國立宜蘭大學生物技術研究所 碩士論文 Institute of Biotechnology National Ilan University Master Thesis

全文

(1)

國立宜蘭大學生物技術研究所 碩士論文

Institute of Biotechnology National Ilan University

Master Thesis

擬魚化抗體表現載體的構築

Construction of fishnized antibody expression vector

指導教授:賴裕順 博士 Yu-Shen Lai, Ph. D.

研究生:呂柏毅 Po-Yi Lu

中華民國九十七年七月

(2)
(3)
(4)
(5)

謝誌

宜蘭的碩士生涯是我人生中一個嶄新的體認,這三年間不管是在面對學業的難題、做

人處世的態度和情感的處理上,我學習並獲得了許多同時也成長了不少。雖然這一路走來 始終是跌跌撞撞、不得要領,過程中仍有很多需要改進與加強的地方,但總算是走過這一 遭,在我往後的人生中勢必會成為一段影響未來的重大歷練。

最需要感謝的就是我的指導教授 賴裕順老師,老師在教學上勞心勞力、嘔心瀝血的教 導,使得我在這三年中一點一滴的累積從無到有,都是老師不厭其煩的指正與督促才能完 成,這段期間我想老師看到我的時候,血壓一定常常飆高、心情感到沉重,對於我的不長 進給老師平添了許多煩惱,然而不管是在做人還是做事上老師所教導我的都將成為我受用 不盡的寶藏。在生技所這個大家庭中時常能感受到家長們的溫暖,像是 林佳靜所長、 陳 威戎老師、 郭村勇老師和 可婷師母不時的關懷我的穿著打扮、生活近況與實驗成果,有 了老師們與師母的鼓勵我才有了繼續勇往直前的動力。

在進入實驗室後首先是受到中央研究院細胞與個體生物學研究所,張繼堯老師實驗室 的林志鴻學長不餘遺力的指導讓我在短時間內很快的進入狀況,同時與第一代的閃亮三姐 妹品蓉、瑋依和宸子一起共同努力,來到宜蘭後或多或少也受到泳沖、曉慧、裕森、敏雯 和念祖等學長姐們的幫助,這對於剛踏入碩士生涯的我不至於驚慌失措。

往後的時光中我遭遇了我的同學們,在同學們中我並不是跟大家都很熟絡而且後來發 生的事件也隔閡了大家,但是我想時間會沖淡一切清者自清、濁者自濁並且我相信大家彼 此間的感情還是很深厚的。其中跟我最要好的達煒、羽橙與敦耘都是我又愛又恨的對象,

我們總是一同嘻笑、一同胡鬧當然也有在期中和期末考前一同關在實驗室裡聽分子生物學 特論與蛋白質體學錄音檔的日子,這段時光我永難忘懷。另外還有筱倩和宜玨因為一些很 無謂的誤會和不諒解使得我們漸行漸遠,在多年的以後回想應該都會覺得當時的自己很幼 稚,還有老師的學妹美湘他不但是生技所的學生、同時還要身兼宜蘭高商的化學老師以及 兩個孩子的媽媽三重身份,努力學習的過人意志力實在令人欽佩,而萬年班代的忠晉總是 不辭辛勞的服務大家,與你們相遇使得我的人生繽紛了起來。

(6)

在大家都不怎麼稱呼我為學長的實驗室裡過了一年,接著第二代的閃亮三姐妹登場了 分別是瑾玟、乙書和讌君,雖然名為學妹但是在做實驗的態度與技巧以及自我要求的管理 上她們的的確確有許多值得我學習與效法的地方,特別是瑾玟除了在學業上給予我重大的 協助外,她也教導了我許多看似平凡無奇卻寓意深遠的道理,這些對於我固有的想法有了 重大的轉變。又過了一年,現今實驗室的中流抵柱:建智與雁玲也進了實驗室,這一年多 來不管遭遇什麼挫折與苦難,他們都以自身的信念不斷的朝著目標努力,看著他們漸漸的 成長與茁壯並能獨當一面,對於指導他們不多的我也是與有榮焉。還有最近才剛進實驗室 的雅評、漢偉與回鍋的瑋依,雖然相處的時間不多但我相信他們都是用功向學的好學生。

實驗室中還有許多大學部的學弟妹們前仆後繼、不畏艱難的為實驗室打拼,像是喋喋 不休且慌慌張張又總是少根筋,但是對實驗室付出極多並不求回報的郁慧、做實驗有其獨 到見解與想法的國瑋,和他那個全班第一名常抱怨要超時加班,卻又沒有支薪,跟我一樣 同屬抗體工程部門且常被老師開玩笑的女朋友安騏、還有打扮很中性化但其實心思很細密 而且很重感情的麗安、再來就是常常被我以學長的名義指使來指使去的娃娃音秀蓮與剛進 實驗室個性豪邁的俠女子揚,以及沒事就會把我當成肉靶還會無故對我發脾氣但是我對她 就是沒輒的美鈴,雖然他們常對我沒大沒小、我也常說他們沒有倫理,但我心裡知道他們 是愛我的,有了這些學弟妹的齊心努力下我想分子疫苗實驗室一定會被發揚光大,成為培 育生物科技界人才的重鎮。

最後要特別感謝我最親愛的家人,謝謝爸爸和媽媽不辭勞苦的養育之恩讓我能夠在衣 食無缺的環境下成長,也給了我滿滿的愛讓我懂得如何去分享與包容,同時在這三年間給 予我不斷的支持與鼓勵,每當我遭遇到實驗上的挫折時給了我堅持下去的勇氣,還有我最 敬愛的弟弟除了帶我遊山玩水體驗人生,也教導了我許多教科書上所沒有的知識,在家人 的陪伴與支持下我將努力邁向更美好的人生。

在這三年間一路走來風風雨雨,完成一篇碩士論文好像也不是什麼絕頂偉大的事情,

但是要感謝的人實在太多不管是有或是沒有提到的人,以致於族繁不及備載在此說聲抱 歉,謝謝所有曾經幫助過我的人,我愛你們。

(7)

中文摘要

海水魚神經壞死病毒 (Nervous Necrosis Virus, NNV) 是近年來被認為對海水魚幼苗 危害最嚴重的病毒之一。1990 年,首先在日本鸚鵡魚中發現 NNV,到今天研究學者仍無 法了解 NNV 的感染機制。1994 年台灣南部石斑魚繁殖場首度爆發感染,造成高達 90%

幼苗的死亡。因此了解 NNV 的基本特性及其感染機制,進而發展出一套預防及治療方法

實為當務之急。

免疫基因療法是目前被認為最安全、有效的抗病毒感染的生物技術方法之一,早期的 單株抗體主要為鼠源性單株抗體,容易引起人體內免疫系統的反應。因此在 1984 年利用 基因重組工程,將老鼠單株抗體抗原結合部位結合至人類抗體 Fc 區域,來製造和人類相 似或幾乎一模一樣的擬人化單株抗體,如此不僅可以將毒性與副作用減到最低,同時亦可

藉此 Fc 區域活化人類其他免疫相關細胞,來增強其免疫保護效果。隨著分子生物技術越

來越成熟,鼠源單株抗體、單股抗體或擬人化單株抗體的應用範圍與方法也隨之更廣,特 別是在人類癌症與病原菌感染研究上有非常顯著的效果。有鑑於此我們希望將擬人化單株 抗體的觀念與技術,運用於我國高經濟石斑魚類上,利用基因工程方法將鼠源的抗神經壞 死病毒單株抗體的抗原結合位連結至石斑魚 IgM 的 Fc 區域,來製造擬魚化的抗神經壞 死病毒單株抗體,接著比較分析鼠源單株抗體、單股抗體和擬魚化單株抗體的抗病毒功能 與宿主間免疫反應的關係,最後進一步提出新穎的魚類疾病治療的方法,發展出一套預防 及治療的方法。

本研究結果顯示我們已經成功構築一個擬魚化抗體,抗體基因全長大小為 2.4 kb,包 含 1.4 kb 的鼠源抗原結合區和 1 kb 的石斑魚 IgM 固定區。本計畫目的希望藉此擬魚化 單株抗體技術的建立,來發展預防、治療 NNV 感染與降低病毒複製的方法,並進一步探 討魚類免疫系統的反應調節機制,希望未來能發展出一套簡單、創新、完善、有效的魚類 疾病預防及治療的研究方法。

(8)

Abstract

Nervous necrosis virus (NNV) is one of the most serious fish pathogens, which infects sea water fish fry, causing mortality as high as 90%. The first case of NNV-infection was reported in Japan in 1990, currently there is no effective method to prevent this virus infection. In Taiwan, the first case of NNV infection was reported from grouper fishery in 1994, which caused 90%

mortality of fish fry. Therefore, the purpose of this study is to elucidate the pathogenesis mechanism of NNV and develop an effective method for preventing and control NNV viral infection.

Immune gene therapy is one of the safety and efficient biotechnological methods to prevent virus infection. Earlier, only mouse monoclonal was developed, however, that caused immune system responses in human body. In 1984, humanized antibodies have been developed by combining the antigen binding site of mouse antibody with the Fc portion of human antibody through recombinant DNA technology. These chimeric humanized antibodies have no side effects and eliminate the possible toxicity. Moreover, the immune-related cells would be activated to strengthen the human immune system that ultimately results in significant specific protection against infections. In this study try to apply the idea and technology of humanzied antibody to grouper fish study. Genetic engineering methods we applied to create a fishnized antibody, by combining the antigen binding site of mouse monoclonal antibody and the Fc portion of the fish IgM.

