以磁減量免疫檢測與切片磁染色進行動物肝癌之體外檢測研究

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(1)國立臺灣師範大學光電科技研究所碩士論文 Institute of Electro-Optical Science and Technology National Taiwan Normal University. 以磁減量免疫檢測與切片磁染色進行動物肝癌之體外檢測研究. ImmunoMagnetic Reduction and Magnetic Immunohistochemistry in vitro study of liver cancer in Rat. 指導教授：謝振傑. 博士. 廖書賢. 博士. 研究生：莊鈞評中華民國. 一○三. 年七月.

(2) 摘要目前醫院用來篩檢肝癌的方法為抽血檢驗，檢驗血清中的 Alpha-fetoprotein(AFP)，AFP 的檢測靈敏度只有 70%左右，但只憑 AFP 升高無法斷定罹患肝癌，還必須配合影像檢查，進行多種的檢驗來確認肝癌，多種檢驗造成效率低，固本研究研發披覆多重抗體試劑與混合試劑，以提高檢測之靈敏度。我們將肝癌細胞種植於老鼠背部，肝癌細胞從老鼠體內獲取養分，然後形成腫瘤，記錄腫瘤成長過程，並且按照種植肝癌細胞後的 0、1、3、5 週，量測血清內的肝癌指標性蛋白，目的是為了觀察腫瘤在前期與後期的指標性蛋白表現量，我們使用 Alpha-fetoprotein(AFP) 試劑、 Glypican-3(GPC3) 試劑、 Des-gamma-carboxy prothrombin(DCP)試劑、披覆多重抗體試劑及混合試劑來檢測，使用的方法為磁減量檢測法 (ImmunoMagnetic Reduction, IMR)，在後期我們將腫瘤取出，做成切片，以磁性奈米試劑進行磁染色，成功的用磁訊號觀察腫瘤指標性蛋白。. 關鍵字:磁染色、IMR、磁減量檢測、磁流體、肝癌老鼠 I.

(3) 目錄第一章緒論 ........................................................................................... 1 第二章實驗原理 ................................................................................... 3 2-1 磁減量免疫檢測(ImmunoMagnetic Reduction ; IMR) .................................. 3 2-1 酵素免疫分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay；ELISA) .............. 7 2-3 免疫染色(Immunohistochemistry；IHC) ...................................................... 8 2-4 磁染色........................................................................................................... 9. 第三章實驗方法 ................................................................................. 10 3-1 磁性試劑製程 .............................................................................................. 10 3-2 老鼠腫瘤的誘發.......................................................................................... 14 3-3 免疫染色與磁染色 ...................................................................................... 16 3-4 以癌鼠血清進行 IMR ................................................................................. 19 3-5 以癌鼠血清進行 ELISA .............................................................................. 20. 第四章實驗結果 ................................................................................. 21 4-1 切片染色 ..................................................................................................... 21 4-2 以癌鼠血清進行 IMR ................................................................................. 25 4-3 以癌鼠血清進行 ELISA .............................................................................. 29. 第五章結論 ......................................................................................... 31 參考文獻 ............................................................................................... 32. II.

(4) 第一章. 緒論. 現今的人晚睡晚起，超時的工作和環境的汙染，使我們的生活暴露於癌症的威脅，罹患肝癌的比例更是居高不下，根據 102 年衛生署調查[1]，在十大癌症死因中，肝癌的死亡率排名第二，有 18.6%罹患癌症的人死於肝癌，肝癌從 1 公分長到 3 公分約需 4~6 個月，早期的肝癌在 3~5 公分下的小腫瘤可以開刀治療，但是這時候通常是沒有任何徵兆的，等到腫瘤壓迫到血管、器官、膽管，這個時候發現通常已經來不及了，所以即早發現，即早治療。現在已有許多生化免疫檢測用來檢測肝癌，像是放射免疫分析 (Radioimmunoassay，RIA)[17]，此技術需要尖端的設備，成本也很高。透射比濁測定法(Transmission tubidimetry)[2]，靈敏度低，易受到其他物質影響而改變光的強度。醫院最普遍的檢驗方法是腹部超音波檢查，對於小於兩公分的小型肝癌，已經可以診斷出來，但是掃描者需要有相當程度的訓練，仔細檢查很耗費時間。我們使用磁減量免疫檢測(ImmunoMagnetic Reduction ; IMR)[3] 並用我們製作之試劑，便可以在短時間內做出檢驗，只需要少量的血，萃取出血清後再進行檢測，希望能在癌症的早期藉由檢驗肝癌指標性蛋白，甲型胎兒蛋白(Alpha-fetoprotein ;AFP )，在罹患肝癌的時. 1.

