3-1 螢光奈米鑽石(Fluorescent nanodiamonds, FND)製備
為了先去除鑽石表面的雜質(石墨層…等)，秤取買來的合成 100nm 鑽石
（synthesis nanodiamond）700 mg 放置在玻璃皿上於高溫爐中加熱至 450℃，
維持 2 小時，利用空氣中的氧氣進行氧蝕（oxygen etching )，氧蝕過程中可以
（turbo pump）將壓力抽至低於 1 × 10-6 torr，接著打開氦氣閥、高壓系統（40keV accelerator）與轉動系統，進行氦離子束佈植。佈植過後的奈米鑽石顆粒以酒 精自銅帶上取下，由於鑽石不易均勻分布在銅帶上，使得鑽石也不易均勻接受離 子束的照射, 因此須重複此動作 2 次以確保鑽石均勻接受照射 。平均而言，每 單位面積所接受氦離子的劑量約為 1×1013 cm-2 。將受轟擊的鑽石以 CleanTip Swabs 沾酒精自銅帶上刮下，再置於 800℃，壓力 50~60mtorr 的橫式管狀高溫爐 中，高溫焠火程序（annealing）2 小時，以形成 nitrogen-vacancy (N-V )- 缺 陷中心。最後利用氮氣將樣品吹乾或是放置水浴鍋上，就可以得到粉末狀的螢光 奈米鑽石。
圖 18：螢光奈米鑽石製備示意圖
3-2 螢光奈米鑽石螢光測量
我們先將製備好的螢光奈米鑽石以水配成(1mg/mL)的水溶液，再以我們自己架 設的螢光光譜測量奈米鑽石的螢光光譜，此裝置中我們是以 532nm Nd:YAG CW-laser 當作激發光源，雷射經過一 dichronic mirror (Z532RDC;Chroma Tech) 反射至一物鏡，再將雷射聚焦於樣品上，最後樣品所放出的螢光通過 long pass filter 進入光譜儀(C7374;Hamamatsu)偵測分析螢光譜。(如圖 16)
3-3 螢光奈米鑽石粒徑大小與表面電位測量
將螢光奈米鑽石配製成 10ug/ml 水溶液，使用動態光散射粒徑分析儀測量粒徑 大小與表面電位。
3-4 人類胚胎變異腎細胞(Human embryonic kidney 293T)培養
Human Embryonic Kidney 293T (HEK293T) 細胞是由人類腎臟胚胎變異所得的 特殊細胞株，HEK293T 細胞容易培養且分裂速度快，又容易轉染，故經常被使用 在細胞研究上。
細胞解凍:將細胞冷凍管自液態氮桶中取出，迅速放置於 37℃恆溫水浴槽中解 凍，再以 70%酒精消毒放入無菌操作台中。將細胞冷凍管中的細胞加到 10mL 培 養液中(DMEM+10%FBS)，均勻混和後，使用離心機以 1000rpm、5 分鐘將細胞離心 收集在離心管底部。移除上清液，加入 10mL 細胞培養液，混和均勻移至細胞培 養皿中，放置 37℃細胞培養箱(Incubator)中，培養的環境為 37℃、5% CO2與 100%濕度。
細胞遷移(passage):待細胞長滿培養皿空間約 70%-90%時，將培養皿中的培養
neuroblastoma N18 cells) 培養
培養方式與 HEK293T 細胞相同，但是培養液需使用 DMEM+5%FBS
3-6 螢光奈米鑽石表面修飾牛血清蛋白(Bovine serum albumin, BSA)
秤取螢光奈米鑽石若干毫克，放入滅菌釜中滅菌，待滅菌完成後後放入烘箱中 乾燥，取出配置成 1mg/mL 的鑽石水溶液，放置超音波震盪器中震盪 30 分鐘。同 時，秤取牛血清蛋白若干毫克，配置成 1mg/mL 的水溶液，均勻混和後，使用 millipore 0.22um filter 過濾溶液中的雜質。最後以 1:1 的螢光奈米鑽石水溶 液與牛血清蛋白水溶液混和，vortex 震盪約 1 小時。接著用 PBS 將沒有接在鑽
石表面的 BSA 洗去，使用 millipore 100K Dalton filter 以離心方式離去沒街 上的牛血清蛋白，最後再以 PBS 回溶修飾 BSA 的螢光奈米鑽石，儲存於 4℃的冰 箱中。
3-7 細胞膜染色 Wheat germ agglutinin 488 conjugate(WGA)
使用適量的 37℃ PBS 沖洗細胞，移除 PBS，在避光的條件下，加入適量(以能 覆蓋細胞為原則)配置好的螢光染料 Wheat germ agglutinin 488 conjugate 溶 液，濃度為 0.5ug/mL。靜置 10-15 分鐘後，再使用 PBS 清洗細胞 3-5 次，即可
3-9 細胞轉染(Transfection)
轉染是一種可以把外來的 DNA 攜帶進入真核細胞中，並且讓細胞表現出外來 DNA 的一種技術，在細胞學上經常被運用來標記特定的蛋白質與受器。在這邊我 們使用轉染試劑(Lipofectamine LTX)，先讓脂質體(liposome)包覆質體
(plasmid)後，再讓細胞去包吞帶有質體的脂質體，最後在細胞內釋放出質體給 細胞表現。
綠色螢光蛋白-肌動蛋白 (GFP-Actin)轉染
要轉染的前一天，先準備好細胞足夠的細胞(覆蓋整個培養皿約 70-80%)放入 培養皿，並且讓細胞有足夠的時間可以貼覆在基底上。取 100uL Opti-MEM 培養 液，加入 500ng 的 plasmid DNA，再加入 0.5uL 的 Lipofectamine LTX reagent (脂 質體)，並且靜置 30 分鐘。待反應完成後，再加入 400uL 的細胞培養液，吸出培 養皿內的培養液，加入含有 DNA 與脂質體的培養液，最後放回培養箱中，等待 18-24 小時候，轉染就完成了。(這邊培養皿的基底表面積約為 2cm2)
綠色螢光蛋白-微管 (GFP-Microtubulin)轉染
步驟同轉染綠色螢光蛋白-肌動蛋白 (GFP-Actin)，只是 plasmid 不同。
圖 19：細胞轉染示意圖
3-10 螢光奈米鑽石細胞標記(Label FND)
直接式標記:在細胞遷移時，計算好細胞數目，取適量細胞加入培養液內，均 勻混和後加入培養皿內，並放入放入培養箱內，待細胞完全貼附。將配置好的螢 光奈米鑽石水溶液，以不含 FBS 之 DMEM 稀釋至目標濃度，接著放入超音波震盪 器中震盪約 30 分鐘。同時，取出細胞，並用 PBS 清洗細胞表面，吸出 PBS 再加 入含有螢光奈米鑽石的 DMEM 培養液，靜置培養箱 4 小時。待時間到後，再取出 細胞吸出培養液，接著用 PBS 清洗 3-5 次，最後將細胞打下，再放入新的培養皿 中。
倒立式標記:步驟同直接式，差別是將細胞培養在玻片上，並且用倒立的方式 去標記(如圖 20)所示。此種方法能避免大顆的螢光奈米鑽石或是聚集在一起的 螢光奈米鑽石進入細胞，能有效的讓細胞包吞進小顆的螢光奈米鑽石。
圖 20：倒立式標記示意圖