(一)、RNA萃取 (Ultraspec-ll RNA isolation kit)
收集 1 × 107 個抗神經壞死病毒之小鼠單株抗體融合瘤細胞 (HyBridoma 56, HB 56) 包含培養液於 15 ml 離心管中，以 180 × g 離心 5 分鐘後去上清液，以 10 ml PBS 再懸 浮細胞，再以 180 × g 離心 5 分鐘後去上清液，同樣再以 1 ml PBS 懸浮細胞將其置換於 1.5 ml 離心管中，再以 180 × g 離心 5 分鐘後去上清液，接著加入 UltraspecTM RNA 1 ml vortex 後，靜置於冰上 5 分鐘，再加入 200 μl 的 chloroform 上下倒置離心管 15 秒後，
再置於冰上5分鐘，接著離心 12,000 × g 15 分鐘 4℃ 後，取上清液至新離心管中，加入 300 μl 的 isopropanol，vortex 30秒後，離心 12,000 × g 1 分鐘 4℃ 後，去上清液後加入 75％
酒精 1 ml vortex 30 秒後，離心 12,000 × g 30 秒 4℃，再次去上清液後加入 75％ 酒精 1 ml vortex 30 秒後，離心 12,000 × g 30 秒 4℃，去上清液後，再離心12,000 × g 3 分鐘，
接著將離心管中殘留之酒精去除乾淨後，加入 50 μl的 DEPC-H2O 所得即為小鼠單株抗體 融合瘤細胞 RNA。
(二)、RNA的反轉錄 (Reverse Transcription)
將 RNA 定量至 5 μg，再補 DEPC-H2O 至 18 μl，接著加入 1 μl 的 oligo dT (1 μg/μl) 和 1 μl 的 dNTP (10 mM) 使其總量為 20 μl，vortex，spin down後放置於乾浴槽以 65℃ 作 用 5 分鐘，接著再冰浴 5 分鐘後，同時加入 5 μl的 RT buffer、1 μl 的 RNAin (RNAase inhibitor)、1 μl 的 RTase，vortex，spin down 後放置於乾浴槽以 37℃ 作用 2 小時 (或是 42℃ 作用 1 小時) 所得即為 cDNA。
(三)、引子 (primer) 設計
分別針對抗神經壞死病毒之小鼠單株抗體融合瘤細胞 HB 56 heavy chain 、抗神經壞 死病毒之小鼠單株抗體融合瘤細胞 HB 56 light chain 、石斑魚免疫球蛋白 IgM Fc 片段 (CH2-CH4)、chimeric heavy chain，以接入不同載體的 7 組引子設計如下
HB56 heavy chain to pET 20b-grouper IgM CH2-CH4
plasmid forward primer (Nde I)：GGGAAT
TCCATATGCAGGCCCAACTGCAGCAGCCTGGG
HB56 heavy chain to pET 20b-grouper IgM CH2-CH4 plasmid reverse primer (Hind III) : CCCA AGCTTTGTACATATGCAAGGCTTACA
HB56 light chain to pET 23a forward primer (Nde I) : GGGAATTCCATTGGACATTGTGATG ACCCAGTCTCAG
HB 56 light chain to pET 23a reverse primer (Hind III) :CCCAAGCTTACACTCATTCCTGTT GAAGCTCTT
IgM constant region for CH2-CH4 to pET20b forward primer (Hind III) : CCCAAGCTTATATAT CAGTTGCCAACTCTTAAAGTA
IgM constant region for CH2-CH4 to pET 20b reverse primer (Xho I) : CCGCTCGAGCTGGGCC TTGCACGTTTCAGGGATGTT
chimeric heavy chain to pSecTaq2A forward primer (Asc I) : TTGGCGCGCCAGGCCCAACTG CAGCAGCCTGGG
chimeric heavy chain to pSecTaq2A reverse primer (Xho I) : CCGCTCGAGGCTGGGCCTTGC ACG TTTCAGGGATGTT
HB 56 light chain to pSecTaq2B forward primer (Hind III) : CCCAAGCTTGACATTGTGATG ACCCAGTCT
HB 56 light chain to pSecTaq2B reverse primer (Xho I) : CCGCTCGAGGACACTCA TTCCTGT TGAAGCTCTT
Chimeric heavy chain to p-N1-pSecTaq2B HB 56 light chain plasmid forward primer (Kpn I) : CGGGGTACCCGA TGTACGGGCCAGATATACGCG
Chimeric heavy chain to p-N1-pSecTaq2B HB 56 light chain plasmid reverse primer (Not I) : ATAAGAATGCGGC CGCTTACTGGGCCTTGCACGTTTC