In this study, we success in fishnized antibody construction, the total length is 2.4 kb which combined with the 1.4 kb antigen binding site of mouse monoclonal antibody and 1 kb of the Fc portion of the fish IgM. This plan purpose hopes to draft the setting-up of fishnized antibody technology, to develop a method or vaccine to prevent NNV infection and to study the regulational mechanisms of fish's immune system. Three of mouse hybridoma, fishnized antibody and single-chain Fv antibody. Finally to develop a novel fish disease prevention and therapeutical methods. Finally, we hope to develop a simple, innovative, perfect, and effective prevention approaches for disease prevention and further research.

(9)

目錄

中文摘要...I Abstract... II 目錄...III 圖表目錄... V

第一章、前言...1

一、免疫球蛋白 (immunoglobulin) 的結構與功能... 1

二、免疫球蛋白的基因工程... 3

三、神經壞死病毒與台灣養殖現況... 10

第二章、研究目的...13

第三章、實驗材料與儀器...14

一、實驗材料... 14

二、實驗儀器... 18

第四章、實驗方法...20

一、擬魚化抗體表現載體的構築... 20

二、基因選殖... 23

三、基因表現與功能分析... 25

四、DNA 與蛋白質的濃度測定 ... 26

第五章、結果...27

一、pET 20b-grouper IgM CH2-CH4質體的構築... 27

二、pET 20b-chimeric heavy chain 質體的構築... 27

三、pET 23a-HB56 light chain 質體的構築... 27

四、pSecTaq2A-chimeric heavy chain 質體的構築 ... 28

五、pSecTaq2B-HB56 light chain 質體的構築... 28

(10)

六、pEGFP-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain 質體的構築... 29

七、p-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain-pSecTaq2A chimeric heavy chain 質體的構築 .. 29

第六章、討論...30

一、抗體運用於其他物種的疾病治療... 30

二、抗體運用於魚類的疾病治療... 31

三、外來抗體運用的缺失... 32

四、未來展望... 33

第七章、圖表...34

參考文獻...51

(11)

圖表目錄

圖一、雙鏈抗體與其他次級結構...3

圖二、pET 20b與pET 20b-grouper IgM CH2-CH4 ligation plasmid...34

圖三、以酵素作用pET 20b-grouper IgM CH2-CH4 ligation plasmid...35

圖四、pET 20b-grouper IgM CH2-CH4 plasmid與pET 20b-heavy chain of HB56 Fab- grouper IgM CH2-CH4 ligation plasmid ...36

圖五、以酵素作用pET 20b-heavy chain of HB56 Fab-grouper IgM CH2-CH4 ligation plasmid ...37

圖六、pET 23a與pET 23a-HB56 light chain ligation plasmid ...38

圖七、以酵素作用pET 23a-HB56 light chain ligation plasmid...39

圖八、pSecTaq2A與pSecTaq2A-chimeric heavy chain ligation plasmid-1 ...40

圖九、pSecTaq2A與pSecTaq2A-chimeric heavy chain ligation plasmid-2 ...41

圖十、以酵素作用pSecTaq2A-chimeric heavy chain ligation plasmid...42

圖十一、pSecTaq2B與pSecTaq2B-HB56 light chain ligation plasmid...43

圖十二、以酵素作用pSecTaq2B-HB56 light chain ligation plasmid...44

圖十三、pEGFP-N1 與pEGFP-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain ligation plasmid-1 ...45

圖十四、pEGFP-N1 與pEGFP-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain ligation plasmid-2 ...46

圖十五、以酵素作用pEGFP-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain ligation plasmid ...47

圖十六、pEGFP-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain plasmid與p-N1-pSecTaq2B- HB56 light chain-pSecTaq2A-chimeric heavy chain ligation plasmid ...48

圖十七、以酵素作用p-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain-pSecTaq2A- chimeric heavy chain ligation plasmid ...49

圖十八、擬魚化抗體...50

(12)

第一章、前言 一、免疫球蛋白 (immunoglobulin) 的結構與功能

抗體 (antibody) 是動物用來抵抗外來物質侵略時所合成的蛋白質,又稱為免疫球蛋白 (immunoglobulin)。它們是由漿細胞 (plasma cell) 所分泌,而漿細胞則是由抗體產生細胞 (antibody producing cell,即 B細胞) 所衍生而來。所有的抗體具有共通的結構 (圖一),都 由四個多胜肽鏈 (polypeptide) 所組成的雙元體,包括兩個重鏈 (heavy chain,H chain) 和 兩個輕鏈 (light chain,L chain) 兩者藉由雙硫鍵 (disulfide bond) 與非共價鍵 (non-covalent bond) 鍵結在一起,而兩條重鏈則藉由一至多個雙硫鍵鍵結在一起形成Y字型結構。在比較 多種的抗體基因後,發現重鏈及輕鏈的 N 端胺基酸序列 (N-terminal) 部分,稱為可變區 約有110個胺基酸序列呈現出相當大的變異性,這個高度變異區 (variable region) 簡稱為 VH (heavy chain variable region) 及 VL (light chain variable region),研究發現高度變異區是主 要與抗原結合的區域,尤其是高度變異區中的超變異區 (hypervarible region),又稱之為互 補決定區 (complementarity determining region, CDR),分別是 CDR1、CDR2 和 CDR3,其 中又以 CDR3 的變異性最大,互補決定區是抗體結構中最主要與抗原鍵結的位置。在變異 區後的序列稱之為固定區 (constant region) 簡稱為 CH 及 CL,固定區位於變異區的碳基端 (C-terminal) 序列變化較少。重鏈的固定區分別有五種不同的胺基酸序列 (有γ、α、μ、δ 及 ε,五個 isotype),而這五種不同的重鏈可以構成五種免疫球蛋白,分別是 IgA、IgD、IgE、

IgG 和 IgM,這五種免疫球蛋白在結構與功能上呈現不同的特性。而輕鏈固定區有兩種不 同的胺基酸序列 (有 κ 或 λ,兩個 isotype)。成對的輕、重鏈變異區成為一個能夠與抗原 結合的構形 (antigen-binding site, paratope),並具有辨認單一抗原決定區 (epitope) 的能 力。變異區決定了抗體與抗原鍵結的專一性及親和力,而固定區則決定了抗體在生物體內 的生物活性。

輕鏈或重鏈的變異區長度大致相同,重鏈的固定區 (CH1、CH2和CH3) 長度約為輕鏈的 三倍,其CH1與CH2之間尚有一具彈性結構之樞紐區 (hinge) (Edelman, 1973)。不管是輕鏈或 重鏈其構成皆含有一變異區及一固定區 (VL + CL;VH + CH)。 而重鏈固定區中Fc片段 (CH2 和 CH3)在抗體的抗原決定區接合抗原後,可能經由三種機轉對抗原產生毒殺作用:一、抗

(13)

體依賴型吞噬細胞毒殺作用: 經由 Fc 片段活化具有 Fc 受器的自然殺手細胞或毒殺型 T 細胞,對抗原產生毒殺作用。吞噬細胞上的Fc受器的變異性,會影響受器與抗體 Fc 片段 接合能力 (binding affinity) 的強弱程度不一,而影響抗體的療效,甚至會造成抗藥性。二、

補體依賴型細胞毒殺作用:Fc 片段活化補體形成膜攻擊複合體 (membrane attack complex) 造成抗原的崩解。

許多的研究指出只需抗體的變異區即可辨識抗原,有學者藉由比較 125I-labeled 的單鏈 Fv 抗體、Fab'、F(ab')2 和 IgG (皆由抗 TAG-72 ﹝human pancarcinoma antigen﹞ 的單株抗 體CC49所選殖) 與 TAG-72 鍵結的親和力去分析,證實只保留重鏈及輕鏈變異區的單鏈 Fv 抗體具有鍵結 TAG-72 的能力,並有很高的親和力 (Colcher, 1990; Yokota, 1992)。因 此科學家將抗體修飾,去除固定區,只保留重鏈及輕鏈的變異區部份,這種形式的抗體,

稱為Fv。Fv是所有具有與抗原結合能力的抗體形式中,最小的抗體結構,重鏈與輕鏈的變 異區彼此間以非共價鍵鍵結在一起。

抗 體 的 結 構 可 由 木 瓜 蛋 白 酵 素 (papain) 切 割 得 到 與 抗 原 結 合 的 頭 部 Fab 片 段 (fragment of antigen binding) 主要包含完整的輕鏈 (VL +CL) 及一部分的重鏈 (VH +CH1),有 學者利用 phage surface display expression system 選殖出抗 B 型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg) 的 Fab 抗體,而此 Fab 抗體對於 B 型肝炎病毒表面抗原具有很高的親和力與 中和能力,也被更進一步利用去設計 disulfide-stabilized Fv fragment(Jia, 2008)。證實 Fab 在基本的研究和細胞外的分析診斷上,也有非常好的效果。

(14)

圖一、雙鏈抗體與其他次級結構。

二、免疫球蛋白的基因工程 (一)、多株抗體

抗體對抗原擁有專一性的親和力,以往大多利用多株抗體血清 (polyclonal antibody) 來 進行臨床的診斷或治療,但由於專一性不盡理想,並可能與其它抗原產生交叉反應 (cross reaction) 而產生偽陽性 (false positive) 的結果,且每次免疫後取得之抗體會有其個體上的 差異,因此無法保證每一批血清所含之多株抗體皆有相同效價,造成診斷疾病和追蹤治療 效果的困擾。

腎小球足細胞間裂孔膜核心蛋白 (Nephrin) 對於維持足突細胞 (podocyte foot) 形成正 常結構,為不可或缺的腎小球過濾屏障 (glomerular filtration barrier)。學者為分析蛋白尿和

(15)

