4-1 螢光奈米鑽石
奈米鑽石經過實驗室自行架設的高壓系統(40 keV accelerator)來進行氦離子 (He+)轟炸束佈植後，再經過高溫淬火與酸洗，最終製備完成螢光奈米鑽石。將 螢光奈米鑽石配置成 1mg/mL 的水溶液後，使用螢光光譜儀，以 532nm 雷射激發 後，測得其光譜圖(見圖 21)。
圖 21：螢光奈米鑽石光譜圖
FND 標準品光譜圖(黑線)、自製螢光奈米鑽石的光譜圖(紅線)、修飾上 BSA 的螢 光奈米鑽石光譜圖(藍線)
透過螢光光譜圖，我們可以得知，螢光奈米鑽石帶有兩種發光中心：其中一種 是 NV0，其 zero phonon line 在 575nm，而另一種是 NV-，其 zero phonon line
在 638nm。此外，我們可以藉由標準品來比較我們自製的螢光奈米鑽石的螢光強 度，螢光奈米鑽石標準品是使用中央研究院物理研究所離子佈植機，能量為 3 MeV 的 proton beam 對 100nm 的奈米鑽石進行佈植，其輻射劑量為 2×1016 H+/cm2，之 後再經過高溫焠火與酸洗，最後配置成 1mg/mL 水溶液即為標準品。
從圖 21 中相互比較可以得知，實驗室所製造的螢光奈米鑽石螢光強度約為標 準品的一半，而修飾上 BSA 的鑽石強度則在比未修飾的鑽石略低一些，這是因為 在修飾的過程中，螢光奈米鑽石有損失，以致於真正的濃度略低於 1mg/mL 造成 強度下降。
使用動態光散射粒徑分析儀，可以得到實驗室所製造的螢光奈米鑽石粒徑大小 為 84.5±23.1 nm，而修飾上 BSA 的螢光奈米鑽石粒徑大小為 104.2±25.5 nm (見 圖 22)，其粒徑因為 BSA 的修飾約增加 20nm。測定螢光奈米鑽石的表面電位為 -44.11 mV，而修飾上 BSA 的鑽石則為-35.65 mV(見圖 23)，其電位沒有因為修 飾 BSA 而增加太多，但是螢光奈米鑽石修飾過 BSA 後，可以在 PBS 中有良好的懸 浮性10。
圖 22：螢光奈米鑽石與修飾上 BSA 的螢光奈米鑽石的粒徑分佈圖
圖 23：螢光奈米鑽石與修飾上 BSA 的螢光奈米鑽石的表面電位圖
4-2 TNTs 形成時間點
HEK293T 細胞間要產生 tunneling nanotubes(TNTs)時，需要等待細胞完全貼 附在培養皿後，才有機會向外長出偽狀絲足突出物，並進一步與鄰近的細胞形成 TNTs，因此時間是一個重要的因素。除此之外，由於 TNTs 的形成需要至少兩個 細胞才會形成通道，因此單位面積的細胞數目(細胞密度)也會影響 tunneling nanotubes (TNTs)生成的數目與機率。
這邊我們使用 35mm 的培養皿，加入約 2×105個細胞，並在 19 小時(見圖 24A) 可發現已經有少數細胞形成通道，而到了 27 小時(見圖 24B)，通道的形成更是 頻繁。
以我們的條件來說，推定大約 18 小時左右邊可以開始形成 tunneling nanotubes (TNTs)，隨著時間的增加，TNTs 的數目也隨之有增加的趨勢。
圖 24：不同時間點 TNT 形成 DIC 圖 (A)19 小時與(B)27 小時 HEK293T 細胞 DIC 圖
4-3 HEK293T 細胞轉染(Transfection)綠色螢光蛋 白
文獻上指出，依照 TNTs 構成的分類有兩種，一種是只包含肌動蛋白(actin)，
另外一種則是同時有肌動蛋白與微管(microtubulin)。只由機動蛋白所構成的 TNTs 半徑較細小，而有肌動蛋白與微管同時構成的 TNTs 則半徑較粗大。
這邊利用細胞轉染的方式，使細胞自己所生成的肌動蛋白與微管，修飾(fused) 上綠色螢光蛋白(Green fluorescent protein, GFP )。利用綠色螢光蛋白標記 肌動蛋白與微管，進而確定 HEK294T 細胞間所形成的 TNTs 是屬於何種類型，雖 然轉染效率並非如同螢光染料是 100%，但還是可以間接證明 TNTs 的組成。
圖 25 中綠色的訊號為綠色螢光蛋白(GFP)所發出的螢光，圖 25(A)肌動蛋白修 飾上綠色螢光蛋白螢光圖、圖 25(B)細胞 DIC 圖加上肌動蛋白修飾上綠色螢光蛋 白螢光圖，從圖 25 中可以看到 TNTs 的部位與綠色的訊號幾乎重疊，這表示 TNTs 中有肌動蛋白的存在。再看圖 26(A)微管修飾上綠色螢光蛋白螢光圖、圖 26(B) 細胞 DIC 圖加上微管修飾上綠色螢光蛋白螢光圖，TNTs 也是與其綠色螢光蛋白 的訊號重疊，故由這些結果可以認定 HEK293T 細胞間的 TNTs 是同時包含肌動蛋 白與微管。