(5) 候此種蛋白會增加[4]；酯肌醇蛋白聚醣 3(Glypican–3 ; GPC3)，主要是用來判別惡性或良性的肝癌腫瘤[5]；脫羧機凝血酶原(Des gamma carboxy prothrombin；DCP)[6]等，並且開發出同時檢驗多種指標性蛋白之試劑，目的是為了增加篩檢的靈敏度。目前最普遍用來篩檢肝癌的指標性蛋白是甲型胎兒蛋白(Alpha-fetoprotein, AFP )，但在臨床的靈敏度只有 70%[7]，由於肝癌的病因複雜，所以希望在進一步提高篩檢的靈敏度，因此檢驗多重指標性蛋白來提高靈敏度為我們的目標。我們將腫瘤取出後進行切片步驟，在以石蠟切片進行磁染色，相較於免疫染色，磁染色不僅可以在顯微鏡下觀察組織局部的定性觀察，還可以利用掃描式超導生物感測儀 (Scanning SQUID Biosusceptometry, SSB)來觀察組織整體的定量表現。. 2.

(6) 第二章實驗原理 2-1. 磁減量免疫檢測(ImmunoMagnetic Reduction ; IMR) 目前磁性標記免疫檢測技術約有四種 : 磁鬆弛檢測法 (magnetic relaxation)[8]、交流磁化率檢測法(alternative-current (ac) susceptibility)[9]、飽和磁化率檢測法(saturated magnetization)[10] 及磁減量檢測(ImmunoMagnetic Reduction ; IMR)。這四種方法都是利用有生化活性的磁性奈米粒子(如披覆抗體的磁性磁粒子)，來標定其特定的待測分子[11-15]。再藉由量測磁性奈米粒子的磁鬆弛、飽和磁化率、交流磁化率等，來檢測出待測分子的含量。將已披抗體的磁性奈米粒子加入含有抗原的待測物中，由於抗體和抗原間有高度的專一性，因此披覆抗體的磁性奈米粒子會與待測物中的抗原結合，而形成磁性叢集(magnetic cluster)[16]，在藉由量測此磁性叢集的訊號大小來檢測待測抗原的含量，此種檢測為磁性標記免疫檢測。以檢測 Alpha-fetoprotein(AFP，甲型胎兒蛋白)為例，透過化學共沉法將 AFP 抗體披覆在 Fe3O4 磁性奈米粒子之介面活性劑上。加入含有 AFP 抗原的待測物，Anti-AFP 會和 AFP 抗原結合使得奈米粒子形成磁性粒子叢集，如圖 2-1-1 所示。. 3.

(7) AFP 抗體. 磁性奈米粒子 AFP 抗原. 圖 2-1-1. 披覆 AFP 抗體的磁性奈米粒子與 AFP 抗原結合的情形，虛線內為磁性粒子叢集(cluster)。. 4.

(8) 磁減量檢測(ImmunoMagnetic Reduction，IMR)，利用分佈在水中之披覆有抗體的磁性奈米粒子與含有抗原的代測物結合後，形成磁性粒子叢集(magnetic cluster)，或抗體抗原做結合後使得磁性奈米粒子的負載變重的方法。在外加一交流磁場後，量測反應前由磁性奈米粒子的交流磁化率形成的磁訊號以及反應後的磁訊號，利用反應前後的訊號差值以探知待測生物分子濃度。因外加交流磁場頻率在幾十到幾十萬赫茲時，磁性奈米粒子會被交流磁場驅動而旋轉，磁性奈米粒子的交流磁化率(χac)，會在外加交流磁場下形成交流磁訊號(χac,0)。當磁性試劑與代測物混合後，代測物中的抗原會與磁粒子表面的抗體結合後，造成部分磁粒子的體積變大，或是許多磁粒子聚集在一起，在此狀況下受磁場驅動而旋轉的磁粒子數目與混合前相比會少很多，因此磁性試劑的交流磁訊號(χac,0)會因為代測物中的抗原與磁粒子上的抗體結合後而降低，其交流磁訊號以 χac,φ 表示，如圖 2-1-2 所示。此種方式稱為磁減量檢測，透過磁減量檢測，讓我們可以測得代測物中抗原的濃度。. 5.

