3-1. 磁性試劑製程
我們使用化學共沉法[20](chemical precipitation)來製作磁性流 體，並且選用葡聚醣(Dextran)當作介面活性劑[21]，如圖 3-1-1 所示，可以奈米粒子均勻分布在溶劑中，不會受到重力或磁場作 用，造成凝聚或沉澱，主要的化學反應式如下 3-1:
2
Fe
3 Fe
2
8OH
Fe
3O
4
4H
2O
(3-1)先讓 Fe3+ 和 Fe2+反應後再加入葡聚醣，控制 pH 值、時間，
在溫度恆定的環境下讓 Fe3O4披覆上葡聚醣，在用高速離心除去 雜質及難溶的沉澱物，最後在層析(gel filtration chromatography ; GFC)使磁粒子分離出不同粒徑，即獲得磁性奈米流體，圖 3-1-2 為磁性流體製作流程。
圖 3-1-1. 葡聚醣(Dextran)結構圖
FeCl
2， FeCl3，H2O
混合攪拌
加入NH4OH，葡聚醣
加熱
離心
層析
去除大顆粒子 和雜質
分離出粒徑大小
磁性流體
Dextran Fe
3O
4Water
圖 3-1-2. 磁性奈米粒子製作流程
最後須將磁性奈米粒子與抗體鍵結成為磁性奈米試劑，將氧化劑 高碘酸鈉(Sodium periodate, NaIO4)加入磁性奈米流體中，將葡聚醣 (Dextran)之 C-C 鍵結打開，形成有較高化學能的醛基(-C=O)。等待反 應結束後，利用磁性分離法[22]去除多餘的高碘酸鈉，避免過度氧化 葡聚醣(Dextran)。將經過磁性分離法的磁流體取出，然後加入抗體，
等待反應時間結束，最後在用磁性分離法，分離多餘的抗體，即可得 到磁性試劑，下圖 3-1-3 為磁性試劑製作流程。試劑的製程分為披覆
圖 3-1-3. 磁性試劑製作流程
3-2. 老鼠腫瘤的誘發
我們選用老鼠種類 F344N，，性別為雄性，老鼠重量為 200~250 克重，肝癌細胞為 GP7TB，細胞數量為 2×107 Cell/隻。雌性老鼠 會因為月經的關係導致體內荷爾蒙改變，會影響實驗結果。將肝 癌細胞打進老鼠背部皮下組織中，老鼠皮下組織比較鬆散，相較 於打入血管或其他部位，會因為血流的關係而擴散，打進皮下組 織不會有此現象，並且肝癌細胞可以在此獲得養分，生長成腫 瘤。我們分別記錄老鼠背部腫瘤在不同時期的體積，分別為一開 始種植的零週，種植後的一週、三週和五週，如圖 3-2-1 所示。
利用公式 3-2。
(3-2)
其中 a 為腫瘤高、b 為腫瘤寬、c 為腫瘤高，算出腫瘤大小，如 圖 3-2-2。
a=7.0 mm
3-3. 免疫染色與磁染色
首先，我們將 5 週的癌鼠腫瘤取下，做成石蠟切片，因組織 可以保存時間較長，所以適合各種染色觀察[23]，進行脫蠟後進 行我們的免疫染色步驟。以蠟筆圈出組織，目的在於防止加入的 液體流出，也可以減少液體使用量。一開始先以雙氧水(H2O2)浸 泡 5 分鐘，目的是為了避免細胞中的過氧化酶對染劑產生作用，
消除背景，之後再以緩衝溶液 PBS 沖洗 3 次，每次皆為 5 分鐘。
清洗完後加入阻斷液(blocking solution)，目的在於減少抗體與非 目標抗原的結合，再以 PBS 清洗，清洗完後再將一級抗體如 Alpha-fetoprotein (AFP ， 甲 型 胎 兒 蛋 白 ) 、 Des-gamma-carboxy prothrombin (DCP，脫羧機凝血酶原)、Glypican-3 (GPC3 磷酯肌 醇蛋白聚醣 3)滴在組織切片上，免疫染色與磁染色的差別，在於 磁染色是磁性奈米粒子上披覆抗體，使其反應 30 分鐘，再以 PBS 清洗，在滴上含有 HRP 的二級抗體，靜置 30 分鐘後再以 PBS
清 洗 ， 最 後 再 加 入 辣 根 過 氧 化 酶
( h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e , H R P ) 的 呈 色 劑 二 胺 基 聯 苯 胺(diaminobenzidine, DAB)，等待其反應 5-6 分鐘後，最後呈色 後的結果為褐色，實驗流程如圖 3-3-1 及 3-3-2 所示。
圖 3-3-1. 免疫染色流程
石蠟切片法
(Paraffin Tissue-Processing method) 製成肝腫瘤切片
(Paraffin Tissue-Processing method) 製成肝腫瘤切片
圖 3-3-2. 磁染色流程
石蠟切片法
(Paraffin Tissue-Processing method) 製成肝腫瘤切片
以雙氧水處理組織上的過氧化酶
Blocking
將蛋白質填滿組織沒蛋白質的地方
將含HRP*的二抗接至AFP抗體上 組織染Anti-AFP MF
加入DAB**
DAB在有HRP的位置氧化還原呈現褐色
磁粒子 抗體 HRP DAB 二級抗體
抗原 其他蛋白質 腫瘤組織
3-4. 以癌鼠血清進行 IMR
3-5. 以癌鼠血清進行 ELISA
首先，將標準液(standard)，和稀釋過的血清加 100μl 到孔盤內，
然後進入攝氏 37 度的烤箱，靜置 90 分鐘。然後加入含有生物素 (Biotin)的抗體，在攝氏 37 度的烤箱靜置 60 分鐘，之後再用 wash buffer 清洗 3 次，清洗完後加入標記有辣根過氧化酶(HRP)的鏈 霉抗生物素蛋白(streptavidin)，在攝氏 37 度的烤箱靜置 30 分鐘，
之後用 wash buffer 清洗 5 次，加入 90μl 過氧化酶的呈色劑 (substrate reagent)，在攝氏 37 度烤箱中反應 15 分鐘，最後加入 終止液(stop solution)，會由藍色轉變為黃色，在進入 ELISA Reader 讀取吸光值，流程如圖 3-5 所示。
ELISA Reader 讀吸光值