腎變病徵候群 (nephrotic syndrome),生產了抗人類 Nephrin 的多株抗體,以研究疾病中 Nephrin 是否有異常的現象,作為發展基因免疫 (genetic immunization) 的新技術。首先是 將構築有人類腎小球足細胞間裂孔膜核心蛋白全長 cDNA 或是 cDNA 片段的載體,利用 基因槍轉殖進 female Lewis rats。進而產生了抗不同的腎小球足細胞間裂孔膜核心蛋白片段 抗體。之後從血清中得到五個抗體,其中有四個是由五種不同 cDNA Ig-like motif fragment 所表現。這四者之中只有兩個,是由人類腎小球足細胞間裂孔膜核心蛋白全長的 cDNA 所 表現,同時只有這兩個才具有與人類腎小球足細胞間裂孔膜核心蛋白鍵結的能力,實驗的 結果證實這些抗體都是以不同的抗原決定區與抗原鍵結,利用酵素免疫分析法得知各個抗 體對於 Ig-like motif fragment 中不同的 motif,鍵結與中和能力都有很大的差異 (Aoyama, 2006)。

因此多株抗體一致性的不足造成疾病治療上不穩定的因素,並且多株抗體都具有共同 或相似的抗原決定區,所以會與相似的抗原產生反應而有偽陽性的現象發生造成診斷的困 難。

(二)、單株抗體

單株抗體 (monoclonal antibody) 的發展具備了高專一性 (high specificity)、高親合力 (high affinity) 的特性。應用單株抗體的好處在於它有很高的專一性,只會和單一的抗原決 定區結合,所以不致錯誤地連接在其他的位置上;另外它也有很高的敏感性 (sensitivity),

可藉由調控單株抗體的性質和濃度製造出高敏感度的測量工具。

單株抗體的製備不能從多株抗體中分離純化得到,所以必須分離出單一 B 細胞株才可 生產單株抗體。為了使 B 細胞株能在體外人工培養下長期存活並分泌完全相同的抗體,有 學者於 1975 年發展出融合瘤 (hybridoma) 的技術。融合瘤技術雖然可以製造各種單株抗 體並廣泛應用於基礎科學研究、生物醫學檢驗和癌症疾病的治療上。但是融合瘤技術也有 其發展上的限制,其缺點主要為下列幾點:一、由動物的免疫注射開始到細胞株的建立過 程太耗費時間。二、細胞的組織培養太昂貴且不穩定,需要花費很長一段時間,而且細胞 往往在培養數代之後就會出現不再分泌抗體甚至死亡的現象。三、在動物細胞系統中改良 單株抗體的效能不容易而且篩選總量太小。四、動物權意識升高,例如要利用小鼠腹水來 生產抗體的方法則不適合再使用。五、融合瘤的技術大多是利用小鼠來製造抗體,將這種

(16)

由小鼠所製造的抗體應用於人類,在 50~80% 的人體中會產生人類抗小鼠抗體反應 (HAMA),往往在尚未發生臨床效能前就已中和小鼠的單株抗體。同時 HAMA 反應也會 妨礙再用藥,因為第一次使用引發免疫系統確認小鼠單株抗體為外來物質,所以產生更快 更 有 效 率 的 第 二 次 免 疫 反 應 , 使 得 第 二 次 使 用 時 效 用 更 短 甚 至 導 致 過 敏 性 休 克 (anaphylactic shock) 的發生或更嚴重的情況而導致死亡。同時小鼠單株抗體在血液中的半 衰期過短不超過 20 小時,往往在未達到治療所需的劑量就已被代謝,此外小鼠單株抗體 的 Fc片段並不能與人類免疫細胞 Fc 受器結合,無法進一步有效的活化免疫反應,並有學 者研究以鼠源單株抗體 T101 多次施打於 cutaneous T cell lymphoma (CTCL) 或 chronic lymphocytic leukemia (CLL) 的病人身上,發現有 human anti-mouse immunoglobulin (mIgG) 的抗體反應發生,證實經施打鼠源單株抗體的人體中確實會有排斥反應的發生 (Sears, 1984;

Reynolds, 1989; Shawler, 1985; Jaffers, 1986)。

由於單株抗體能對於標的的惡性細胞作用,就像是能殺死特定細胞的藥劑,所以單株 抗體被稱為魔術子彈 (magic bullets) (Chester, 1995; Meredith, 1997)。現今,部分的單株抗 體 在 臨 床 試 驗 上 可 同 時 做 為 診 斷 和 治 療 用 , 像 是 利 用 帶 有 131I 的 癌 胚 抗 原 (anticarcinoembryonic antigen)單株抗體去做放射性的免疫治療,還有近幾年治療 B-cell lymphomas 復 發 的 新 治 療 方 式 , 是 利 用 放 射 性 同 位 素 標 的 的 anti-CD20 抗 體 去 作 治 療 (Murray, 1994; Juweid, 1999; Press, 1999; Akabani, 2000)。臨床上所使用的抗體是由小鼠而 來,並利用融合瘤細胞所製備。這些抗體被證明具有抗腫瘤的活性,在動物模式和人體治 療的臨床應用上作為攻擊的角色。然而問題在於鼠源單株抗體對於人體的免疫刺激性為一 個主要的障礙,所以在臨床使用上是有限制的,像是對癌症的放射性免疫治療上,單株抗 體的限制在於因為它會長久的在體內循環因而顯現出副作用,因此對於正常組織產生明顯 的傷害;針對腫瘤組織的作用卻是少數且有限的,同時 HAMA 反應也連帶發生(Waldmann, 1991; Colcher, 1999)。再者,單株抗體無法有效的從脈管系統擴散進入腫瘤 (Jain, 1987)。

特別是在癌症的治療上,過高的劑量和重複的施用會造成顯著的影響。同時也證實了經第 一次注射鼠源單株抗體之後,在大約 50% 的患者上偵測到人類抗小鼠抗體的反應,而超 過 90% 的患者在施打第二或三次的重複注射後,同樣會有人類抗小鼠抗體的反應發生,

並有學者以鼠源單株抗體 OKT3 治療急性移植排斥反應的病人 10 至 20天後,以免疫酵

(17)

素分析法偵測發現在病人身上有 IgM anti-OKT3 和 IgG anti-OKT3 的抗體產生 (Sears, 1984; Reynolds, 1989; Shawler, 1985; Jaffers, 1986)。

此外,鼠源單株抗體在人體中治療效果是不佳的,因為在血液中的半衰期短再加上無 法活化人體的免疫反應,像是補體和毒殺型 T 細胞所調控的免疫作用。因此,如何使鼠源 的抗體轉變成在生理和功能上更像人類的抗體,使其成為能夠在臨床上使用是令人感興趣 的。

(三)、Fab抗體

Fab 抗體的製備除了可經由木瓜蛋白酵素 (papain) 切割抗體得到,另外也可藉由基因 工程針對 Fab 抗體中重鏈與輕鏈的序列設計專一性的引子 (primer) 利用聚合酶鏈連鎖反 應 (polymerase chain reaction) 獲得。

Fab 抗體是保留了鼠源單株抗體的 Fab 片段並去除 Fc 片段,利用這個特性 Fab 抗 體可以專一性的跟抗原結合,分子量較小容易表現而且免疫刺激性較低。因此有學者利用 選殖鼠源單株抗體 (mAbB23) 的基因片段,分別去構築含有鼠源單株抗體重鏈和輕鏈 cDNA的質體,再利用原核系統去表現,進一步經純化透析並復性後,形成一個能專一性辨 認與鍵結人類 plasma apo B-100的Fab′抗體 (Kwak, 1996)。為了更進一步降低鼠源 Fab 抗 體對於活體的免疫刺激性,同時有了 cFab (chimeric Fab) 抗體的產生,cFab 抗體大約 50 ka 只有全長 IgG 的三分之一,它保留了鼠源重鏈與輕鏈可變區,並接合人類的重鏈與輕 鏈恒定區 (CH1和CL) 有效減少鼠源的序列,降低排斥性。因為 cFab 抗體具有高度的穿透 力、較佳的藥物動力與抗原鍵結的活性,因此被非常廣泛的使用,有學者選殖了 SZ-63 (murine antifibrin monoclonal antibody) 的重鏈與輕鏈可變區基因,利用大腸桿菌成功的表 現 chimeric SZ-63 murine/human Fab fragment,並以西方點墨法和酵素免疫分析法證實 chimeric SZ-63 murine/human Fab fragment 與鼠源單株抗體 SZ-63 相同都具有鍵結 fibrin 的能力 (Quinn, 2003; Lai, 2000; Xia, 1996)。與完整的抗體相較,cFab 抗體不具有 Fc 片段 所以無法進行專一性的鍵結因此降解的很快。除此之外,cFab 抗體並不能誘發抗體倚賴型 的細胞毒殺作用 (antibody-dependent cellular cytotoxicity) 和補體依賴型的細胞毒殺作用,

所以大多被用來作為攜帶並釋放藥物的目的 (Better, 1993) 。

(18)

(四)、單鏈 Fv抗體 (single- chain variable fragments, ScFv)

單鏈 Fv 抗體的可變區片段 Fv 是由包含重鏈和輕鏈的可變區胜肽鏈所構成,然而由 於 Fv 在低濃度及一些生理狀況下會處於分離的狀態(dissociation) (Riechmann, 1988;

Glockshuber, 1990),因此為了穩定Fv的結構,科學家提出了幾個策略:包括改變重鏈及輕 鏈變異區的部分胺基酸為半胱胺酸 (cysteines),使其可形成分子內的雙硫鍵,穩定結合 (Glockshuber, 1990),並可藉由具有彈性的十五到二十個胺基酸作為連接子所連接,通常是 (Gly4Ser)3 (Huston, 1988),形成單鏈 Fv 抗體 (圖一) 來達到穩定結構的目的 (Bird, 1988;

