首先以含有 grouper IgM heavy chain 恆定區的質體為模板，藉由聚合酶鏈鎖反應和專 一性引子來增幅grouper IgM 的 CH2-CH4 基因片段，分子量大約 1 kb ，另外利用轉型作用 生產 pET 20b 載體，然後將 grouper IgM 的 CH2-CH4 基因片段和 pET 20b 載體經由酵素 Hind III 和 Xho I digest 後，再將兩者行接合作用，由圖二的電泳圖結果中發現可能有已接 入 grouper IgM 的 CH2-CH4 基因片段之 pET 20b 載體。而由圖三電泳圖的結果進一步得知 由酵素 Hind III 和 Xho I digest pET 20b-grouper IgM CH2-CH4 ligation 質體後，證實 grouper IgM的CH2-CH4 基因片段已成功接入 pET 20b 載體中。
二、pET 20b-chimeric heavy chain (heavy chain of HB56 Fab -grouper IgM CH2-CH4) 質體的構 築
抽取小鼠單株抗體 HB56 融合瘤細胞的 RNA 後，再以反轉錄的聚合酶鏈鎖反應，將 小鼠單株抗體 HB56 融合瘤細胞的 RNA 反轉錄成 cDNA，同樣再以聚合酶鏈鎖反應和專 一性的引子，增幅小鼠單株抗體 HB56 中 Fab 的 heavy chain 基因片段，分子量大約 0.7 kb，同時將上述已構築完成之 pET 20b-grouper IgM CH2-CH4 質體作為載體，將兩者經由酵 素 NdeⅠ 和 Hind III digest 後，再將兩者行接合作用，在圖四的電泳圖結果中發現可能有 已接入小鼠單株抗體 HB56 中 Fab的heavy chain 基因片段之 pET 20b-grouper IgM CH2-CH4 質體。在圖五的電泳圖結果得知，進一步由酵素 NdeⅠ 和 Hind III digest pET 20b- heavy chain of HB56 Fab-grouper IgM CH2-CH4 ligation 質體後，證實 HB56 中 Fab的heavy chain 基因片段已成功接入 pET 20b-grouper IgM CH2-CH4 質體中。
三、構築 pET 23a-HB56 light chain質體的構築
同樣藉由抽取小鼠單株抗體 HB56 融合瘤細胞的 RNA，以反轉錄的聚合酶鏈鎖反應 將小鼠單株抗體 HB56 融合瘤細胞的 RNA 反轉錄成 cDNA，再以聚合酶鏈鎖反應和專一 性的引子增幅小鼠單株抗體 HB56 light chain (LC) 基因片段，分子量大約 0.7 kb，以 pET
23a 為載體將兩者經由酵素 NdeⅠ 和 Hind III digest 後，再將兩者行接合作用，在圖六的 電泳圖結果中發現可能有已接入小鼠單株抗體 HB56 light chain之pET 23a 載體。圖七由電 泳圖的結果得知，進一步由酵素 NdeⅠ 和 Hind III digest pET 23a-HB56 light chain ligation 質體後，證實 HB56 light chain 基因片段已成功接入 pET 23a 載體中。
四、pSecTaq2A-chimeric heavy chain (heavy chain of HB56 Fab -grouper IgM CH2-CH4) 質體的 構築
利用 pET 20b-chimeric heavy chain 質體為模板，同時利用聚合酶鏈鎖反應和專一性的 引子增幅 chimeric heavy chain 基因片段，分子量大約 1.7 kb，並以 pSecTaq2A 作為載體 將兩者經由酵素 Asc I 和 Xho I digest 後，再將兩者行接合作用，目的是為了獲得 pSecTaq2A 載體上的 signal sequence 和 CMV promoter 的基因片段，以便在真核系統中表 現及修飾並能分泌至培養液中，在圖八和圖九的電泳圖結果中發現可能有已接入 chimeric heavy chain之pSecTaq2A 載體。圖十由電泳圖的結果得知，進一步由酵素 Asc I 和 Xho I digest pSecTaq2A-chimeric heavy chainligation 質體後，證實 chimeric heavy chain 基因片段 已成功接入 pSecTaq2A 載體中。
五、pSecTaq2B-HB56 light chain質體的構築