(9) 因為交流磁場使磁性奈米粒子旋. 磁粒子與目標次結合後會使得磁粒子. 轉，磁性奈米粒子的ac產生交流. 形成叢集(cluster) 交流磁訊號會降. 磁訊號。. 低。. 加入抗原. 抗原. 抗體. 磁粒子. 圖 2-1-2. 磁減量免疫檢測（ImmunoMagnetic Reduction，IMR）之反應示意圖. 6.

(10) 2-2. 酵素免疫分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay； ELISA) 在 1971 年首次由 Engvall 和 Perlman 所提出[18]，其原理是利用抗體(antibody)與抗原(antigen)的專一性結合，配合上酵素的呈色反應來顯示特定抗原或抗體的存在，使用 ELISA Reader 讀取出特定波長的光吸收強度，進行定量分析。此種量測方法的缺點在於量測時血清中的干擾物會影響反應，環境的光源會造成實驗誤差。根據代測樣品和鍵結機制不同，設計出不同的檢測方法，主要分為以下三種類型 (direct-binding assay) 、間接型 (indirect-binding assay)、捕捉法(antigen-capture assay)如圖 2-2 所示。。. 酵素受質酵素受質. 酵素. 二級抗體酵素受質. 酵素. 二級抗體. 一級抗體. 酵素. 抗體抗原. 直接型. 一級抗體. 抗原. 抗原. 間接型. 捕捉法. 圖 2-2. 酵素免疫分析法之類型. 7.

(11) 2-3. 免疫染色(Immunohistochemistry；IHC) 是將免疫學與細胞化學技術結合所建立的技術，免疫染色的原理建立在抗體抗原的專一性結合，在抗體上結合可呈色的化學物質或螢光，檢測組織或細胞中是否有目標抗原存在，如圖 2-3-1 所示。此種方法可以知道抗原的在組織中的位置也可以看出他的表現量。免疫染色的優點在於專一性、靈敏、及檢測快速，常利用特定的腫瘤生物標記(Biomarker)進行癌症篩選。. 二級抗體 HRP*. 一級抗體. 目標抗原其他蛋白質加入一級抗體. 腫瘤組織. 清洗後加入帶有 HRP的二級抗體. 腫瘤組織. 腫瘤組織. DAB** 清洗後加入DAB** 目標呈現棕色. 顯微鏡下觀察染色結果. 腫瘤組織. 圖 2-3.免疫染色(Immunohistochemistry, IHC)原理示意圖。腫瘤組織上有許多蛋白質，藉由抗體抗原的專一結合性，在由可呈色的化學物質來顯示目標抗原的位置和數量。. 8.

(12) 2-4. 磁染色基礎原理為免疫染色，不同的地方在抗體部分，我們在奈米磁粒子表面接上抗體，在利用抗體抗原的專一結合性進行檢測目標抗原的存在，如圖 2-4 所示。最後我們仍然可以用顯微鏡觀察結果，也可以使用本研究團隊研發之掃描式超導生物感測儀 (Scanning SQUID Biosusceptometry, SSB)[19]偵測磁訊號之儀器，來觀察肝癌組織切片上的整體磁訊號。. 目標抗原其他蛋白質. 二級抗體. 奈米磁粒子加入披覆抗體的奈米磁粒子. 腫瘤組織. HRP*. 清洗後加入帶有 HRP的二級抗體. 腫瘤組織腫瘤組織. DAB**. 顯微鏡&SSB 觀察染色結果. 清洗後加入DAB** 目標呈現棕色. 腫瘤組織 SSB. 圖 2-4. 磁染色示意圖。磁粒子與抗體結合，取代了原本單純的抗體，進而可以使用 SSB 來檢測磁訊號。. 9.

