緒論 - 即時追蹤單粒螢光奈米鑽石於細胞膜通道與神經突中

1-1 前言

隨著奈米科技（nanotechnology）不斷進步與發展，奈米生物科技成為一個重要的領域，其中以奈米粒子進行螢光標記與追蹤，是一個重要的方向。初期的實驗中，是以合成的螢光染料分子（fluorescent synthetic dye molecules）或螢光蛋白（fluorescent protein）^1-2來標記，它們都是分子等級的尺規，故容易進行化學標記，使其廣泛地應用在生物體標記上，但是其中仍有許多的問題需要克服，例如：螢光訊號穩定性差、易產生光漂白（photobleaching），因此限制了在螢光顯微鏡下的觀察時間與追蹤，並且染料與螢光蛋白容易受環境與化學修飾干擾，因此量子點（quantum dot）被發展出來解決這些問題。

量子點（quantum dot）是奈米尺寸的半導體材料，逐漸限制其三度空間時，

會發生量子侷限效應（quantum confinement effect），使得價帶（valance band）

與傳導帶（conduction band）能階差接近可見光能量範圍，經適當的光源激發

上排是以綠色螢光染料 AlexaFluor488 標記肌動蛋白(actin)與用 QD⁶⁰⁵標記細胞核;下排 AlexaFluor488 標記細胞核與用 QD⁶⁰⁵標記肌動蛋白。

圖 2：以 365nm 光源激發不同粒徑 CdSe 量子點放螢光⁵

圖 3：量子點吸收與放光光譜圖⁵

黑色為實線為螢光波長 510nm 量子點的吸收光譜，其他為各種不同螢光坡常量子點的放光光譜。

圖 1：量子點與一般染料放光穩定度比較圖⁵

一個優良的螢光探針（fluorescent probe），需要具有：螢光強度高、光穩定性佳、高生物相容性（bio-compatibility）、易進行化學修飾…等。近年來碳系材料不斷的發展，在生物標記上有著極大潛力的螢光奈米鑽石（fluorescent nanodiamonds）逐漸被重視與發展，奈米鑽石是奈米級的鑽石結晶體，在結構上非常穩定，有極佳的化學惰性（chemical inert），因此生物毒性極低15-18,21-22，此外，透過化學處理後表面能夠產生羧基（carboxyl group ,-COOH）¹⁴，使其容易進行之後的化學修飾。螢光光源來自於堅固的晶體結構中的缺陷中心

（defect center），使之具有優異的光學穩定性^14,21，不因表面化學修飾與環境改變而影響螢光特性，其中帶有負電荷的氮原子-空缺(N-V^-)螢光放光波段在近紅外光範圍¹⁴(見圖 4)，故非常適合用來進行長時間的生物體螢光標記，這些特性使得螢光奈米鑽石成為具有生物探針發展潛力的新穎奈米材料。

圖 4：螢光奈米鑽石的吸收與放光光譜

1-2 螢光奈米鑽石(Fluorescent nanodiamond, FND)

自古以來，鑽石一直是財富與權力的象徵，鑽石發出閃耀動人的光澤，被許多人視為珍貴的寶物，同時越大的鑽石也被認為越有價值。但隨著科技的發展，人們漸漸的開始探索奈米等級的物質，各種物質與材料都在奈米尺寸上被研究，鑽石也不例外。在尺度介於 1 - 100 奈米時，我們就稱之為奈米鑽石(nanodiamond)，

它們同時具有塊材(bulk)的優點與奈米的特性，故在實驗室與工業被廣泛的應用 (van der waals force)彼此吸引而推疊，因此石墨容易層層剝落。

鑽石又稱為金剛石，在晶格中每個碳原子都與其鄰近的四個碳原子形成共價鍵，

為面心立方體(face-center cubic crystal)，由於鑽石是 sp³的結構，因此鑽石有極高的熔點和極大的硬度，莫氏硬度（Mohs hardness）高達 10，同時也具有極佳的導熱能力，熱導率（thermal conductivity）為 900～2320 w / (m·K)，

