第三章 實驗材料與方法
3.2 實驗方法
3.2.1 染色體核酸 (chromosomal DNA)萃取 1 材料
(1) 菌株：2009 年臺大醫院夫西地酸抗藥表皮葡萄球菌臨床菌株 (2) Cell suspension solution pH＝7.5, 10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA
(3) Cell lysis solution pH＝8.5, 200 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 35 mM SDS (4) Protein precipitation solution 10 mM NH4OAC
(5) Lysozyme (Bio Basic Inc., Markham Ontario, Canada)：100 mg/ml (6) Lysostaphin (Sigma, Deisenhofen, Germany)：5 mg/ml
(7) RNase A solution (Clontech, Palo Alto, CA, USA)：1 mg/ml (8) 100％ isopropanol (Echo Chem. Co., Miaoli, Taiwan) (9) 70％ cold ethanol (JT Baker, Phillipsburg, NJ, USA) 2 設備
(1) 冷凍乾燥機 (Heto Drywinner, Copenhagen, Denmark) (2) 離心機 (Kubota 1920 centrifuge, Kubota, Tokyo, Japan) .3 方法
吸取1.5 ml 隔夜培養之細菌懸浮液至 1.7 ml eppendorf，14000 rpm 離心 2 分 鐘；去除上清液後加入600 μl cell suspension solution，vortex 震盪使其懸浮均勻，
並加入10 μl lysozyme 和 0.5 μl lysostaphin，上下搖晃使之混勻，置於 37℃反應 1.5 小時後，14000 rpm 離心 2 分鐘，去除上清液並加入 600 μl cell lysis solution，置於 80℃反應 20 分鐘，降至室溫後加入 5 μl RNase A 於 37℃反應 30 分鐘，再加入 200 μl protein precipitation solution，混勻後離心 14000 rpm 20 分鐘；吸取上清液至另一 eppendorf 並加入 600 μl isopropanol，於-20℃反應 1 小時，以 14000 rpm 離心 10 分 鐘；去上清液，加入600 μl 70％ cold ethanol，14000 rpm 離心 1 分鐘，最後以冷 凍乾燥機離心抽乾，加入30 μl ddH20 於室溫隔夜回溶，保存於 4℃。
3.2.2 聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction；PCR) 1 材料
(1) 菌株：表皮葡萄球菌 DNA
(2) Recombinant TaqDNA polymerase (TakaRa, Tokyo, Japan) (3) LE agarose (Seakem, FMC Bioproducts Rockland, ME, USA) (4) DNA marker：100 bp ladder (Invitrogen, Paisley, UK)
(5) 0.5× TBE buffer (Amereso Inc., Solon, Ohio, USA) (6) Loading dye (MBI fermentas)
(7) Ethidium bromide (Amresco Inc.,Solon, Ohio, USA) (8) Primers (Mission Biotech) (表八)
2 設備
(1) PCR 反應機器：PTC-100TM programmable Thermal Controller (MJ Research, Watertown, MA, USA)
(2) 電泳裝置：Mupid-2 plus submarine electrophoresis system (Advance, Tokyo, Japan)
(3) 電泳膠影像分析系統：UV-transilluminator (Vilber Lourmat, Marne La Vallee, France)
3 方法
(1)混合下列試劑於無菌 0.2 ml 試管
項目 總體積(μl)
無菌二次水 20.5
10× PCR buffer 2.5
dNTP 混合液 0.5
Primer (F) 0.5
Primer (R) Taq DNA polymerase
0.5 0.1
Template DNA 0.5
總體積 25
(2) 將 0.2 ml 試管置於 PCR 機器中進行反應 94℃ 30 秒
94℃ 7 分鐘 → a50℃ 30 秒 30 次循環 → 72℃ 10 分鐘 →4℃保存 72℃ b30 秒
a根據primer 條件，annealing 溫度會有所變動
b根據PCR 產物大小，extension 時間會有所變動
(3) 反應後之 PCR 產物以 1％或 1.2％瓊脂凝膠電泳進行分析
3.2.3 純化 PCR 產物 1 材料
(1) Gel/PCR DNA fragments extraction kit (Geneaid, Taoyuan, Taiwan) 2 設備
(1) 離心機 (Kubota 1920 centrifuge, Kubota, Tokyo, Japan)