(13) 第三章實驗方法 3-1. 磁性試劑製程我們使用化學共沉法[20](chemical precipitation)來製作磁性流體，並且選用葡聚醣(Dextran)當作介面活性劑[21]，如圖 3-1-1 所示，可以奈米粒子均勻分布在溶劑中，不會受到重力或磁場作用，造成凝聚或沉澱，主要的化學反應式如下 3-1:. 2Fe 3  Fe 2  8OH   Fe3 O4  4H 2 O. (3-1). 先讓 Fe3+ 和 Fe2+反應後再加入葡聚醣，控制 pH 值、時間，在溫度恆定的環境下讓 Fe3O4 披覆上葡聚醣，在用高速離心除去雜質及難溶的沉澱物，最後在層析(gel filtration chromatography ; GFC)使磁粒子分離出不同粒徑，即獲得磁性奈米流體，圖 3-1-2 為磁性流體製作流程。. 10.

(14) 圖 3-1-1. 葡聚醣(Dextran)結構圖. 11.

(15) FeCl2， FeCl3，H2O. 混合攪拌加入NH4OH，葡聚醣. 加熱. 離心. 去除大顆粒子和雜質. 層析. 分離出粒徑大小. Fe3O4 Dextran. 磁性流體. Water 圖 3-1-2. 磁性奈米粒子製作流程最後須將磁性奈米粒子與抗體鍵結成為磁性奈米試劑，將氧化劑高碘酸鈉(Sodium periodate, NaIO4)加入磁性奈米流體中，將葡聚醣 (Dextran)之 C-C 鍵結打開，形成有較高化學能的醛基(-C=O)。等待反應結束後，利用磁性分離法[22]去除多餘的高碘酸鈉，避免過度氧化葡聚醣(Dextran)。將經過磁性分離法的磁流體取出，然後加入抗體，等待反應時間結束，最後在用磁性分離法，分離多餘的抗體，即可得到磁性試劑，下圖 3-1-3 為磁性試劑製作流程。試劑的製程分為披覆單一抗體及披覆多重抗體，混合試劑為等體積比做混合。. 12.

(16) 單一抗體試劑. Antibody. 磁性流體加入NaIO4. 磁性分離. 氧化反應. 加入單一抗體. 磁性分離. 單一抗體試劑. 去除多餘未反應抗體. 去除多餘NaIO4. 混合抗體試劑. 將三種單一抗體試劑按照體積比做混合. 披覆多重抗體試劑磁性流體加入NaIO4. 氧化反應. 磁性分離. 按照濃度比例加入三種抗體. 磁性分離. 披覆多重抗體試劑. 去除多餘未反應抗體. 去除多餘NaIO4. 圖 3-1-3. 磁性試劑製作流程. 13.

(17) 3-2. 老鼠腫瘤的誘發我們選用老鼠種類 F344N，，性別為雄性，老鼠重量為 200~250 克重，肝癌細胞為 GP7TB，細胞數量為 2×107 Cell/隻。雌性老鼠會因為月經的關係導致體內荷爾蒙改變，會影響實驗結果。將肝癌細胞打進老鼠背部皮下組織中，老鼠皮下組織比較鬆散，相較於打入血管或其他部位，會因為血流的關係而擴散，打進皮下組織不會有此現象，並且肝癌細胞可以在此獲得養分，生長成腫瘤。我們分別記錄老鼠背部腫瘤在不同時期的體積，分別為一開始種植的零週，種植後的一週、三週和五週，如圖 3-2-1 所示。利用公式 3-2。. (3-2) 其中 a 為腫瘤高、b 為腫瘤寬、c 為腫瘤高，算出腫瘤大小，如圖 3-2-2。. 14.

(18) 種植後-3週種植後-5週. 種植後-1週. 種植前-0週. a=7.0 mm. a=9.2 mm. b=6.0 mm. b=8.1 mm. c=6.0 mm. c=1.0 mm. 圖 3-2-1. 老鼠腫瘤在不同時期之情況. 腫瘤體積(mm3). 1200 N=5. 1000. Rat 1. 800. Rat 2. 600. Rat 3 Rat 4. 400. Rat 5. 200 0. 0. 1. 3. 5. 種植腫瘤時間(週數) 圖 3-2-2. 五隻老鼠各週期的腫瘤大小. 15. a=14.8 mm b=16.3 mm. c=7.2 mm.

