒有共價性中間體的生成，因此反應可能形
成一般推測的 oxazoline 中間體，質譜分析亦在溶液中觀測到分子量 407 Da (H+)與 429 Da (Na+) 訊號的小分子，與 oxazoline 分子量大小 相符。但此訊號也可能是產物幾丁雙糖脫水的質譜峰。為進一步釐清 中間體是否為 oxazoline ring，我們已著手合成一含 thioacetyl group 的 反應受質，如圖 3-16 所示，此受質應可形成共穩定的 thioazoline ring 中間體 (圖 3-17)。
圖 3-15 E145G 與 2,4-DNPCB 反應 time course (觀測波長 400 nm)
圖 3-16 (N- thioacetyl-D-glucosamine)2derivatives
O
圖 3-17 (GlcNAc) -thiazoline
1000
3-3-5 Sodium azide activation 之中間體可能是 oxazoline ring，當 E145 不存在時，水分子不易被極 化而使催化水解中間體變慢，造成累積，此論亦可由 E145 各突變點 酵素 Km值下降得到佐證。
圖 3-18 Sodium azide activation 現象
3-4 本研究之未來工作
本實驗室目前正進行 (N- thioacetyl-D-glucosamine)2derivatives 的合成，若水解反應機制是 anchimeric assistance，則當其與 ChiNCTU2 作用時會生成較穩定而不易水解的 thiazoline ring，可以藉由質譜儀等
500
方法觀察，此 thiazoline ring 的形成將會是證實 anchimeric assistance 機制最直接的證據。
另外，目前本實驗室也和同步輻射合作試圖將 ChiNCTU2 結晶，
晶體的結構解析也將協助反應機制的推測。
第四章 結論
針對本研究主題 Baciluus cereus NCTU2 的幾丁質酵素的表現、純 化與反應機制進行研究，其結果整理如下：
1. 含訊息月生肽之全長 ChiNCTU2 基因被建構於表現載體 pET-22b(+)，
經轉型至大腸桿菌 BL21 (DE3) 後，有大量的幾丁質酵素表現，其 訊息月生肽可被大腸桿菌 BL21 (DE3) 辨識而切除，這是 Bacillus
cereus 幾丁質酵素在大腸桿菌系統第一個成功表現的例子。
2. 轉型後的大腸桿菌 BL21 (DE3) 產生之胞內酵素利用疏水性層析管 柱 HIC 純化，可以獲得 90%以上均質度之 ChiNCTU2。
3. 重組 ChiNCTU2 穩定性高，反應最佳活性在 pH 約 5.5 左右，在 pH 6.0 MES 緩衝液條件下，對 PNPCB 的反應活性之 Km為 0.27 mM，
kcat為 66.0 s-1。
4. ChiNCTU2 是兩步置換水解機制，由 BrØnsted plot 確定反應中間體 的分解步驟 (breakdown) 是反應速率決定步驟，在突變株酵素 E145G 與 2,4-DNPCB 受質反應過程看到的雙相之動力反應現象 (biphasic kinetic)，發現中間體的累積。而 2.5 M 的 Sodium azide 可 增強突變株酵素 E145G 對 2,4-DNPCB 受質的反應速率近 100%，顯 示反應機制可能為 anchimeric assistance，反應中間體為 oxazoline ring。
5. 高濃度 N- bromoacetyl chitobiosyl amine (25 mM) 無法對 ChiNCTU2 進行活性位置標識找出催化反應的重要胺基酸，但卻是 ChiNCTU2 的可逆抑制劑，其 Ki 值為 0.64 mM。
5. 高濃度 N- bromoacetyl chitobiosyl amine (25 mM) 無法對 ChiNCTU2 進行活性位置標識找出催化反應的重要胺基酸，但卻是 ChiNCTU2 的可逆抑制劑，其 Ki 值為 0.64 mM。