(2) 電泳膠影像分析系統：UV-transilluminator (Vilber Lourmat, Marne La Vallee, France)
(3) 乾熱器 (Gen-probe, San Diego, CA, USA) 3 方法
(1) Gene clean up
加入 DF buffer (PCR 產物五倍體積)至 PCR 產物中，混合均勻後，加入已架置 collection tube 上的 DF column 中，14000 rpm 離心 2 分鐘，去除廢液，加入 600 μl wash buffer 至 DF column 中，14000 rpm 離心 1 分鐘，去除廢液；再以 14000 rpm 離心10 分鐘，去除殘餘酒精，之後將 DF column 移置新的 1.5 ml 微量離心管中，
加入50℃預熱過之 20 μl 二次水。室溫靜置 10 分鐘後，14000 rpm 離心 10 分鐘，
純化後產物保存於2-8℃。
(2) Gel extraction
在電泳膠影像分析系統以刀片切下特定大小片段的 DNA 片段，放入 1.5 ml
微量離心管中，加入500 μl DF buffer 至於 65℃乾熱器上，每隔 2 分鐘上下反轉使 其均勻混合，待電泳膠完全溶解後，加入已架置collection tube 上的 DF column 中，
14000 rpm 離心 2 分鐘，去除廢液，加入 600 μl wash buffer 至 DF column 中，14000 rpm 離心 1 分鐘，去除廢液；再以 14000 rpm 離心 10 分鐘，去除殘餘酒精，之後 將DF column 移置新的 1.5 ml 微量離心管中，加入 50℃預熱過之 20 μl 二次水。室 溫靜置10 分鐘後，14000 rpm 離心 10 分鐘，純化後產物保存於 2-8℃。
3.2.4 核酸定序
將PCR 純化後產物溶於 ddH2O，濃度約為 1~2 ng/100bp，置於 200 ul 微量離 心管中，分別加入1 μl forward 或 reverse primer (10 pmol)，送至臺大醫院醫學研究 部第二共同研究室定序。定序結果再以DNAMAN、SeqSanner 軟體進行分析。
3.2.5 PCR-RFLP 1 材料
(1) 菌株：表皮葡萄球菌 DNA
(2) Recombinant TaqDNA polymerase (TakaRa, Tokyo, Japan)：TaqDNA polymerase, 10× PCR buffer, dNTP mixture
(3) LE agarose (Seakem, FMC Bioproducts Rockland, ME, USA) (4) DNA marker：100 bp ladder (Invitrogen, Paisley, UK)
(5) 0.5× TBE buffer (Amereso Inc., Solon, Ohio, USA) (6) Loading dye (MBI fermentas)
(7) Ethidium bromide (Amresco Inc., Solon, Ohio, USA) (8) Primers (Mission Biotech) (表八)
(9) 限制酵素 ApaI (New England BioLabs, Beverly, MA, USA) 2 設備
(1) PCR 反應機器：PTC-100TM programmable Thermal Controller (MJ Research,
Watertown, MA, USA)
(2) 電泳裝置：Mupid-2 plus submarine electrophoresis system (Advance, Tokyo, Japan)
(3) 電泳膠影像分析系統：UV-transilluminator (Vilber Lourmat, Marne La Vallee, France)
3 方法
(1)混合下列試劑於無菌 0.2 ml 試管
項目 總體積(μl)
無菌二次水 20.5
10× PCR buffer 2.5
dNTP 混合液 0.5
Primer (F) 0.5
Primer (R) Taq DNA polymerase
0.5 0.1
Template DNA 0.5
總體積 25
(2) 將 0.2 ml 試管置於 PCR 機器中進行反應
94℃ 30 秒 94℃ 30 秒
94℃ 3 分鐘 → 45℃ 30 秒 5 次循環 → 50℃ 30 秒 30 次循環 72℃ 60 秒 72℃ 60 秒
→72℃ 3 分鐘 →4℃保存 1% 瓊脂凝膠電泳確認結果 (3) 限制酵素切割作用
混合下列試劑於1.7 ml 離心管：
項目 總體積 (μl)
PCR 產物 8
ApaI 1
10× buffer 1
總體積 10
置於50℃反應 3 小時，最後以 2％ 瓊脂凝膠電泳確認限制酵素作用切割的不同片 段。
3.2.6 瓊脂圓盤擴散法 (disk diffusion test) 1 材料
(1) 菌株：2009 年臺大醫院表皮葡萄球菌臨床菌株 (2) 標準菌株：Staphylococcus aureus ATCC 25923 (3) BHI broth (Brain heart infusion, Difco)
(4) MHA (Mueller-Hinton agar, Difco) (5) Fusidic acid disc
2 方法
將表皮葡萄球菌接種於LB 瓊脂培養基 (BBL, Cockeysville, Maryland, USA)，
37℃ CO2隔夜培養，隔日以棉棒挑取適當菌落懸浮於BHI (Brain heart infusion)，
濃度調整至0.5 McFarland 後，以三向畫法均勻塗抹菌液於 MHA 上，以滅菌後的 鎳子將藥錠平貼於塗抹菌液後的MHA 上。35℃培養 16-18 小時後，測量抑制圈大 小。