(19) 3-3. 免疫染色與磁染色首先，我們將 5 週的癌鼠腫瘤取下，做成石蠟切片，因組織可以保存時間較長，所以適合各種染色觀察[23]，進行脫蠟後進行我們的免疫染色步驟。以蠟筆圈出組織，目的在於防止加入的液體流出，也可以減少液體使用量。一開始先以雙氧水(H2O2)浸泡 5 分鐘，目的是為了避免細胞中的過氧化酶對染劑產生作用，消除背景，之後再以緩衝溶液 PBS 沖洗 3 次，每次皆為 5 分鐘。清洗完後加入阻斷液(blocking solution)，目的在於減少抗體與非目標抗原的結合，再以 PBS 清洗，清洗完後再將一級抗體如 Alpha-fetoprotein (AFP ，甲型胎兒蛋白 )、 Des-gamma-carboxy prothrombin (DCP，脫羧機凝血酶原)、Glypican-3 (GPC3 磷酯肌醇蛋白聚醣 3)滴在組織切片上，免疫染色與磁染色的差別，在於磁染色是磁性奈米粒子上披覆抗體，使其反應 30 分鐘，再以 PBS 清洗，在滴上含有 HRP 的二級抗體，靜置 30 分鐘後再以 PBS 清. 洗. ，. 最. 後. 再. 加. 入. 辣. 根. 過. 氧. 化. 酶. (horseradish peroxidase , HRP)的呈色劑二胺基聯苯胺(diaminobenzidine, DAB)，等待其反應 5-6 分鐘後，最後呈色後的結果為褐色，實驗流程如圖 3-3-1 及 3-3-2 所示。. 16.

(20) 石蠟切片法 (Paraffin Tissue-Processing method) 製成肝腫瘤切片. 以雙氧水處理組織上的過氧化酶. Blocking 將蛋白質填滿組織沒蛋白質的地方. 組織染Anti-AFP. 將含HRP*的二抗接至AFP抗體上 DAB HRP 二級抗體. 加入DAB** DAB在有HRP的位置氧化還原呈現褐色腫瘤組織. 圖 3-3-1. 免疫染色流程. 17. 抗體抗原其他蛋白質.

(21) 石蠟切片法 (Paraffin Tissue-Processing method) 製成肝腫瘤切片. 以雙氧水處理組織上的過氧化酶. Blocking 將蛋白質填滿組織沒蛋白質的地方. 組織染Anti-AFP MF. 將含HRP*的二抗接至AFP抗體上. DAB HRP 二級抗體. 加入DAB** DAB在有HRP的位置氧化還原呈現褐色腫瘤組織. 圖 3-3-2. 磁染色流程. 18. 磁粒子抗體抗原其他蛋白質.

(22) 3-4. 以癌鼠血清進行 IMR 紀錄大鼠種植肝癌細胞的時間，分別抽取 0、1、3、5 週之老鼠血清，來進行磁減量檢測。抽取老鼠血必須先將老鼠麻醉，之後以加熱燈照射老鼠尾巴，看到老鼠尾靜脈後進行抽血動作，每次抽取約 500 μl 至 2000 μl，血液抽取量會依老鼠的大小而有不同，將取得的老鼠血進行離心，離心速率為每分鐘轉 3000 圈，離心 12 分鐘，離心完的血會分層，上層為透明之血清，下層為紅色血凝塊，抽取上層血清，並保存於負 20 度之冰箱。進行磁減量檢測時，從冰箱取出血清，等待回溫後血清變為液體狀，在與試劑均勻混合後進行檢測，整體流程如圖 3-4 所示。. 老鼠尾靜脈抽血. 取得血液. 保存. 抽取上層血清. 血清. 血液離心. 負20度冷凍保存. 血凝塊. 保存. 試劑與血清均勻混合. 放入樣品進行磁減量檢測. 試劑血清進行量測. 取出血清解凍. 圖 3-4. 癌鼠血清檢流程. 19.