圖 25：綠色螢光蛋白-肌動蛋白轉染結果圖
圖 26：綠色螢光蛋白-微管轉染結果圖
4-4 修飾上 BSA 的螢光奈米鑽石與 WGA 共同標記 HEK293T 細胞
細胞經過 WGA 與修飾上 BSA 的螢光奈米鑽石標記後，接著去掃 confocal，可 得到不同 Z 切面的螢光圖(見圖 27)，紅色的訊號為螢光奈米鑽石的螢光，綠色 的訊號為標記細胞膜染料的螢光。Z 切面的高度依序為圖 27(A)、(B)、(C)、底 部 - (D)。為了增加細胞內鑽石標記的數目，所以使用高濃度螢光奈米鑽石來標 記，所以導致有些鑽石大量在溶液中聚集，故圖中有少數大顆的紅點，我們推測，
如果降低濃度鑽石標記的濃度應可以避免此問題。
(見圖 27)其中可以看到圖 27(B)與(C)兩張圖分別是聚焦於 2 個不同高度的 TNTs 上，並且由共軛式聚焦系統(confocal)可以看到螢光奈米鑽石的訊號在 TNTs 中出現，由於標記了細胞膜，可以看到 TNTs 上有紅色與綠色訊號的重疊 (colocalization)，並經由不同 Z 切面的比較，可以進一步得知，螢光奈米鑽石 不是在 TNTs 的膜上面，而是在 TNTs 裡面。這提供了我們螢光奈米鑽石可以在 TNTs 內中傳輸與追蹤的可能性。
圖 27：細胞不同 Z 軸的切面螢光圖
4-5 DiO 標記 HEK293T 細胞內囊胞
DiO 螢光染料對於標記內囊胞(endosome)有很好的專一性，內囊胞的主要功能 是當細胞發生包吞作用(endocytosis)時，包覆物質並供細胞在體內運輸用。同 時有報導指出，HEK293T 細胞形成 TNTs 後，發現有內囊胞存在於 TNTs 中41。
圖 28(A)為細胞的 DIC 圖，圖 28(B)、(C)、(D)與(E)依序為 0 到 6 分鐘，每 2 分鐘拍的 DiO 染料螢光圖。從螢光圖中我們可以看到，在細胞內與 TNTs 內有許 多內囊胞存在，並且有內囊胞在 TNTs 中有運動，但是在幾次激發觀察後，便發 現染料強度有變弱的趨勢，因為螢光染料有光漂白的問題。
圖 28：DiO 標記 HEK293T 細胞結果圖
4-6 修飾上 BSA 的螢光奈米鑽石與 DiO 共同標記 HEK293T 細胞
見圖 29 為其倒立式螢光顯微鏡之細胞影像圖，圖 29(A)DiO 標記內囊胞螢光圖、
(B)螢光奈鑽石紅色螢光圖、(C)DiO 螢光與螢光奈鑽石螢光的疊圖、(D)細胞 DIC 圖與圖(C)的疊圖。
過去的研究指出，經由包吞作用的奈米鑽石會被包覆於內囊胞中，且不會逃離 內囊胞至細胞質裡。由圖 29(C)可以看出，螢光奈鑽石的訊號與 DiO 螢光染料的 訊號重疊的非常好，只有少數的聚集的螢光奈鑽石沒有與其重疊，原因可能是集 結成大顆的螢光奈鑽石沉降在細胞表面上，經由非包吞作用的方式，直接進入細 胞所導致。
由圖 29 的結果可以推斷絕大部分的螢光奈鑽石經由細胞包吞作用進入細胞內，
進入細胞後，螢光奈鑽石大部分都在內囊胞中，這與過去的研究結果相符合。同 時文獻上指出 HEK293T 細胞間形成的 TNTs 可以傳遞內囊胞，同時我們也可以在 TNTs 中同時看到螢光奈鑽石與 DiO 訊號的重疊，這樣的結果，提供了我們螢光 奈鑽石在 TNTs 中傳輸與追蹤是有可能的。
圖 29：修飾上 BSA 的螢光奈米鑽石與 DiO 共同標記 HEK293T 細胞圖
4-7 神經突形成的時間點
當老鼠神經母細胞瘤細胞(N18 cells)貼附在培養皿，便會開始向外長出神經 突(neurites)，見圖 34(A)(B)為培養 1 天、(C)(D)為培養 2 天。由圖 34 中我們 可以看到第 1 天，已經有許多細胞向外長出神經突，當到第 2 天時，神經突的長 度已經可以長到數百個μm，在這邊則不需像 TNTs 考慮細胞密度，只需要注意時 間即可。
圖 30：老鼠神經母細胞瘤細胞神經突圖
4-8 修飾上 BSA 的螢光奈米鑽石標記 N18 細胞
圖 35(A)為細胞 DIC 圖、(B)為螢光奈米鑽石螢光訊號圖、(C)為(A)與(B)的疊 圖、(D)為圖(C)中間 N18 細胞神經突放大圖。由圖 35 可看到螢光奈米鑽石被胞 吞進細胞，並均勻的分佈在細胞中，同時在神經突上也可以發現鑽石的蹤跡。
圖 31：螢光奈米鑽石標記 N18 細胞圖