密度則是 3.5 - 3.53 克每立方公分。由於鑽石的價帶與傳導帶能接極大，因此

在可見光區沒有強烈的吸收，這是鑽石看起來晶瑩剔透的原因。然而其極高的折射率，以標準黃色鈉光（589.5 奈米）來說其折射率為 2.417，而全反射臨界角

（total internal reflection critical angle）為 24.5°，因此，當鑽石經過適當的切割研磨之後，即能顯現出炫目的光彩。

(a)石墨的圖與碳原子鍵結的示意圖 (b)鑽石的圖與碳原子鍵結的示意圖

圖 5：石墨與鑽石結構圖

1-2-2 鑽石的種類

談到鑽石，大部分的人都會認為只有一種，其實不然。依據內部所含的雜質種類與雜質的濃度，我們可以將鑽石分為四大類，分別為 Type 1a、1b、2a、2b。

如表所示，所謂的 Type 1 類鑽石主要由於內部所含的雜質為氮原子。Type 2 類鑽石則內部幾乎沒有含氮原子或是含有其他種類的原子。在自然界中，有 98%的天然鑽石屬於 Type 1a 類，此類鑽石中所含的碳原子濃度可以到達 0.3%，而且這些內部的氮原子通常都會聚集在一起，此外依照聚集方式的不同我們有將 Type 1a 分成 Type 1aA 與 Type 1aB，前者主要為碳原子鄰近位置有兩個氮原子 (A aggregates)，後者為碳原子周圍四個位置都為氮原子(B aggregates)。而天然鑽石中 Type 1b 的含量最為稀少，大概只有 0.1%，絕大多數以合成方式所產生。而市面上所見價格昂貴的鑽石，就是屬於 Type 2a 類，這類型的鑽石自然界的含量約為 1~2%，內部幾乎不含其他雜質，為最純的鑽石。Type 2b 的鑽石內部

Type Feature Color Natural

Abundance Note

1a Nitrogen atom concentration up to 0.3%

clustered together within the carbon lattice

Colorless,

yellow 98% Most natural diamonds

1b Nitrogen atom spread evenly throughout the carbon lattice

Yellow, orange,

brown 0.1%

Almost all synthetic diamonds

2a No or little nitrogen atoms contained

Colorless, yellow, brown,

pink, purple

1–2% The “purest”

diamonds

2b No or little nitrogen but boron contained

p-type semiconductor Blue, gray 0.1%

表 1：鑽石的種類⁶

雖然不含氮原子，但有其他元素，例如硼原子，此類鑽石有時也會用來當作 P 型半導體材料。

1-2-3 缺陷中心的種類

當 type I 鑽石以高能量粒子束（如中子束）或離子束（如電子、氫離子或氦離子束）進行佈植轟炸後，置於真空內高溫焠火（annealing），使得在佈植過程中產生的空缺（vacancy）會與鑽石內原有的氮原子結合，形成各種缺陷中心，

在光譜上就能看到許多獨特的吸收與螢光帶（absorption/luminescence bands）。

我們可以發現在螢光奈米鑽石中，主要的螢光來自於兩個含氮的缺陷中心—不帶電的氮空缺中心(N-V)⁰及帶負電的氮空缺中心(N-V)^-，其中(N-V)⁰的零聲子線

（zero-phonon line, ZPL）為 574.9 奈米，而(N-V)^-的零聲子線則為為 637.2 圖 6：各種類型鑽石的結構示意圖²³

奈米。而本篇主要的缺陷中心是(N-V)^-，此中心由 type 1b 的鑽石經加工而成的，

實驗的方法與結果則在後面的章節中詳述。下面則列出各種缺陷中心(見圖 7)與各種缺陷中心的資料表(見表 2)。

氮原子以黑色表示、碳原子以灰色表示

ZPL 指零聲子線（zero-phonon line）波長，λem 是常溫最大的放光波長，τ為放光生命期（emission lifetime），而φ是螢光量子效率（quantum efficiency）

圖 7：各式 Nitrogen-Vacancy 結構圖⁸

表 2：各種缺陷中心的資料⁷

1-3 Tunneling nanotubes (TNTs)

細胞與細胞之間的溝通(cell-to-cell communication)，對於單細胞生物體 (unicellular organism)與多細胞生物體 (muticellular organism)的發展、生命維持與體內平衡扮演著極重要的角色^47,56。在過去的研究中，細胞與細胞間的溝通主要是經由神經元突觸(synapses)、隙縫連接(gap junction)和胞間絲連 (plasmodesmata, in plants)^25-26傳遞物質與訊息43,49,54-57。

西元 2004 年，人們在實驗室中培養嗜鉻細胞瘤細胞(pheochromocytoma cell,PC12) ⁵⁶時，發現了一種新的、敏感的、長距離的(可到數百個μm)細胞間溝通方式，此後便用 tunneling nanotubes，也就是 TNTs 來泛指細胞間像管子般細長的細胞膜通道。更進一步的研究指出 TNTs 除了在培養皿中(in vitro)出現，同時也在生物體內(in vivo)一些特定的發展過程中被觀察到，例如:小鼠的胚胎與神經系統的形成(blastocyst formation and neurulation in mice)^28-29、果蠅(Drosophila)胚胎背部表皮閉鎖細胞(dorsal closure)²⁷、老鼠的眼角膜 (cornea)²⁴…等，甚至在細菌(bacteria)間也可以看到 TNTs 的蹤跡^30,35。因此有人認為，TNTs 是代表著一種由細菌變異到哺乳類動物細胞間獨特的長距離的溝通方式⁴⁰。