(23) 3-5. 以癌鼠血清進行 ELISA 首先，將標準液(standard)，和稀釋過的血清加 100μl 到孔盤內，然後進入攝氏 37 度的烤箱，靜置 90 分鐘。然後加入含有生物素 (Biotin)的抗體，在攝氏 37 度的烤箱靜置 60 分鐘，之後再用 wash buffer 清洗 3 次，清洗完後加入標記有辣根過氧化酶(HRP)的鏈霉抗生物素蛋白(streptavidin)，在攝氏 37 度的烤箱靜置 30 分鐘，之後用 wash buffer 清洗 5 次，加入 90μl 過氧化酶的呈色劑 (substrate reagent)，在攝氏 37 度烤箱中反應 15 分鐘，最後加入終止液(stop solution)，會由藍色轉變為黃色，在進入 ELISA Reader 讀取吸光值，流程如圖 3-5 所示。. 孔盤上接抗體. 加入含有抗原的血清. 加入標記有生物素(Biotin)的抗體. 抗原. 生物素. 抗原. 加入標記有辣根過氧化酶的鏈霉抗生物素蛋白. 抗原. 加入辣根過氧化酶的呈色劑呈色劑. 鏈霉抗生物素蛋白. 辣根過氧化酶. 抗原. 抗原. 圖 3-5. ELISA 操作流程 20. ELISA Reader 讀吸光值.

(24) 第四章實驗結果 4-1. 切片染色免疫染色的技術現在已經很成熟，我們將免疫染色使用的一級抗體換成磁性試劑，證明了在免疫染色下看到的染色結果也在磁染色中看得到，由於我們的一級抗體是披覆在磁性奈米粒子上，所以當抗體與抗原結合後，磁粒子也相當於在抗原的位置上，在經由掃描式超導生物感測儀 (Scanning SQUID Biosusceptometry, SSB)來觀察肝腫瘤切片的整體磁訊號。免疫染色後的結果在顯微鏡下觀察，但顯微鏡只能看出部分區域的染色情況，無法將整個切片的結果表現出來，藉由 SSB 我們可以看到切片整體的磁訊號，實驗結果如圖 4-1-1 至 4-1-6。. 21.

(25) 100 μ m. 100 μ m. 圖 4-1-1. 左邊使用 AFP 抗體的免疫染色切片與染色結果右邊為使用 GPC3 抗體的免疫染色切片與染色結果. 100 μ m. 100 μ m. 圖 4-1-2. 左邊使用 DCP 抗體的免疫染色切片與染色結果右邊為未免疫染色的切片與顯微鏡下影像. 22.

(26) 100 μ m. 100 μ m. 6.6x10-3. 圖 4-1-2. 左邊使用 AFP 抗體的磁染色切片、染色結果、SSB 訊號右邊使用 GPC3 抗體的磁染色切片、染色結果、SSB 訊號. 23. 0.

(27) 6.6x10-3. 0 圖 4-1-2. 左邊使用 DCP 抗體的磁染色切片、染色結果、SSB 訊號右邊為未磁染色之切片、顯微鏡下影像、SSB 訊號. 24.

(28) 4-2. 以癌鼠血清進行 IMR 隨著老鼠種植腫瘤的週數越來越長，可以發現以 AFP 試劑、 GPC3 試劑、DCP 試劑、披覆多重抗體試劑(抗原濃度比 1:1:1)、混合試劑(體積比 1:1:1)進行檢測，隨著腫瘤成長的時間拉長，檢測到的 IMR 值也隨著變大，如圖 4-2-1 所示。以單一試劑來看， AFP 試劑檢測到的 IMR 值相對較高，各週的變化量表現與 GPC3 試劑差不多，但使用 DCP 試劑檢測出的結果幾乎是緩慢成長，可以推斷出肝癌指標性蛋白，甲型胎兒蛋白(Alpha-fetoprotein, AFP)及磷酯肌醇蛋白聚醣 3 (Glypican–3, GPC3)，隨著腫瘤的成長，老鼠血液中濃度增加的變化量較明顯，則脫羧機凝血酶原 (Des-gamma-carboxy prothrombin, DCP)，濃度隨時間增加的變化量較小。相較於單一試劑，混合試劑與披覆多重抗體試劑，在腫瘤成長至 1 週時，量測得到的磁檢量檢測(IMR)值為 1.11%左右，比 AFP 試劑的 0.96%和 GPC3 試劑的 0.84%大，磁檢量檢測的雜訊最大值為 0.6%，混合試劑與披覆多重抗體試劑可以明顯的測量出磁訊號的衰減，也就是混合試劑和披覆多重抗體試劑在腫瘤生長前期，提供較明顯的測量結果，這也是我們所希望的目標。. 25.