Huston, 1988)。而以單鏈抗體來表現有幾個優點:一、分子量小;二、保有對抗原之專一 性及親合力;三、對組合 (assemble) 及摺疊的要求度低 (Tavladoraki, 1993;Benvenuto, 1995),四、能以原核系統大量表現因此成本較低。

利 用 單 鏈 Fv 抗 體 去 抑 制 第 一 型 人 類 免 疫 不 全 症 病 毒 的 的 複 製 (Marasco,1997;

Rondon, 1997),像是針對調節蛋白 Rev,在 1994 至 1997 年有學者利用選殖抗 Rev 的 融合瘤細胞來構築單鏈 Fv 抗體,這些單鏈 Fv 抗體能與 Rev 上關鍵的抗原決定區結 合,有效的降低 Rev 的活性,進而達到抑制第一型人類免疫不全症病毒的的複製 (Duan, 1995; Duan, 1994; Duan, 1994; Ho, 1998; Inouye,1997; Junker, 1998; Wu, 1996)。第一型人類 免疫不全症病毒的基質蛋白 p17 與膜的相關性對於病毒的摺疊與釋放是必要的,在1988 年有學者針對抗第一型人類免疫不全症病毒的 p17 融合瘤細胞,將融合瘤細胞的 cDNA 選殖定序後,再利用 cDNA 設計並構築一個單鏈 Fv 抗體,將此單鏈Fv抗體轉染進T細胞 中,並利用第一型人類免疫不全症病毒感染 T 細胞,發現 T 細胞內病毒的複製確實被抑 制 (Tewari, 1998)。或是對於外鞘蛋白質中許多的抗原決定位去作用,有學者在1993 至 1998 年間利用能辨認與鍵結第一型人類免疫不全症病毒外鞘蛋白的 CD4 人類單株抗 體,設計一個單鏈 Fv 抗體並在真核細胞中表現,此單鏈Fv抗體能與第一型人類免疫不全 症病毒外鞘蛋白與細胞鍵結,同時並抑制外鞘蛋白前驅物的合成,同樣有效的抑制第一型 人類免疫不全症病毒複製 (Chen, 1996; Chen, 1994; Chen, 1994; Marasco, 1993; Zhou, 1998)。

單鏈 Fv 抗體與完整的抗體相較保留了鍵結的專一性和親和力,而小分子的尺寸賦予 了單鏈 Fv 抗體較佳的侵入腫瘤能力,並降低人類抗小鼠抗體反應的發生。因此在抗體工 程上單鏈 Fv 抗體的策略成為最普遍的使用方法之ㄧ,所以單鏈 Fv 抗體不論在研究,治

(19)

療和診斷上的應用範圍都很廣。

(五)、雙特異性抗體 (Bi-specific antibodies)

雙特異性抗體是一種以抗體重組的方式將與不同抗原鍵結的 Fab 或單鏈 Fv 抗體結 合在同一個抗體上,使其具有同時專一性的與兩種以上不同抗原鍵結的抗體形式。雙特異 性抗體的好處在於分子量小所以排斥反應較少、同時滲透進入腫瘤的效果較佳。此外有學 者利用其他分子與單鏈Fv抗體融合發展出新功能的生物感測器去偵測目標分子,或是藉由 連接不同的單鏈Fv抗體分子形成雙特異性抗體。

在 2001 年有學者設計一個雙特異性抗體是具有 cross-link 的功能,除了能對結腸癌 專一的作用外,另一方面還能與血液中的免疫球蛋白鍵結,並進一步誘發補體、單核球 respiratory burst、吞噬作用等免疫反應的活化,以加強殺死結腸癌的能力 (Kortt, 2001)。另 外有學者設計一個 bispecific scFv dimer (bisFv) 以非共價鍵結 anti-neuraminidase 抗體 (NC10) 的 VH 和 anti-glycophorin 抗體 (1C3) 的 VL ,實驗的結果顯示 bisFv 抗體具有 與兩個目標抗原鍵結的能力,並能作為血球凝集試驗的藥劑 (Atwell, 1996)。因此在抗體工 程上雙特異性抗體的運用成為一個新興的方向。

(六)、嵌合型抗體 (chimeric antibody)

一般來說抗體重組的策略運用像是嵌合化和擬人化,鼠源抗體所造成的免疫刺激性影 響可藉由移植高度變異區,像是互補決定區來降低,並融合人類Fc片段進行抗體的重組進 程稱之為擬人化 (Jones, 1986; Winter, 1993)。

利用較小幅度的重組 (Newman, 1992) 和去免疫化技術 (Carr, 1998; Lynn, 2004) 修飾 單株抗體,嵌合型抗體就是保留鼠源 Fab,使其保有與抗原鍵結的專一性和親和力的特性,

並結合人類抗體的 Fc 片段降低免疫刺激性、增長其於人體中的半衰期和誘發其他的免疫 反應,在臨床的使用上為不可或缺的。

嵌合型抗體的出現是由於單鏈 Fv 抗體的運用,讓學者們想更進一步保留單鏈 Fv 抗 體的優點發展出能有效針對抗原作用外,還能降低抗體在活體內的的排斥和過敏性,並且 活化體內免疫系統以達到確實消滅外來病原的抗體。而 Fc 片段能影響抗體的其他功能還 有其在血液中的穩定性 (Covell, 1986; King, 1994; Kaku, 1996),並且 Fc 片段在抗體接合抗

(20)

原後,可經由不同機轉對抗原產生毒殺作用,像是抗體依賴型吞噬細胞毒殺作用、補體依 賴型細胞毒殺作用等等。

學者利用透過構築一個嵌合型抗體去專一性的與 TfR (Transferrin receptor) 作用,此抗 體保留了與 TfR 鍵結的能力並對活體的免疫刺激性大大的降低,更重要的是,此抗體藉由 人類的 Fc 片段有效活化抗體依賴型吞噬細胞毒殺作用和補體依賴型細胞毒殺作用來加強 抗腫瘤的能力 (Qing, 2005)。

並有學者利用鼠源 phosphocholine 抗體,構築一個嵌合型的重鏈質體 (鼠源重鏈可變 區序列﹝VH﹞接合人類 IgG1 或 IgG2 重鏈恆定區),和嵌合型的輕鏈質體 (鼠源輕鏈可變 區序列﹝Vκ﹞接合人類 κ 輕鏈恆定區),同時轉染進小鼠骨髓癌細胞株作表現。同時在骨 髓癌細胞株中一個完整的四聚體嵌合型抗體 (H2L2) 就產生了 (Sherie, 1984) ,此嵌合型抗 體並能有效的與 phosphocholine 鍵結。

嵌合型抗體的構築是簡易的,融合了鼠源單株抗體的重鏈和輕鏈可變區與人類抗體的 恒定區結合。而嵌合型抗體中大約百分之七十是人類抗體原有的,但是嵌合型抗體中鼠源 抗體的部份過多,因此還是會對人體造成人類抗嫁接抗體反應的發生 (human anti-chimeric antibody reaction, HACA),排斥與過敏的現象也無法完全消除。

(七)、擬人化抗體 (humanized antibody)

擬人化抗體,是將鼠源單株抗體的重鏈和輕鏈可變區做更進一步的設計,所以只保留 了互補決定區,大約只有 25% 的鼠源序列移植進人類可變區域讀碼框,因此對於活體的 免疫刺激性可以有效降低而排斥與過敏的現象也較少,同時保留了與抗原鍵結的專一性和 親和力,也能增長其於人體中的半衰期和誘發免疫系統的活化。

在 2004 年學者設計一個抗登革熱病毒的擬人化的 IgG1 1A5 抗體,與原 Fab 1A5 相 較,它同樣能有效中和第一和第二型的登革熱病毒,但對於第三和第四型的登革熱病毒中 和能力較弱,相對於其他黃熱科的病毒中和能力也與 Fab 1A5 有相似的結果(Goncalvez, 2004)。因此擬人化的 IgG1 1A5 抗體對於進一步發展預防登革熱病毒,為一個重要的指標。

有學者設計並構築兩個鼠源單株抗體 N901 (anti-CD56) 和 anti-B4 (anti-CD19) 將其 擬人化,將鼠源可變區基因嫁接進人類抗體的恒定區中,表現此擬人化抗體的蛋白質產物,

(21)

經純化後檢測其鍵結能力。發現嫁接鼠源可變區基因的 N901 和 anti-B4 擬人化抗體對於 其細胞表面的配體有很高的親和力,是由鼠源抗體所提供。這些資料也證明,儘管嫁接鼠 源的 Fv 於人類的抗體序列中,擬人化抗體同樣可以維持與抗原鍵結的能力 (Roguska, 1994)。

目前已有數個擬人化抗體被成功的應用在臨床的試驗,或是已經被 FDA 認可接受,

像 是 anti-Her2/neu 抗 體 (Trastuzumab/Herceptin) 或 anti-CD33 抗 體 (Gemtuzumab/Mylotarg) (Glennie, 2003),因此擬人化抗體被證實的確能有效的應用於現代醫 學的診斷與治療,將把抗體基因工程帶入一個全新的紀元。

三、神經壞死病毒與台灣養殖現況 (一)、研究背景

近年來水產養殖逐漸受到重視並迅速的發展。但由於傳統漁撈和海洋污染的影響,自 從 1992 年後導致捕獲量連年降低,同時捕撈漁業的魚撈量預計已達極限,因此由水產養 殖漁業來彌補漁業產品供貨量的短缺才能應付市場對漁業產品之需求,所以水產養殖漁業 是具有全球性經濟高度發展潛力的產業。伴隨著海水養殖漁業的快速興起連帶的高密度養 殖也導致了一些疾病的出現和蔓延,而這類病害的產生已嚴重危害海水養殖漁業的發展,