1-3-1 可形成 TNTs 細胞

會形成 TNTs 的細胞種類很多(見表 3)，以哺乳動物細胞(mammal cells )與免疫系統細胞(immune cells)占多數，而每一種細胞產生的 TNTs 特性，如:長度、

通道直徑(20-1000nm)、組成結構、形成時間、傳遞的物質…等，也都不盡相同

44,47-49。在這邊我們選擇 Human Embryonic Kidney 293T (HEK293T)⁴¹細胞作為研

究 TNTs 的對象。

1-3-2 TNTs 的形成方式

肌動蛋白驅動的突出物(Actin-driven protrusions)：細胞的表面會先向外長

出偽狀絲足突出物(filopodia-like protrusion)，然後突出物會伸向鄰近的其 germ agglutinin(WGA)來標記(見圖 9)⁴⁹。WGA 是一種被廣泛用來標記細胞膜的螢光染料，細胞用 WGA 標記之後，科學家使用共軛式聚焦顯微鏡去掃描細胞，確認 TNTs 是屬於細胞膜的一部分，再從不同的角度去觀察 TNTs(見圖 9B)，進而發現了 TNTs 不是貼附在底部，而是懸掛在空中的，就好像吊橋一般。由於螢光顯微鏡的解析度有限，想要瞭解更細微的結構就要借助於於掃描式電子顯微鏡 (Scanning electron microscopy, SEM)和穿隧式電子顯微鏡(Tunneling

electron microscopy, TEM)來觀察⁵⁶。從 SEM 的結果（見圖 10F）可以得知，

TNTs 在兩個互相連結的細胞上，都呈現出沒有縫隙的結構。而從 TEM 的結果(見圖 10G)，可以看見 TNTs 是一個連續的構造，這表示 TNTs 的所連接的兩個細胞是一個連續沒有間斷的結構。

表 3：可形成 TNTs 的細胞種類⁴²

圖 8：TNTs 形成的示意圖⁴⁰

A:y 切面來觀察 B:從 x-z 切面來觀察

圖 9：共軛式聚焦顯微鏡來觀察 WGA 標記的細胞 TNTs

F:掃描式電子顯微鏡 (Scale Bar F:10um F1-F3:200nm) G:穿隧式電子顯微鏡 (Scale Bar G:2um G1-G2:200nm)

圖 10：TNTs 電子顯微鏡圖

1-3-4 TNTs 的組成

TNTs 的組成主要是由肌動蛋白(actin)與微管(microtubulin)這兩種蛋白質所聚合構成的。在不同種類細胞上形成的 TNT 中都可以找到肌動蛋白(actin)的蹤跡，然而微管(microtubulin)則不一定；在有微管的 TNTs 上則發現它們的通道直徑都比較粗大(大於 0.7um)，而只由肌動蛋白組成的則比細小⁴⁷。

1-3-5 TNTs 傳送的物質

由於不同種類細胞形成的 TNTs 異質性很大，可以傳送的物質也都不太一樣(見圖 11)。其中可傳送的物質包括：內囊胞(endosome)、鈣離子(Ca²⁺)、蛋白質、

細菌(bacteria)、病毒(virus)，甚至到巨大的包器粒線體(mitochondrion)都可以藉由 TNTs 來傳輸。

有研究指出，帶有愛滋病病毒(HIV)的 T 細胞(T cell)可以經由 TNTs 來感染正常的 T 細胞^31,36，達到病毒擴散的效果。而且不只是病毒，普立昂蛋白(prions protein)^32-33也可藉由 TNTs 來汙染神經系統使人致病;除此之外，帕金森氏症 (Parkinson's disease)³⁴也與 TNTs 有關係。

現 TNTs 到現在還不到 10 年，因此尚有許多東西尚未明瞭，但明顯地，TNTs 的物質傳遞與許多疾病的生成、感染有著極大的關係，科學家也希望可以藉由對 TNTs 的研究，更深入地瞭解細胞間的溝通與開發出治療疾病的方法。

圖 11：可經由 TNTs 傳遞的物質⁴⁰

1-4 神經突(Neurites)

神經細胞(見圖 12)除了有一般細胞的胞器外，還多出了樹突(dendrites)與軸突(axons)，其中樹突是神經細胞接收神經傳導物質(neurotransmitters)的胞器，

可以說是神經細胞的接收器;軸突則是傳遞神經傳導物質、電訊號、粒腺體與內囊胞的通道，在軸突尾端可以釋放出神經傳導物質，藉由樹突與軸突互相配合可達到傳遞訊息的效果。在許多重大的人類神經退化性疾病中，包括阿茲罕默症 (Alzheimer's disease)、帕金森氏症(Parkinson's disease)和肌萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS），都顯示與軸突的病變有關，包括蛋白質與粒腺體的異常積累^62-63。這些病症與軸突的運輸過程出現問題有很大

在文檔中即時追蹤單粒螢光奈米鑽石於細胞膜通道與神經突中 (頁 10-26)