接著是以pET23a-HB56 light chain 質體為模板，以聚合酶鏈鎖反應和專一性的引子增 幅 HB56 light chain 基因片段，分子量大約 0.7 kb，再以 pSecTaq2B 作為載體將兩者經由 酵素 Hind III 和 Xho I digest 後，再將兩者行接合作用，目的是為了獲得 pSecTaq2B 上的 signal sequence和poly A site 以便在真核系統中表現及修飾並能分泌至培養液中，圖十一的 電泳圖結果中發現可能有已接入小鼠單株抗體 HB56 light chain之pSecTaq2B 載體。由圖十 二的電泳圖結果中發現，進一步由專一性的酵素 Hind III 和 Xho I digest pSecTaq2B-HB56 light chain ligation 質體，證實 HB56 light chain 基因片段已成功接入 pSecTaq2B 載體中。
六、pEGFP-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain質體的構築
利用 pSecTaq2B-HB56 light chain 質體為模板以聚合酶鏈鎖反應和專一性的引子增幅 含有 signal sequence和poly A site的pSecTaq2B-HB56 light chain 基因片段，分子量大約 1.2 kb，再以 pEGFP-N1 作為載體，將兩者經由酵素 Nhe I 和 EcoR I digest 後，再將兩者行 接合作用，圖十三、十四的電泳圖結果中發現可能有已接入含有 signal sequence和poly A site 的 pSecTaq2B-HB56 light chain 基因片段之 pEGFP-N1 載體。圖十五的電泳圖結果中發 現，進一步由酵素 Nhe I 和 EcoR I digest pEGFP-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain ligation 質體，證實含有 signal sequence和poly A site的pSecTaq2B-HB56 light chain 基因片段已成功 接入 pEGFP-N1 載體中。
七、p-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain -pSecTaq2A chimeric heavy chain (heavy chain of HB56 Fab -grouper IgM CH2-CH4) 質體的構築
最後是以 pSecTaq2A-chimeric heavy chain 質體為模板，以聚合酶鏈鎖反應和專一性的引子 增幅含有 signal sequence和CMV promoter的pSecTaq2A-chimeric heavy chain 基因片段，分 子量大約 2.5 kb，再以 pEGFP-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain 質體作為載體，將兩者經由 酵素 Kpn I 和 Not I digest 後 (pEGFP-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain 質體經由酵素 digest 後會失去 EGFP)，再將兩者行接合作用，圖十六的電泳圖結果中發現可能有已接入 含有 signal sequence 和 CMV promoter 的 pSecTaq2A-chimeric heavy chain 基因片段之 p-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain 質體。圖十七的電泳圖結果中得知，進一步由酵素 Kpn I 和 Not I digest p-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain-pSecTaq2A chimeric heavy chain ligation 質 體，證實含有 signal sequence和CMV promoter 的 pSecTaq2A-chimeric heavy chain 基因片 段 已 成 功 接 入 p-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain 質 體 中 。 此 即 為 構 築 完 成 之 p-N1-pSecTaq2B-HB56 light chain-pSecTaq2A-chimeric heavy chain 質體，這個質體是將 pSecTaq2B-HB56 light chain 基因片段和 pSecTaq2A-chimeric heavy chain (heavy chain of HB56 Fab-grouper IgM CH2-CH4) 基因片段構築在一起，使得 HB56 light chain 基因片段和 chimeric heavy chain 基因片段能夠各以同等量在真核系統中表現及修飾，並分泌至培養液 中的擬魚化抗體之質體。
第六章、討論 一、抗體運用於其他物種的疾病治療
在抗體發展的歷史上，首先是以多株抗體血清來進行臨床的診斷或治療，但由於專一 性不盡理想造成偽陽性的現象發生，使得診斷變得困難。之後接著發展出小鼠的單株抗體，