但是台灣貴為世界三大水產養殖國之一,目前台灣的養殖技術非常先進特別是在魚苗的孵 化,在整個東南亞更是居於領導者的地位,並且是魚苗及幼魚的重要輸出國,所以當疾病 蔓延或爆發時受到的影響也較大,另外因為魚苗容易受到病毒的感染一旦疫情爆發就會造 成魚苗在短時間內的大量死亡,進而造成經濟上的嚴重損失,因此如何防治疫情的發生就 顯得非常的重要。

(二)、石斑魚簡介

石斑魚 (Epinephelus spp.),本省俗稱有"過魚"、"格也魚"、"鱸貓" 等,在分類上屬於 硬骨魚綱鱸形目 (Percifo0rmes)、鮨科 (Serranidae)、石斑魚屬 (Epinephelus) 魚類的統稱。

石斑魚為肉食性之暖水魚類主要分佈於熱帶及亞熱帶海域,種類繁多全世界大約有 400 種,大多棲息於近岸岩礁分布的海域。台灣目前所發現的記錄為 3 亞科 29 屬 110 種 (臺

(22)

灣魚類資科庫,2002),此魚由於肉質細嫩鮮美,長久以來就被視為桌上佳餚,過去無法以 先進的科學技術增加漁獲量。並由於市場價值高,因此目前許多東南亞的國家如新加坡、

印尼、馬來西亞、菲律賓等等,也都盛行養殖石斑魚,現今並成為台灣與東南亞國家最主 要的經濟養殖魚類。石斑魚苗的養殖以往皆須由捕撈取得再養殖成大魚出售。多年以來在 台灣養殖業者不斷嘗試及研究改良之下,台灣自1982年首度有人以荷爾蒙注射的方式,成 功繁殖馬拉巴 (Epinephelus malabaricus) 石斑魚,自此開啟台灣石斑魚的完全養殖時代。

目前在世界上不管是在飼養管理或是種苗生產上,台灣都居於領先的地位,而台灣最大的 養殖產地為南部的嘉、南及高屏沿海。目前台灣約有十餘種石斑魚可供人工養殖,以馬拉 巴石斑、點帶石斑 (E. coioides)、鞍帶石斑 (E.lanceolatus)、及棕點石斑 (E. fuscoguttatus) 等已具備完整發展之繁殖及飼養技術的魚種,為主要種苗繁養殖大宗。但是近年來,可以 發現在石斑魚在從卵孵化到吋苗的期間內,小魚經常會有不正常如迴旋般的泳動情況,稱 為 飛 旋 症 (Spiralic disease) , 然 而 造 成 此 種 病 徵 之 疾 病 的 死 亡 率 極 高 有 時 甚 至 高 達 90~100%,所以造成養殖漁業者的重大經濟損失。目前已知,造成此一疾病的原因是由於 魚類受到神經壞死病毒 (Nervous Necrosis Virus, NNV) 的感染之後,所誘發的魚體不正常 泳動及大量死亡的現象 (Chi, 1997)。

(三)、神經壞死症病毒 (NNV) 的特性

神 經 壞 死 症 病 毒(Nervous Necrosis Virus, NNV) 在 分 類 上 是 屬 於 野 田 病 毒 科 (Nodaviridae),野田病毒屬 (fish nodavirus 或稱 betanodavirus) (Mori., 1992; Nishizawa, 1995)。

神經壞死病毒的病毒顆粒大小在25~30微米左右 (Glazebrook, 1990),無封套膜、二十 面體 (Yoshikoshi, 1990),屬於核糖核酸病毒,具有兩條單股的正股 RNA 分別為 RNA1 與 RNA2 (Mori, 1992),RNA1 所產生的蛋白質為 RNA 聚合酶 (RNA polymerase);而 RNA2 所產生的蛋白質為鞘蛋白 (coat protein) 主要是組成病毒外殼,進一步比對外鞘蛋白中一段 T4 核酸序列,可分成 STRIPED JACK (SJ) NNV、TIGER PUFFER (TP) NNV、BARFIN FLOUNDER (BF) NNV,以及 REDSPOTTED GROUPER (RG) NNV 四種基因型(Nishizawa, 1997)。以交叉中和反應檢測四種 NNV 基因型之間的血清類源關係,可分成三種血清型:

SJNNV 是一型,TPNNV 是一型,RGNNV 與 BFNNV 則歸在一型。然而 BFNNV 的寄

(23)

主都是冷水魚,RGNNV 的寄主則都是溫水魚。

NNV 對魚類而言是一個重要的病毒性疾病,通常會感染魚苗並且在感染後會造成魚的 神經壞死症(viral nervous necrosis,VNN) (Yoshikoshi, 1990),腦脊髓炎(encephalomyelitis)(B loch, 1991)和液泡的形成、腦病和視網膜病變 (vacuolating encephalopathy and retinopathy, VER) (Munday, 1992; OIE, 2000),而導致魚苗的大量死亡 (Mori, 1992)。截至目前為止,已 知的有11科、超過22種的魚類有受神經壞死病毒感染的紀錄,其中又以石斑魚 (Epinephelus akaara, E. fuscogutatus, E. malabaricus, E. moara, E. septemfasciatus, E. tauvina)、鸚哥魚 (Oplegnathus fasciatus) 和鰺魚 (Pseudocaranx dentex)、鱸魚 (Lates calcarifer, Dicentrarchus labrax)、河豚 (Takifugu rubripes)、比目魚 (Verasper moseri, Hippoglossus hippoglossus, Paralichthys olivaceus, Scophthalmus maximus) 為主 (OIE, 2000),影響甚大。

(四)、神經壞死症病毒傳播途徑

神經壞死病毒會以水平傳染的方式傳播,同時也能以垂直感染的方式傳至下一代 (Arimoto, 1992; Comps, 1996; Yoshimizu, 1997; Grotmol, 2000),進而影響卵的孵育率,而目 前對於病毒性神經壞死症的防治策略僅有以臭氧洗卵 (Arimoto, 1992; Grotmol, 2000) 的方 式來對魚卵進行消毒以降低發病之機率,此一方法雖可以減少魚隻發病,但是一但養殖槽 中有魚苗發病,仍會連帶造成該養殖槽中大多數的魚苗也受到感染並死亡,所以垂直感染 路徑確實存在。目前並無法以投藥的方式去治療魚類之病毒性疾病,因此在對抗病毒性神 經壞死症的研究上主要還是朝免疫的方向進行。

(24)

第二章、研究目的

水產養殖漁業是具有全球性經濟高度發展潛力的產業。伴隨著海水養殖漁業的快速興 起連帶的高密度養殖也導致了一些疾病的出現和蔓延,而這類病害的產生已嚴重危害海水 養殖漁業的發展。台灣為世界三大水產養殖國之一,目前台灣的養殖技術非常先進特別是 在魚苗的孵化,在整個東南亞更是居於領導者的地位,所以當疾病蔓延或爆發時受到的影 響也較大,另外因為魚苗容易受到病毒的感染,一旦疫情爆發就會造成魚苗在短時間內的 大量死亡,進而造成經濟上的嚴重損失,因此如何防治疫情的發生就顯得非常重要。

神經壞死病毒會以水平傳染的方式傳播,同時也能以垂直感染的方式傳至下一代 (Arimoto, 1992; Comps , 1996; Yoshimizu, 1997; Grotmol, 2000),進而影響卵的孵育率。所以 在治療受到神經壞死病毒感染的母魚就顯的十分重要,以防止神經壞死病毒感染至下一 代,造成魚苗的神經壞死 (viral nervous necrosis,VNN) (Yoshikoshi ,1990) 和視網膜病變 (vacuolating encephalopathy and retinopathy, VER) (Munday, 1992; OIE, 2000),而導致魚苗的 大量死亡 (Mori, 1992)。

運用擬人化抗體的概念來構築一個擬魚化抗體,擬魚化抗體為保留抗神經壞死病毒之 鼠源單株抗體的 Fab 片段,使其具有與抗原高度鍵結的能力進而達到中和病毒毒力 (titer) 的效果,並置換石斑魚免疫球蛋白 IgM 的 Fc 片段,以提升魚類免疫免應像是補體的活 化、調理作用或是抗體依賴性細胞毒殺作用,去進一步將病毒消滅,並有效降低在魚體內 的排斥和過敏反應,增加擬魚化抗體在魚體內的半衰期。

(25)

第三章、實驗材料與儀器 一、實驗材料

(一)、原核表現載體

pET-20b (anti-ampicillin)、pET-23a (anti-ampicillin) (二)、真核表現載體

pSecTaq2A (anti-ampicillin) 、pSecTaq2B (anti-ampicillin) 、 pEGFP-N1 (anti-kanamycin) (三)、質體

Grouper IgM heavy chain constant region plasmid、已構築單鏈 Fv 抗體之 plasmid (高雄醫學 大學鄭添祿老師提供)

(四)、菌種

E. coli:XL-10 Gold (anti-tetracycline)

(五)、細胞株

抗神經壞死病毒小鼠單株抗體融合瘤細胞株 (HyBridoma 56)、石斑魚腦細胞細胞株 (Grouper Brain, GB)

(六)、藥品試劑 Agar (Bitek®) Agarose (J.T.Baker) Ampicillin (Sigma)

Ammonium Persulfate (Usb)

BluePhos Phosphatase Substrate System (Kpl) Bromophenol blue (Merck)

Bovine serum albumin (Sigma) Bis-acryamide (J.T.Baker)

(26)

Broad-Range pre-stained protein marker (Yeastern Biotech) Calcium Chloride (J.T.Baker)

Chloroform (Merck)

Coomassie brilliant blue R-250 (Merck) 1,4-Dithiothreitol (Merck)

DNA Ladder 1kb (Geneaid)