(29) 1.6. IMR (%). 1.2. 磁性試劑. *披覆多重抗體試劑混合抗體 (a:b:c) a : AFP 抗體質量 b : DCP抗體質量 c : GPC3抗體質量. AFP試劑 GPC3試劑 DCP試劑披覆多重抗體試劑(1:1:1)* 混合試劑(1:1:1)*. 0.8 Noise level. 0.4. 0.0. 0. 1. 3. 5. 種植腫瘤時間(週) 圖 4-2-1. 磁檢量檢測量測不同週數癌鼠血清. 26.

(30) 混合試劑的比例選擇部分，我們以 AFP 試劑、DCP 試劑、GPC3 試劑做了 4 種不同的體積比例，並且檢驗了種植肝癌腫瘤前的老鼠血清，種植腫瘤後 5 週的老鼠血清，將後者量測得的 IMR 值減去前者的 IMR 值，發現以比例 AFP:DCP:GPC3=1:1:1 的差異最大，可以明顯的鑑別是否罹患癌症，如圖 4-2-2。. 27.

(31) *混合比例= AFP 試劑: DCP 試劑: GPC3 試劑 1.6. 1 : 0.5 : 0.5 * 0.5 : 0.5 : 1* 0.5 : 1 : 0.5* 1 : 1 : 1*. IMR(%). 1.2. 0.8. 0.4. 0.0. 0. 5. 0 5. 0 5. 0 5. 種植腫瘤後時間（週）. △IMR = IMR(5週)-IMR(0週) 1 : 0.5 : 0.5 * 0.5 : 0.5 : 1* 0.5 : 1 : 0.5* 1 : 1 : 1*. 0.5. IMR(%). 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0. 1:1:1的混合比例具最大的△IMR，可以最明顯鑑別正常/罹癌的差異圖 4-2-2. 混合試劑比例選擇. 28.

(32) 4-3. 以癌鼠血清進行 ELISA 我們採集 0、1、3、5 週各四隻的老鼠血來檢驗，每隻老鼠的血清在各週的檢驗樣品皆為二重複，將每隻老鼠的血清測量兩次後的結果進行平均，然後將平均後的結果做比較，發現平均的數值不一定會隨著腫瘤的成長而成長，因此我們將四隻老鼠血清在各週的量測數值進行平均，以各週進行平均來比較血清內抗原的變化。會發現以 AFP 和 DCP 的 ELISA 結果顯示，隨著腫瘤成長，量測到的數值也相對較大，但 GPC3 的 ELISA 結果顯示，0 週到 5 週老鼠血清內的 GPC3 抗原濃度沒有太大差異，如圖 4-3-1。從實驗數據會發現 ELISA 的靈敏度不高，量測出的結果誤差相當大，所以只能拿來當作參考用。. 29.

(33) (a) 10.0. 濃度(ppb). 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0. 0. 1. 3. 5. 種植腫瘤時間(週). (b) 0.4. 濃度(ppb). 0.3. 0.2. 0.1. 0.0. 種植腫瘤時間(週). (c) 50.0. 濃度(ppb). 40.0 30.0 20.0 10.0 0.0. 0. 1. 3. 5. 種植腫瘤時間(週). 圖 4-3-1. (a)癌鼠血清內 AFP 抗原濃度 (b)癌鼠血清內 DCP 抗原濃度 (c)癌鼠血清內 GPC3 抗原濃度 30.

(34) 第五章結論從免疫染色中，我們可以在顯微鏡下觀察局部區域的目標抗原和表現量，由本研究團隊開發的試劑，以磁性奈米粒子披覆抗體進行磁染色，不僅可以從顯微鏡中看到肝癌組織上抗原的位置，還可以藉由掃描式超導生物感測儀(Scanning SQUID Biosusceptometry, SSB)看出肝癌組織上抗原的磁訊號表現，可以做到定性定量之觀察。 ELISA 進行檢驗時，容易受到環境影響，靈敏度低。但在磁減量檢測中，最大雜訊為 0.6%左右，混合試劑與披覆多重抗體試劑在肝癌生長的前期，可以量測到 1.11%，相較於 AFP 試劑的 0.96%，更可以明顯的做出判斷。. 31.

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