HB 56 light chain to p-EGFP-N1 forward primer (Nhe I) : CTAGCTAGCATGGAGACAGACA CACTCCTGCTA
HB 56 light chain to p-EGFP-N1 reverse primer (EcoR I) : CCGGAATTCCAGCATGCCTGC TATTGTCTTCCC
(四)、聚合酶連鎖反應 (Polymerase chain reaction, PCR)
每次的聚合酶連鎖反應是在最終體積 50 μl 的反應溶液中進行分別加入 template DNA (0.05 μg)、dNTP (0.2 mM)、forward primer (0.1 μΜ)、reverse primer (0.1 μΜ)、1 μl的 (5 U/μl) Bio Taq DNA polymerase、5 μl 的 10X PCR buffer (含有1.5 mM MgCl2)、最後補滅菌 水至 50 μl。
(五)、PCR 反應進行的溫度及時間
反應是在 95℃ 10 分鐘，循環一次，95℃ 1 分鐘 ，55℃ 1 分鐘，72 ℃ 1-2 分鐘 (視 目標序列片段大小而定) 循環35次，最後以 72℃ 作用 10 分鐘，使延長 (extension) 作用 完全。
(六)、瓊脂糖膠體電泳分析
以 1％ 的瓊脂糖膠體 (1 g 的瓊脂糖膠體粉末+99 ml TAE buffer) 以微波加熱至完全 溶解後，待其降到 55℃ 左右後倒於鑄膠台，插入齒梳，待其凝固後，將鑄好之膠平放於 電泳槽中，將欲分析之 DNA 產物與 DNA loading dye 以 1:5 的比例混和均勻後，注入膠 體中靜置 2 分鐘後，設定 100 伏特 35 分鐘進行電泳，電泳完成的瓊脂糖膠體以 50 μg/ml 的 ethidium bromide 溶液浸染 10 分鐘後，再以清水進行退染，在紫外線照射儀照射下觀 察確認目標物之分子量大小。
(七)、PCR 產物純化 (VIOGENE PCR-MTM clean up kit)
將 PCR 產物加入 0.5 ml PX buffer 混勻後，將混勻之溶液取至 column 中已放置於 2 ml 離心管離心 10,000 × g 1 分鐘去除過濾液，加入 0.5 ml WF buffer 至 column 中離心 10,000 × g 1 分鐘去除過濾液，再加入 0.7 ml WS buffer (已加入100％酒精) 至 column 中 離心 10,000 × g 1 分鐘去除過濾液，再將 column 離心 10,000 × g 3 分鐘，去除殘留酒精，
接著將 column 置於新的 1.5 ml 離心管中，加入 50 μl的滅菌水至 column 的膜中心靜置 2 分鐘後，離心 10,000 × g 2 分鐘後所得即為純化之產物。
(八)、DNA產物純化 (VIOGENE Gel-MTM Kit)
將欲純化之特定 DNA 在紫外光分析儀的照射下從膠體上取出放置於 1.5 ml 離心管
中，加入 0.5 ml GEX buffer 在亁浴槽中 60℃ 下作用 20 分鐘，每 2 分鐘 invert 一次，
當膠體完全溶解後待其降至室溫後，每次以不超過 0.7 ml 的量抽取至 column 中已放置於 2 ml 離心管離心 10,000 × g 1 分鐘去除過濾液 (如有超過 0.7 ml 逐次加入離心)，加入 0.5 ml WF buffer 至 column 中離心 10,000 × g 1 分鐘去除過濾液，再加入 0.7 ml WS buffer (已加入 100％ 酒精) 至 column 中離心 10,000 × g 1 分鐘去除過濾液，再將 column 離心 10000 × g 3 分鐘，去除殘留酒精，接著將 column 置於新的 1.5 ml 離心管 中，加入 50 μl 的滅菌水至 column 的膜中心靜置 2 分鐘後，離心 10,000 × g 2 分鐘後所 得即為純化之產物。
(九)、載體和 PCR 產物限制酶酵素的剪切
限制酶酵素單位為 20 U/μl 或 10 U/μl (視欲作用的量決定酵素的量)，定量加入欲剪切 之載體或PCR 產物再加入 10X buffer 和水調整總體積後置於培養箱中於 37℃ 下作用 10 小時 (6-16小時)。
(十) 、接合作用 (Ligation )
T4 DNA ligase 單位為 1 U/μl (視欲作用的量決定酵素的量) 加入欲接合之載體和 PCR 產物 (載體與 PCR 產物之量為 1:10) 再加入 10X ligation buffer 和水調整總體積後 置於冰箱中 4℃ 下作用 18 小時。
二、基因選殖
(一)、大腸桿菌勝任細胞之製備
首先將 E. coli XL-10 Gold 之單一菌落接種於含有 Tetracycline (30 μg/ml) 的3 ml LB 培養液 (tryptone 10 g、yeast extract 5 g、NaCl 10 g 再補水至1 L) 中於 37℃ 下培養 12-16 小時，接著將已培養 12-16 小時之 3 ml XL-10 Gold 菌液加至含有 Tetracycline (30 μg/ml) 的 50 ml LB 培養液中置於培養箱以 37℃ 培養，待 OD600 nm 至 0.4 時以離心管收集後 離心 2,150 × g 10 分鐘 4℃ 後去上清液，將離心管置於冰上以 10 ml 100 mM CaCl2 4℃