Dulbecc’s Phosphate-Buffered Saline (GibcoTM) dNTP (Yeastern Biotech)

EDTA (J.T.Baker) Ethanol (Merck)

Ethidium bromide (Merck) Fetal bonvium serum (GibcoTM) Gel-MTM Kit (Viogene)

Glacial acetic acid (Sigma) Glucose (Sigma)

Glycine (J.T.Baker)

Goat anti-mouse IgG-AP (Cell Signaling)

High-Range Rainbow Molecular Weight Markers (GE®) Isopropanol (Sigma)

Kanamycin (Sigma)

LipofectamineTM 2000 reagent (Invitrogene) Leibovitz’s L-15 medium (Gibco®)

Ligase buffer (10 ×) (Roche、New England BioLabs®) Methanol (Mallinckrode)

(27)

Mini-MTM Plasmid DNA Extraction Kit (Viogene) Mid-Range pre-stained protein marker (Yeastern Biotech) NEB buffer 2 (10 ×) (New England BioLabs®)

NEB buffer 4 (10 ×) (New England BioLabs®) NEB buffer 1 (10 ×) (New England BioLabs®) NBT /BCIP (Roche)

Oligo dT (Invitrogen) Penicillin (GibcoTM )

PCR buffer (10 ×) (Bioman) PCR-MTM Clean up Kit (Viogene) Phenol (Amresco®)

Potassium acetate (Merck)

Penicillin- streptomycin (Gibco®) Protein binding dye (Bio-Rad®)

Restric enzyme (Roche、New England BioLabs®) RT buffer (Invitrogen)

RTase (Invitrogen) RNase A (Sigma)

Sodium hydroxide (J.T.Baker) Sodium chloride (Merck) Sodium dodecyl sulfate (Sigma) Sodium pyruvate (Sigma) Streptomycin (GibcoTM)

T4 DNA ligase (Roche, New England BioLabs®)

(28)

TAE buffer (UniRegion Bio-Tech) Taq DNA polymerase (Bioman) Tetracycline (Sigma)

Tris-base (J.T.Baker) Tris-HCl (J.T.Baker)

Tryptone (Bio Basic)

Tween 20 (J.T.Baker)

Trypsin (GibcoTM)

Tetra-methy-lethytenediamine (Merck)

ULTRASPEC-ll RNA ISOLATION kit (Biotecx Laboratories) Yeast extract (BactoTM)

β-mercaptoethanol (Merck) 脫脂牛奶 (安佳)

(七)、實驗器材

1.5 ml 離心管 (Viogene) 15 ml 離心管 (Falcon®) 50 ml 離心管 (Falcon®) 75 T 培養瓶 (Falcon®) 24 孔細胞培養盤 (Nunc) 免疫酵素分析微量盤 (Nunc) PVDF membrane (BioTraceTM)

(29)

二、實驗儀器

高速冷凍離心機 (KUBOTA 6500) 數位顯示乾浴器 (Basic Life BL3001)

聚合酶鏈鎖反應器 (BIO-RAD MyCyclerTMThermal Cycler) 水平電泳槽 (Major Science Shorter Mini Gel System) 紫外線照射儀 (BioDoc-ItTM System)

微量盤分析儀 (Molecular Devices Corp.SpectraMax M2) 紫外光可見光分光光譜儀 (Thermo HeλIOSβ)

低溫迴轉式震盪培養箱 (裕德LM-575R)

高速微量離心機 (KUBOTA CORPORATUON 3300) 高速微量離心機 (HERMLE Z 233 M2)

電磁加熱攪拌器 (Lab Tech Lotplate Stirrer LMS-1003) 蛋白質電泳槽 (MiNi-PROTEAN3 Cell)

電源供應器 (MAJOR SCIENCE MP-250N POWER SUPPLY ) 震盪器 (Pantech 5100 Spire Mixer )

震盪器 (Labnet VX-100 Vortex Mixer ) 電子天平 (METTLER TOLEDO PB602-S)

鑄模槽 (MAJOR SCIENCE Short Mini Horizontal Gel Electrophoresis System) 全波段長紫外光可見光分光光譜儀 (Thermo Genesys 10)

轉漬槽 (Bio- Rad)

數位迴轉式震盪器 (YIH DER TS-500D) 倒立式顯微鏡 (OLYMPUS CKX41)

(30)

恆溫水浴槽 (FIRSTEK B206) 低速離心機 (TOMY LC-220)

(31)

第四章、實驗方法 一、擬魚化抗體表現載體的構築

(一)、RNA萃取 (Ultraspec-ll RNA isolation kit)

收集 1 × 107 個抗神經壞死病毒之小鼠單株抗體融合瘤細胞 (HyBridoma 56, HB 56) 包含培養液於 15 ml 離心管中,以 180 × g 離心 5 分鐘後去上清液,以 10 ml PBS 再懸 浮細胞,再以 180 × g 離心 5 分鐘後去上清液,同樣再以 1 ml PBS 懸浮細胞將其置換於 1.5 ml 離心管中,再以 180 × g 離心 5 分鐘後去上清液,接著加入 UltraspecTM RNA 1 ml vortex 後,靜置於冰上 5 分鐘,再加入 200 μl 的 chloroform 上下倒置離心管 15 秒後,

再置於冰上5分鐘,接著離心 12,000 × g 15 分鐘 4℃ 後,取上清液至新離心管中,加入 300 μl 的 isopropanol,vortex 30秒後,離心 12,000 × g 1 分鐘 4℃ 後,去上清液後加入 75%

酒精 1 ml vortex 30 秒後,離心 12,000 × g 30 秒 4℃,再次去上清液後加入 75% 酒精 1 ml vortex 30 秒後,離心 12,000 × g 30 秒 4℃,去上清液後,再離心12,000 × g 3 分鐘,

接著將離心管中殘留之酒精去除乾淨後,加入 50 μl的 DEPC-H2O 所得即為小鼠單株抗體 融合瘤細胞 RNA。

(二)、RNA的反轉錄 (Reverse Transcription)

將 RNA 定量至 5 μg,再補 DEPC-H2O 至 18 μl,接著加入 1 μl 的 oligo dT (1 μg/μl) 和 1 μl 的 dNTP (10 mM) 使其總量為 20 μl,vortex,spin down後放置於乾浴槽以 65℃ 作 用 5 分鐘,接著再冰浴 5 分鐘後,同時加入 5 μl的 RT buffer、1 μl 的 RNAin (RNAase inhibitor)、1 μl 的 RTase,vortex,spin down 後放置於乾浴槽以 37℃ 作用 2 小時 (或是 42℃ 作用 1 小時) 所得即為 cDNA。

(三)、引子 (primer) 設計

分別針對抗神經壞死病毒之小鼠單株抗體融合瘤細胞 HB 56 heavy chain 、抗神經壞 死病毒之小鼠單株抗體融合瘤細胞 HB 56 light chain 、石斑魚免疫球蛋白 IgM Fc 片段 (CH2-CH4)、chimeric heavy chain,以接入不同載體的 7 組引子設計如下

HB56 heavy chain to pET 20b-grouper IgM CH2-CH4

plasmid forward primer (Nde I):GGGAAT

(32)

TCCATATGCAGGCCCAACTGCAGCAGCCTGGG

HB56 heavy chain to pET 20b-grouper IgM CH2-CH4 plasmid reverse primer (Hind III) : CCCA AGCTTTGTACATATGCAAGGCTTACA

HB56 light chain to pET 23a forward primer (Nde I) : GGGAATTCCATTGGACATTGTGATG ACCCAGTCTCAG

HB 56 light chain to pET 23a reverse primer (Hind III) :CCCAAGCTTACACTCATTCCTGTT GAAGCTCTT

IgM constant region for CH2-CH4 to pET20b forward primer (Hind III) : CCCAAGCTTATATAT CAGTTGCCAACTCTTAAAGTA

IgM constant region for CH2-CH4 to pET 20b reverse primer (Xho I) : CCGCTCGAGCTGGGCC TTGCACGTTTCAGGGATGTT

chimeric heavy chain to pSecTaq2A forward primer (Asc I) : TTGGCGCGCCAGGCCCAACTG CAGCAGCCTGGG

chimeric heavy chain to pSecTaq2A reverse primer (Xho I) : CCGCTCGAGGCTGGGCCTTGC ACG TTTCAGGGATGTT

HB 56 light chain to pSecTaq2B forward primer (Hind III) : CCCAAGCTTGACATTGTGATG ACCCAGTCT

HB 56 light chain to pSecTaq2B reverse primer (Xho I) : CCGCTCGAGGACACTCA TTCCTGT TGAAGCTCTT

Chimeric heavy chain to p-N1-pSecTaq2B HB 56 light chain plasmid forward primer (Kpn I) : CGGGGTACCCGA TGTACGGGCCAGATATACGCG

Chimeric heavy chain to p-N1-pSecTaq2B HB 56 light chain plasmid reverse primer (Not I) : ATAAGAATGCGGC CGCTTACTGGGCCTTGCACGTTTC

HB 56 light chain to p-EGFP-N1 forward primer (Nhe I) : CTAGCTAGCATGGAGACAGACA CACTCCTGCTA

HB 56 light chain to p-EGFP-N1 reverse primer (EcoR I) : CCGGAATTCCAGCATGCCTGC TATTGTCTTCCC

(33)

(四)、聚合酶連鎖反應 (Polymerase chain reaction, PCR)

每次的聚合酶連鎖反應是在最終體積 50 μl 的反應溶液中進行分別加入 template DNA (0.05 μg)、dNTP (0.2 mM)、forward primer (0.1 μΜ)、reverse primer (0.1 μΜ)、1 μl的 (5 U/μl) Bio Taq DNA polymerase、5 μl 的 10X PCR buffer (含有1.5 mM MgCl2)、最後補滅菌 水至 50 μl。