單株抗體具備了高專一性和親合力的特性。在1992年有學者以不同的抗新型隱球菌
(Cryptococcus neoformans) 上多醣 (glucuronoxylomannan) 之小鼠單株抗體，進一步將這些 小鼠單株抗體在感染新型隱球菌前24-48小時內打入小鼠體內，之後再以致死的新型隱球菌 抗體 T101 多次施打於 cutaneous T cell lymphoma (CTCL) 或 chronic lymphocytic
leukemia (CLL) 的病人身上，發現有 human anti-mouse immunoglobulin (mIgG) 的抗體反應 發生，證實經施打小鼠單株抗體的人體中確實會有排斥反應的發生 (Sears, 1984; Reynolds, 1989; Shawler, 1985; Jaffers, 1986)。
單株抗體的不良性，使得學者藉由基因工程研發出單鏈 Fv 抗體，在 2005 年有學者 利用 phage display library 篩選並構築具有中和 B-LyS (B-lymphocyte stimulator) 能力的單 鏈 Fv 抗體 C305，C305 能有效抑制 B-LyS 與它的受器 (BCMA) 鍵結，B-LyS 為腫瘤 壞死因子家族的重要成員之ㄧ，並且在調節 B 細胞的活化上為一個關鍵的角色 ，由於 C305能有效中和 B-LyS，因此在自體免疫的疾病治療 C305 上扮演一個很重要的角色 (Liu, 2005)。在 2006 年有學者藉由選殖抗人類 CTLA4 (Cytotoxic T lymphocyte associated Ag-4) 的單鏈 Fv 抗體 (pHEN1)，進一步設計一個能專一性與人類 CTLA4 鍵結的單鏈 Fv 抗體，CTLA4 與 APC 上的 CD80/CD86 配體在抑制 T 細胞的活化上共同扮演關鍵
的角色，藉由單鏈 Fv 抗體有效的與 CTLA4 鍵結，同時也加強了 T 細胞殺死腫瘤的能 親合力、對組合 (assemble) 及摺疊的要求度低 (Tavladoraki, 1993; Benvenuto, 1995)、能以 原核系統大量表現因此成本較低。 immunoblotting 分析得知這些單株抗體所作用的病毒結構蛋白分別是 G (envelope
glycoprotein)、N (nucleocapsid related protein)、M1 與 M2 (matrix proteins 1 與 2)，再以免 疫酵素分析法、免疫螢光和溶菌斑中和試驗檢測這些單株抗體的活性，以活的病毒感染魚
類細胞並在免疫螢光的觀測下，這些抗體確實具有中和病毒的能力 (Lorenzen, 1988)。而後 在 2000 年有學者利用魚類的 model，去構築一個具有中和病毒性出血性敗血症病毒 (viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV) 的單鏈 Fv 抗體，此單鏈 Fv 抗體具有中和病毒性出 血性敗血症病毒上 envelope glycoprotein 的能力，在 in vitro 的實驗中證實經轉染單鏈 Fv 抗體的質體 DNA 魚類細胞，在五天後以病毒性出血性敗血症病毒感染，能有效抵抗病毒
1.7 kb的 chimeric heavy chain (heavy chain of HB56 Fab-grouper IgM CH2-CH4) 基因片段與 大約 0.7 kb 的 HB56 light chain (LC) 基因片段，擬魚化抗體是藉由保留小鼠單株抗體的 Fab 片段並與魚類 IgM 的 Fc 片段做結合，小鼠單株抗體的 Fab 片段保有對抗原鍵結之 專一性及親和力，因此具有中和病毒的能力，而魚類 IgM 的 Fc 片段能有效降低魚體的 排斥和過敏性，並增加擬魚化抗體在魚體內的半衰期，同時藉由魚類 IgM 的 Fc 片段來 進一步提升魚體自身的免疫反應，像是補體的活化或是抗體依賴性細胞毒殺作用與調理作 用等等，加強消滅病毒的能力。
四、未來展望
本篇的擬魚化抗體與它種抗體相較是保留了小鼠單株抗體的 Fab 片段，小鼠單株抗體 的 Fab 片段具有與抗原鍵結的專一性和高親合力，但是由於小鼠單株抗體 Fab 片段的保 留，使得擬魚化抗體在整體上仍具有相當高比例的鼠源序列，對於魚類的免疫系統很可能 被視為外來物質而產生排斥的現象。同時擬魚化抗體中魚類 IgM 的 Fc 片段可能也會造 成小鼠單株抗體中 Fab 片段構型的改變，進而影響與抗原鍵結的專一性和親合力甚至是中 和病毒的能力，另外與小鼠單株抗體相較魚類抗體的 Fc 片段是否能夠增加抗體在魚體內 的半衰期、並有效活化魚體內的免疫反應，都是將更進一步探討的課題。將來在擬魚化抗 體的改良上，希望能只保留小鼠單株抗體的可變區序列去降低鼠源序列的比例，以達到有 效降低排斥和過敏的現象外，仍保有與抗原鍵結的專一性和親合力，而魚類抗體 Fc 片段 的功能也將被更進一步的發揮。