懸浮菌體 5 分鐘後，將離心管置於冰上 30 分鐘，接著再次離心 2,150 × g 10 分鐘 4℃ 後 去上清液後將離心管置於冰上再以 2.5 ml 100 mM CaCl2 4℃ 懸浮菌體 5 分鐘後，加入
15％ 甘油後重新懸浮，各取 150 μl 的菌液分裝於離心管中，保存於 -80 ℃ 中備用。
(五)、質體抽取 (VIOGENE Mini-MTM Plasmid DNA Extraction Kit)
取 1 ml已培養 12-14 小時之菌液至 1.5 ml 離心管中，離心 10,000 × g 1分鐘去上清 液，加入 250 μl 的MX1 Buffer (加入 RNase 後置於 4℃ 下存放) 重新懸浮至菌體散盡，
再加入 250 μl 的 MX2 Buffer 上下倒置離心管 4-6 次至透明狀後，靜置 5 分鐘，再加入 350 μl 的 MX3 Buffer上下倒置離心管數次後，離心 10,000 × g 10 分鐘後取上清液，將上
清液取至 column 中已放置於 2 ml 離心管離心 10,000 × g 1 分鐘去除過濾液，加入 0.5 ml WF buffer 至 column 中離心 10,000 × g 1 分鐘去除過濾液，再加入 0.7 ml WS buffer (已加入 100％ 酒精) 至 column 中離心 10,000 × g 1 分鐘去除過濾液，再將 column 離 心 10,000 × g 3分鐘，去除殘留酒精，接著將 column 置於新的 1.5 ml 離心管中，加入 50 μl的滅菌水至 column 的膜中心靜置 2 分鐘後，離心 10,000 × g 2 分鐘後所得即為純化之 產物。
三、基因表現與功能分析 (一)、GB3 細胞株繼代培養
GB3 細胞株是本實驗室由石斑魚的腦細胞初代分離而來 (Lai,2 000)，將 GB3 細胞株 培養在 75T 培養瓶當中，以含 10％ Fetal Bovine Serum，100 units/ml，100 μg/ml penicillin-streptomycin 於 Leibovitz’s L-15 之培養液培養於 28°C。
當細胞長滿時，吸除培養瓶中原有之培養液，並以滅菌過之 PBS 清洗 1 次後，加入 1 ml 0.25% 胰蛋白酶 (Trypsin) 溶液作用。待細胞完全懸浮後，加入適量含血清之培養液 中止胰蛋白酶活性，並將細胞沖散。留下 1/3 細胞液於原培養瓶內並補足 Leibovitz’s L-15 培養液。
(二)、細胞的轉染作用 (transfection)
將1 × 105 個 GB3 細胞培養於24 孔細胞培養盤，28℃ 培養 20 小時。配製 mix 1 solution：4 μg 的 plasmid DNA 加入 250 μl 不含 FBS 的 Leibovitz’s L-15 培養液混合均 勻。配製 mix 2 solution：10 μl的LipofectamineTM 2000 reagent 加入 250 μl 不含 FBS 的 Leibovitz’s L-15 培養液，室溫靜置 5 分鐘。將 mix 1 solution 加入 mix 2 solution，室溫 靜置 25 分鐘。將已培養 20 小時的細胞去除培養液，PBS 清洗後，加入 1.5 ml Leibovitz’s L-15 培養液，再加入 500 μl的mix 1 solution 和 mix 2 solution 的混合液，28℃ 培養 5 小 時後，更換含有 FBS 的 Leibovitz’s L-15 培養液。
(三)、Stable clone 的篩選 (screening of stable clone)
已轉染且更換含 FBS 的 Leibovitz’s L-15 培養液之細胞，28 ℃ 培養 24 小時。細胞 分株至 75T 培養瓶，28 ℃ 培養 48 小時。更換含有 1,000 μg/ml geneticin 的 Leibovitz’s L-15 培養液，28℃ 培養。每 2 至 3 天更換含有 1,000 μg/ml geneticin 的 Leibovitz’s L-15 培養液，最後即可得 stable clone。
四、DNA與蛋白質的濃度測定 (一)、DNA濃度測定
將分光光度計設定在 OD260 nm，以 1 ml 滅菌水歸零，再檢測待測物 (5 μl 的 DNA 加至 995 μl的滅菌水均勻混和) 的讀值。DNA 濃度的計算 (雙股 DNA 為 50 μg/ml)為 OD260 nm 讀值乘於 50 再除以 5 即可知每 μl 中所含之 DNA 量。
(二)、蛋白質定量
使用 Bio-Rad Protein Assay (Bradford, M. 1976)，將不同量 BSA 溶於 160 μl 的去離子 水中，配成已知濃度 0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 μg/μl之標準溶液。另將待測純化的病毒液 5 μl 溶於 155 μl 的去離子水中。同時加入 40 μl 的蛋白質染劑 (protein binding dye) 混合均 勻，室溫等待 2 分鐘後，以 OD595 nm 可見光波長測其吸光值，再以內插法推算病毒蛋白 質濃度。
第五章、結果