(五)、PCR 反應進行的溫度及時間

反應是在 95℃ 10 分鐘,循環一次,95℃ 1 分鐘 ,55℃ 1 分鐘,72 ℃ 1-2 分鐘 (視 目標序列片段大小而定) 循環35次,最後以 72℃ 作用 10 分鐘,使延長 (extension) 作用 完全。

(六)、瓊脂糖膠體電泳分析

以 1% 的瓊脂糖膠體 (1 g 的瓊脂糖膠體粉末+99 ml TAE buffer) 以微波加熱至完全 溶解後,待其降到 55℃ 左右後倒於鑄膠台,插入齒梳,待其凝固後,將鑄好之膠平放於 電泳槽中,將欲分析之 DNA 產物與 DNA loading dye 以 1:5 的比例混和均勻後,注入膠 體中靜置 2 分鐘後,設定 100 伏特 35 分鐘進行電泳,電泳完成的瓊脂糖膠體以 50 μg/ml 的 ethidium bromide 溶液浸染 10 分鐘後,再以清水進行退染,在紫外線照射儀照射下觀 察確認目標物之分子量大小。

(七)、PCR 產物純化 (VIOGENE PCR-MTM clean up kit)

將 PCR 產物加入 0.5 ml PX buffer 混勻後,將混勻之溶液取至 column 中已放置於 2 ml 離心管離心 10,000 × g 1 分鐘去除過濾液,加入 0.5 ml WF buffer 至 column 中離心 10,000 × g 1 分鐘去除過濾液,再加入 0.7 ml WS buffer (已加入100%酒精) 至 column 中 離心 10,000 × g 1 分鐘去除過濾液,再將 column 離心 10,000 × g 3 分鐘,去除殘留酒精,

接著將 column 置於新的 1.5 ml 離心管中,加入 50 μl的滅菌水至 column 的膜中心靜置 2 分鐘後,離心 10,000 × g 2 分鐘後所得即為純化之產物。

(八)、DNA產物純化 (VIOGENE Gel-MTM Kit)

將欲純化之特定 DNA 在紫外光分析儀的照射下從膠體上取出放置於 1.5 ml 離心管

(34)

中,加入 0.5 ml GEX buffer 在亁浴槽中 60℃ 下作用 20 分鐘,每 2 分鐘 invert 一次,

當膠體完全溶解後待其降至室溫後,每次以不超過 0.7 ml 的量抽取至 column 中已放置於 2 ml 離心管離心 10,000 × g 1 分鐘去除過濾液 (如有超過 0.7 ml 逐次加入離心),加入 0.5 ml WF buffer 至 column 中離心 10,000 × g 1 分鐘去除過濾液,再加入 0.7 ml WS buffer (已加入 100% 酒精) 至 column 中離心 10,000 × g 1 分鐘去除過濾液,再將 column 離心 10000 × g 3 分鐘,去除殘留酒精,接著將 column 置於新的 1.5 ml 離心管 中,加入 50 μl 的滅菌水至 column 的膜中心靜置 2 分鐘後,離心 10,000 × g 2 分鐘後所 得即為純化之產物。

(九)、載體和 PCR 產物限制酶酵素的剪切

限制酶酵素單位為 20 U/μl 或 10 U/μl (視欲作用的量決定酵素的量),定量加入欲剪切 之載體或PCR 產物再加入 10X buffer 和水調整總體積後置於培養箱中於 37℃ 下作用 10 小時 (6-16小時)。

(十) 、接合作用 (Ligation )

T4 DNA ligase 單位為 1 U/μl (視欲作用的量決定酵素的量) 加入欲接合之載體和 PCR 產物 (載體與 PCR 產物之量為 1:10) 再加入 10X ligation buffer 和水調整總體積後 置於冰箱中 4℃ 下作用 18 小時。

二、基因選殖

(一)、大腸桿菌勝任細胞之製備

首先將 E. coli XL-10 Gold 之單一菌落接種於含有 Tetracycline (30 μg/ml) 的3 ml LB 培養液 (tryptone 10 g、yeast extract 5 g、NaCl 10 g 再補水至1 L) 中於 37℃ 下培養 12-16 小時,接著將已培養 12-16 小時之 3 ml XL-10 Gold 菌液加至含有 Tetracycline (30 μg/ml) 的 50 ml LB 培養液中置於培養箱以 37℃ 培養,待 OD600 nm 至 0.4 時以離心管收集後 離心 2,150 × g 10 分鐘 4℃ 後去上清液,將離心管置於冰上以 10 ml 100 mM CaCl2 4℃

懸浮菌體 5 分鐘後,將離心管置於冰上 30 分鐘,接著再次離心 2,150 × g 10 分鐘 4℃ 後 去上清液後將離心管置於冰上再以 2.5 ml 100 mM CaCl2 4℃ 懸浮菌體 5 分鐘後,加入

(35)

15% 甘油後重新懸浮,各取 150 μl 的菌液分裝於離心管中,保存於 -80 ℃ 中備用。

(二)、轉型作用 (Transformation)

取當日現做 75 μl 的勝任細胞於離心管中,分別加入已經酵素作用之載體 (control)、

接合作用目標序列之質體,輕彈混勻後置於冰上反應 30 分鐘後接著以 42℃ 熱處理 (heat shock) 作用 90 秒後,再置於冰上 3 分鐘,然後再加入 75 μl 不含抗生素的 LB 培養液 混勻後於 37℃ 培養 50 分鐘,實驗組離心 9,100 × g 3 分鐘去掉大部分的上清液,保留 50 μl 的上清液回溶轉型後的菌體將其重新懸浮,最後各取 50 μl 的菌液均勻塗佈於含有載體 所抗之專一性抗生素和 Tetracycline(30 μg/ml) 的LB 培養皿上倒放於 37℃ 培養 16 小 時。

(三)、菌落的篩選 (Screening)

將含有特定特生素培養皿上的菌落以 pippet 挑取單一菌落,每一菌落接種於含有 3 ml LB 培養液中 (含有特定特生素) 置於培養箱中於 37℃ 下培養 12-14 小時。

(四)、質體抽取 (鹼性溶裂法)

取 1 ml 已培養 12-14 小時之菌液至 1.5 ml 離心管中,離心 10,000 × g 1 分鐘去上 清液,加入 100 μl的 solution Ι (50 mM glucose、25 mM Tris-HCl pH 8.0、10 mM EDTA pH 8.0) 重新懸浮至菌體散盡,再加入 200 μl 的 solutionⅡ (0.2 N NaOH、1%SDS) 上下倒置離心 管數次至透明狀後,靜置 5 分鐘,再加入 150 μl 的 solutionⅢ (5 M potassium acetate 60 ml、glacial acetic acid 11.5 ml、H2O 28.5 ml) 後上下倒置離心管數次後離心 10,000 × g 10 分 鐘後取上清液,加入等體積 phenol/chloroform (1:1) 混勻後離心 10,000 × g 5 分鐘取上清 液,再加入 1 ml 95% 酒精混勻後靜置 5 分鐘,離心 10,000 × g 10 分鐘去除酒精晾乾後,

加入 50 μl 的滅菌水中即可得質體。

(五)、質體抽取 (VIOGENE Mini-MTM Plasmid DNA Extraction Kit)

取 1 ml已培養 12-14 小時之菌液至 1.5 ml 離心管中,離心 10,000 × g 1分鐘去上清 液,加入 250 μl 的MX1 Buffer (加入 RNase 後置於 4℃ 下存放) 重新懸浮至菌體散盡,

再加入 250 μl 的 MX2 Buffer 上下倒置離心管 4-6 次至透明狀後,靜置 5 分鐘,再加入 350 μl 的 MX3 Buffer上下倒置離心管數次後,離心 10,000 × g 10 分鐘後取上清液,將上

(36)

清液取至 column 中已放置於 2 ml 離心管離心 10,000 × g 1 分鐘去除過濾液,加入 0.5 ml WF buffer 至 column 中離心 10,000 × g 1 分鐘去除過濾液,再加入 0.7 ml WS buffer (已加入 100% 酒精) 至 column 中離心 10,000 × g 1 分鐘去除過濾液,再將 column 離 心 10,000 × g 3分鐘,去除殘留酒精,接著將 column 置於新的 1.5 ml 離心管中,加入 50 μl的滅菌水至 column 的膜中心靜置 2 分鐘後,離心 10,000 × g 2 分鐘後所得即為純化之 產物。

三、基因表現與功能分析 (一)、GB3 細胞株繼代培養

GB3 細胞株是本實驗室由石斑魚的腦細胞初代分離而來 (Lai,2 000),將 GB3 細胞株 培養在 75T 培養瓶當中,以含 10% Fetal Bovine Serum,100 units/ml,100 μg/ml penicillin-streptomycin 於 Leibovitz’s L-15 之培養液培養於 28°C。

當細胞長滿時,吸除培養瓶中原有之培養液,並以滅菌過之 PBS 清洗 1 次後,加入 1 ml 0.25% 胰蛋白酶 (Trypsin) 溶液作用。待細胞完全懸浮後,加入適量含血清之培養液 中止胰蛋白酶活性,並將細胞沖散。留下 1/3 細胞液於原培養瓶內並補足 Leibovitz’s L-15 培養液。

(二)、細胞的轉染作用 (transfection)