3.2.7 瓊脂稀釋法 (agar dilution method) 1 材料
(1) 菌株：2009 年臺大醫院表皮葡萄球菌臨床菌株 (2) 標準菌株：Staphylococcus aureus ATCC 29213 (3) BHI broth (Brain heart infusion, Difco)
(4) MHA (Mueller-Hinton agar, Difco)
(5) Fusidic acid (Leo Pharmaceutical Products, Ballerup, Denmark) 2 設備
(1) 36 孔蓋菌盤
(2) 自動多點接種機 (AQS Manufacturing, West Sussex, UK) 3 方法
(1) 藥物 stock 稀釋：
夫西地酸粉末（10240 μg/ml, purity：99.7％），秤取0.05135 g Fusidic acid 粉末 溶解在5 ml 95％酒精，混勻後用 0.2 μm 過濾器過濾，分裝儲存在-20℃。
(2) 培養基
配置Mueller-Hinton agar (MHA)，滅菌後放置 50℃水浴槽。
(3) 夫西地酸溶液序列稀釋與培養基製備
空管滅菌烘乾後，將 10240 μg/ml 的夫西地酸 stock 溶液在空管中兩倍序列稀 成0.3-1280 μg/ml。取 1.5 ml 不同濃度夫西地酸溶液至培養皿中，加入 13.5 ml 的 MHA 混合均勻。
(4) 接種
細菌經 37℃ 5％ CO2隔夜培養後，隔日以棉棒挑取適當菌落懸浮於BHI (Brain heart infusion)，濃度調整至 0.5 McFarland (菌量約 1.5×108 CFU/ml)。36 孔蓋菌盤 (接種針接種體積約 0.3 μl；菌量約 1.55×104/SPOT) 烘乾後，用 dropper 將調好的 0.5 McFarland 菌液吸到接種盤中。接種順序為：生長對照組 (不含抗生素)；13 片 抗生素濃度由低而高的 MHA 培養基，待培養基上菌液乾後倒置，在無 CO2培養 箱35℃培養 16-20 小時。
3.2.8 南方墨點法 (southern blot) 1 材料
(1) 細菌染色體核酸 DNA
(2) 限制酵素 BamHI、EcoRI、HindIII、SalI、PstI、XbaI (New England BioLabs, Beverly, MA, USA)
(3) 瓊脂凝膠：LE agarose (Seakem, FMC Bioproducts Rockland, ME, USA) (4) 0.5× TBE buffer (Amereso Inc., Solon, Ohio, USA)
(5) DIG Molecular Weight Marker II, DIG-labeled (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany)
(6) 6× loading dye (MBI fermentas)
(7) Ethidium bromide (Amresco Inc.,Solon, Ohio, USA)
(8) 尼 龍 膜 Nylon membrane ： HyboundTM-N+ (Amershamm, Buckinghamshire, English)
(9) Depurination solution：0.25 M HCl
(10) Denaturation solution：1.5 M NaCl, 0.5M NaOH
(11) Neutralizing solution：pH＝7.5, 1.0 M Tris, 1.5 M NaCl (11) 20× SSC：3.0 M NaCl, 0.5 M Sodium citrate
(12) DIG Easy Hyb (Rhche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany)
(13) PCR Dig Labeling Mix (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany) (14) Primers (Mission Biotech) (表八)
(15) Recombinant TaqDNA polymerase (TakaRa, Tokyo, Japan)：TaqDNA polymerase, 10× PCR buffer, dNTP mixture
(16) 100 bp ladder (Invitrogen, Paisley, UK)
(17) Gel/PCR DNA fragment extraction kit (Geneaid, Taoyuan, Taiwan) (18) High salt solution：2× SSC, 0.1％ SDS
(19) Low salt solution：0.1× SSC, 0.1％ SDS
(20) Maleic acid buffer：pH＝7.5, 0.1 M meleic acid, 0.15 M NaCl (21) Blocking solution (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany)
(22)Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany)：用 1× blocking solution 以 1：10000 稀釋