將1 × 105 個 GB3 細胞培養於24 孔細胞培養盤,28℃ 培養 20 小時。配製 mix 1 solution:4 μg 的 plasmid DNA 加入 250 μl 不含 FBS 的 Leibovitz’s L-15 培養液混合均 勻。配製 mix 2 solution:10 μl的LipofectamineTM 2000 reagent 加入 250 μl 不含 FBS 的 Leibovitz’s L-15 培養液,室溫靜置 5 分鐘。將 mix 1 solution 加入 mix 2 solution,室溫 靜置 25 分鐘。將已培養 20 小時的細胞去除培養液,PBS 清洗後,加入 1.5 ml Leibovitz’s L-15 培養液,再加入 500 μl的mix 1 solution 和 mix 2 solution 的混合液,28℃ 培養 5 小 時後,更換含有 FBS 的 Leibovitz’s L-15 培養液。

(三)、Stable clone 的篩選 (screening of stable clone)

(37)

已轉染且更換含 FBS 的 Leibovitz’s L-15 培養液之細胞,28 ℃ 培養 24 小時。細胞 分株至 75T 培養瓶,28 ℃ 培養 48 小時。更換含有 1,000 μg/ml geneticin 的 Leibovitz’s L-15 培養液,28℃ 培養。每 2 至 3 天更換含有 1,000 μg/ml geneticin 的 Leibovitz’s L-15 培養液,最後即可得 stable clone。

四、DNA與蛋白質的濃度測定 (一)、DNA濃度測定

將分光光度計設定在 OD260 nm,以 1 ml 滅菌水歸零,再檢測待測物 (5 μl 的 DNA 加至 995 μl的滅菌水均勻混和) 的讀值。DNA 濃度的計算 (雙股 DNA 為 50 μg/ml)為 OD260 nm 讀值乘於 50 再除以 5 即可知每 μl 中所含之 DNA 量。

(二)、蛋白質定量

使用 Bio-Rad Protein Assay (Bradford, M. 1976),將不同量 BSA 溶於 160 μl 的去離子 水中,配成已知濃度 0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 μg/μl之標準溶液。另將待測純化的病毒液 5 μl 溶於 155 μl 的去離子水中。同時加入 40 μl 的蛋白質染劑 (protein binding dye) 混合均 勻,室溫等待 2 分鐘後,以 OD595 nm 可見光波長測其吸光值,再以內插法推算病毒蛋白 質濃度。

(38)

第五章、結果 一、pET 20b-grouper IgM CH2-CH4質體的構築

首先以含有 grouper IgM heavy chain 恆定區的質體為模板,藉由聚合酶鏈鎖反應和專 一性引子來增幅grouper IgM 的 CH2-CH4 基因片段,分子量大約 1 kb ,另外利用轉型作用 生產 pET 20b 載體,然後將 grouper IgM 的 CH2-CH4 基因片段和 pET 20b 載體經由酵素 Hind III 和 Xho I digest 後,再將兩者行接合作用,由圖二的電泳圖結果中發現可能有已接 入 grouper IgM 的 CH2-CH4 基因片段之 pET 20b 載體。而由圖三電泳圖的結果進一步得知 由酵素 Hind III 和 Xho I digest pET 20b-grouper IgM CH2-CH4 ligation 質體後,證實 grouper IgM的CH2-CH4 基因片段已成功接入 pET 20b 載體中。

二、pET 20b-chimeric heavy chain (heavy chain of HB56 Fab -grouper IgM CH2-CH4) 質體的構 築

抽取小鼠單株抗體 HB56 融合瘤細胞的 RNA 後,再以反轉錄的聚合酶鏈鎖反應,將 小鼠單株抗體 HB56 融合瘤細胞的 RNA 反轉錄成 cDNA,同樣再以聚合酶鏈鎖反應和專 一性的引子,增幅小鼠單株抗體 HB56 中 Fab 的 heavy chain 基因片段,分子量大約 0.7 kb,同時將上述已構築完成之 pET 20b-grouper IgM CH2-CH4 質體作為載體,將兩者經由酵 素 NdeⅠ 和 Hind III digest 後,再將兩者行接合作用,在圖四的電泳圖結果中發現可能有 已接入小鼠單株抗體 HB56 中 Fab的heavy chain 基因片段之 pET 20b-grouper IgM CH2-CH4 質體。在圖五的電泳圖結果得知,進一步由酵素 NdeⅠ 和 Hind III digest pET 20b- heavy chain of HB56 Fab-grouper IgM CH2-CH4 ligation 質體後,證實 HB56 中 Fab的heavy chain 基因片段已成功接入 pET 20b-grouper IgM CH2-CH4 質體中。

三、構築 pET 23a-HB56 light chain質體的構築

同樣藉由抽取小鼠單株抗體 HB56 融合瘤細胞的 RNA,以反轉錄的聚合酶鏈鎖反應 將小鼠單株抗體 HB56 融合瘤細胞的 RNA 反轉錄成 cDNA,再以聚合酶鏈鎖反應和專一 性的引子增幅小鼠單株抗體 HB56 light chain (LC) 基因片段,分子量大約 0.7 kb,以 pET

(39)

23a 為載體將兩者經由酵素 NdeⅠ 和 Hind III digest 後,再將兩者行接合作用,在圖六的 電泳圖結果中發現可能有已接入小鼠單株抗體 HB56 light chain之pET 23a 載體。圖七由電 泳圖的結果得知,進一步由酵素 NdeⅠ 和 Hind III digest pET 23a-HB56 light chain ligation 質體後,證實 HB56 light chain 基因片段已成功接入 pET 23a 載體中。

四、pSecTaq2A-chimeric heavy chain (heavy chain of HB56 Fab -grouper IgM CH2-CH4) 質體的 構築

利用 pET 20b-chimeric heavy chain 質體為模板,同時利用聚合酶鏈鎖反應和專一性的 引子增幅 chimeric heavy chain 基因片段,分子量大約 1.7 kb,並以 pSecTaq2A 作為載體 將兩者經由酵素 Asc I 和 Xho I digest 後,再將兩者行接合作用,目的是為了獲得 pSecTaq2A 載體上的 signal sequence 和 CMV promoter 的基因片段,以便在真核系統中表 現及修飾並能分泌至培養液中,在圖八和圖九的電泳圖結果中發現可能有已接入 chimeric heavy chain之pSecTaq2A 載體。圖十由電泳圖的結果得知,進一步由酵素 Asc I 和 Xho I digest pSecTaq2A-chimeric heavy chainligation 質體後,證實 chimeric heavy chain 基因片段 已成功接入 pSecTaq2A 載體中。

五、pSecTaq2B-HB56 light chain質體的構築

接著是以pET23a-HB56 light chain 質體為模板,以聚合酶鏈鎖反應和專一性的引子增 幅 HB56 light chain 基因片段,分子量大約 0.7 kb,再以 pSecTaq2B 作為載體將兩者經由 酵素 Hind III 和 Xho I digest 後,再將兩者行接合作用,目的是為了獲得 pSecTaq2B 上的 signal sequence和poly A site 以便在真核系統中表現及修飾並能分泌至培養液中,圖十一的 電泳圖結果中發現可能有已接入小鼠單株抗體 HB56 light chain之pSecTaq2B 載體。由圖十 二的電泳圖結果中發現,進一步由專一性的酵素 Hind III 和 Xho I digest pSecTaq2B-HB56 light chain ligation 質體,證實 HB56 light chain 基因片段已成功接入 pSecTaq2B 載體中。

(40)

六、pEGFP-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain質體的構築

利用 pSecTaq2B-HB56 light chain 質體為模板以聚合酶鏈鎖反應和專一性的引子增幅 含有 signal sequence和poly A site的pSecTaq2B-HB56 light chain 基因片段,分子量大約 1.2 kb,再以 pEGFP-N1 作為載體,將兩者經由酵素 Nhe I 和 EcoR I digest 後,再將兩者行 接合作用,圖十三、十四的電泳圖結果中發現可能有已接入含有 signal sequence和poly A site 的 pSecTaq2B-HB56 light chain 基因片段之 pEGFP-N1 載體。圖十五的電泳圖結果中發 現,進一步由酵素 Nhe I 和 EcoR I digest pEGFP-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain ligation 質體,證實含有 signal sequence和poly A site的pSecTaq2B-HB56 light chain 基因片段已成功 接入 pEGFP-N1 載體中。

七、p-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain -pSecTaq2A chimeric heavy chain (heavy chain of HB56 Fab -grouper IgM CH2-CH4) 質體的構築

最後是以 pSecTaq2A-chimeric heavy chain 質體為模板,以聚合酶鏈鎖反應和專一性的引子 增幅含有 signal sequence和CMV promoter的pSecTaq2A-chimeric heavy chain 基因片段,分 子量大約 2.5 kb,再以 pEGFP-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain 質體作為載體,將兩者經由 酵素 Kpn I 和 Not I digest 後 (pEGFP-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain 質體經由酵素 digest 後會失去 EGFP),再將兩者行接合作用,圖十六的電泳圖結果中發現可能有已接入 含有 signal sequence 和 CMV promoter 的 pSecTaq2A-chimeric heavy chain 基因片段之 p-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain 質體。圖十七的電泳圖結果中得知,進一步由酵素 Kpn I 和 Not I digest p-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain-pSecTaq2A chimeric heavy chain ligation 質 體,證實含有 signal sequence和CMV promoter 的 pSecTaq2A-chimeric heavy chain 基因片 段 已 成 功 接 入 p-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain 質 體 中 。 此 即 為 構 築 完 成 之 p-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain-pSecTaq2A-chimeric heavy chain 質體,這個質體是將 pSecTaq2B-HB56 light chain 基因片段和 pSecTaq2A-chimeric heavy chain (heavy chain of HB56 Fab-grouper IgM CH2-CH4) 基因片段構築在一起,使得 HB56 light chain 基因片段和 chimeric heavy chain 基因片段能夠各以同等量在真核系統中表現及修飾,並分泌至培養液 中的擬魚化抗體之質體。

數據

Updating...

相關主題 :