(23) Wash buffer：pH＝7.5, 0.1 M Maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.3％ Tween 20 (24) Detection buffer：pH＝9.5, 0.1 M Tris, 0.1 M NaCl
(25) CSPD (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany)：用 1× detection buffer 以
1：100 稀釋 2 設備
(1) 水浴槽 (shaking bath, TKS, Taipei, Taiwan)
(2) 電泳裝置 Mupid-2 plus submarine electrophoresis system (Advance, Tokyo, Japan)
(3) Vacuum Blotting System (VacuGene XL, Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) (4) UV crosslinker (UVC500, Hoefer, San Francisco, CA, USA)
(5) PCR machine：PTC-100TM Programmable Thermal Controller (MJ Research, Watertown, MA, USA)
(6) UV-transilluminator (Vilber Lourmat, ,Marne La Vallee, France) (7) Centrifuge (Kubota 1920 centrifuge, Kubota, Tokyo, Japan) (8) Cassette (Kodak, New York, USA)
(9) Falcon tube (greiner bio-one, Frickenhausen, Germany)
(10) Hybridization incubator model 1000 (Robbins Scientific, Sunnyvale, CA, USA) (11) 冷光偵測儀
3 方法
(1) 限制酵素切割反應 (restriction enzyme digestion)
用分光光度計定量染色體核酸 DNA 濃度，並將下列試劑混合於無菌 1.7 ml 離 心管，混合均勻後置於37℃反應 1.5 小時。
項目 體積量(μl)
染色體核酸DNA 1 μg
限制酵素 1
10× 限制酵素緩衝液 2
二次水 0-16
總體積 20
(2) 瓊脂凝膠電泳 (agarose gel electrophoresis)
製備兩片 1％ 瓊脂凝膠，將限制酵素反應完後的產物與 loading dye 混合均
勻，分別取15 μl 與 5 μl 置於瓊脂凝膠上，以 100 伏特電壓分離染色體核酸 DNA。
將含有5 μl 限制酵素產物之 1％ 瓊脂凝膠以 Ethidium bromide 染色，確認限制酵
素切割完全，之後將含有15 μl 限制酵素切割後產物之瓊脂凝膠製備雜交轉移膜。
(3) 置備雜交轉移膜 (hybridization transfer membrane)
將電泳完之瓊脂凝膠至於保鮮盒中，加入 Depurination solution 反應作用至 dye
的顏色從藍色變黃色，約5 分鐘，此步驟使染色體核酸 DNA 更易於瓊脂凝膠轉移
至尼龍膜上，倒掉Depurination solution 後，加入 Denaturation solution，使染色體 核酸DNA 雙股打開成單股，反應作用至 dye 的顏色從黃色變藍色，約 15 分鐘，
倒掉Denaturation solution 後，加入 Neutralizing solution，作用 15 分鐘。利用 Vacuum Blotting System 抽氣一小時，將瓊脂凝膠上的染色體核酸 DNA 轉移至尼龍膜，接 著進行UV crosslinkage。將 UV crosslink 完的尼龍膜放入含有 5 ml DIG Hyb Falcon tube 中，於 Hybridization incubator 42℃隔夜反應。
(4) 探針置備與純化 (probe)
將下列試劑混合於無菌0.2 ml 薄壁試管
項目 體積量(μl)
二次水 38
10× PCR buffer 5
PCR DIG-dNTP 混合液 3
Primer (F) 1.5
Primer (R) 1.5
Taq DNA polymerase 0.2
Template DNA 1.5
總體積 50
將試管置於PCR 機器，進行反應：
94℃ 30 秒
94℃ 7 分鐘 → 50℃ 30 秒 30 次循環 → 72℃ 10 分鐘 →4℃保存 72℃ b30 秒
反應後之PCR 產物以 1.2％瓊脂凝膠電泳分析，之後將 PCR 產物進行純化。
(5) 南方雜交 (southern hybridization)
PCR 純化後產物，以 94℃反應 10 分鐘，使探針成單股狀態，之後置於冰上 10 分鐘，避免探針回復成雙股，將純化處理好之 probe 加入 DIG Easy Hyb 混合均 勻，和尼龍膜42℃隔夜反應。
(6) 測定 (hybridization detection)
將尼龍膜和 High salt solution 室溫下反應來移去多餘探針，重複此步驟 2 次，
每次約5 分鐘，倒掉 High salt solution 後，加入 low salt solution 於水浴槽 68℃反 應，移去非特異性結合之探針，重複此步驟兩次，每次約20 分鐘。之後加入 blocking buffer 室溫作用 1 小時，反應完後加入 anti-Digoxigenin-AP 室溫作用 1 小時。加入 wash buffer 反應 15 分鐘 2 次後，加入 detection buffer 作用 2-3 分鐘。在尼龍膜上 加上CSPD，37℃避光作用 20 分鐘，最後利用冷光偵測儀進行偵測。
3.2.9 脈衝式電泳 (pulsed field gel electrophoresis) 1 材料
(1) 菌株：2009 年臺大醫院表皮葡萄球菌臨床菌株 (2) PIV buffer：pH＝8, 1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl
(3) EC buffer：pH＝8, 6 mM Tris, 1 M NaCl, 0.1 M EDTA, 0.2％ sodium deoxycholate, 0.5％ sarkosyl
(4) ES buffer：pH＝9, 0.5 mM EDTA, 1％ sarkosyl (5) TE buffer：pH＝8, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA
(6) 1.6％ low melting agarose (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA,USA) (7) SmaI (20000 U/ml, New England BioLabs, Beverly, MA, USA)
(8) LB 瓊脂培養基 (BBL, Cockeysville, Maryland, USA)
(9) Low-melting agarose (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA,USA) (10) Lysostaphin (Sigma, Deisenhofen, Germany)：5 mg/ml
(11) Lysozyme (Bio Basic Inc., Markham Ontario, Canada)：100 mg/ml
(12) Proteinase K (BioNo Vas, Toronto, Canada)：20 mg/ml
(13) Bacteriophage lambda DNA marker (New English BioLabs, Beverly, MA, USA) 2 設備
(1) CHEF-DR III Pulsed Field Electrophoresis Systems (Bio-Rad Laboratoreis, Herciles, CA, USA)
(2) 乾熱器 (Gen-probe, San Diego, CA, USA)
(3) BioNumerics software (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgium) (4) UV-transilluminator (Vilber Lourmat, ,Marne La Vallee, France) 3 方法
(1) 凝膠塊 (plug)製備
將 LB 瓊脂培養基上隔夜培養菌落刮下懸浮於 1 ml PIV buffer 中，離心 8000 rpm 後去除上清液，重複此步驟兩次，吸去上清液後以適當體積之 PIV buffer 懸浮 菌體，使菌液濃度為OD600＝3，取 100 ml 菌液和等體積 1.6％ low melting gel 均 勻混合，加入鑄膠模板 (plug molds)，置於 4℃ 10 分鐘。待膠塊 (plug)凝固後，放 入1.7 ml 離心管，加入 500 μl EC buffer、10 μl lysozyme 及 1 μl lysostaphin，置於 37℃水浴槽隔夜反應。
(2)去除蛋白質
去除隔夜反應完後的液體，每一管各加入 25 μl proteinase K 和 500 μl ES buffer，置於 50℃水浴槽隔夜反應。
(3) 清洗凝膠塊
取出凝膠塊放置於小培養皿中，用 TE buffer 清洗凝膠塊，100 rpm，每次 30 分鐘，重複4 次，清洗後之凝膠塊 4℃保存於 TE buffer 中。
(4) 限制酶切割反應
將凝膠塊切成適當大小 (寬度約 1mm)，放入 1.7 ml 離心管，並加入下列試劑：
項目 體積量(μl)
二次水 133.5
10 × buffer 15
Restriction enzyme (SmaI) 1.5
總體積 150
置於25℃下隔夜反應。
(5)脈衝式電泳
去除隔夜反應完後的限制酵素溶液，加入1 ml TE buffer 在 37℃反應 1 小時，製備 1％ PFGE agarose gel，電泳條件如下：
Switch time: 5~60 sec Time ramp: 20 hr Pulse angle: 120。 Vol: 6 V/cm Temperature: 14℃
電泳完成後以 EtBr 染色，在 UV-transilluminator 照相觀察，並以 BioNumerics software 分析結果。
3.2.10 LA PCR 1 材料
(1) 細菌染色體核酸 DNA
(2) 限制酵素 XbaI (New England BioLabs, Beverly, MA, USA) (3) Ethanol (JT Baker, Phillipsburg, NJ, USA)
(4) 70％ cold ethanol (JT Baker, Phillipsburg, NJ, USA) (5) Primers (Mission Biotech) (表八)
第一次PCR 反應
引子名稱 序列 (5’→3’) 位置
fusB 389-361R TTC CGA TTT GAT GCA AGT TCA TTC CAT CC 上游1
fusB 282-253R AAG TTT TTG CGG ACT AGG TAG TTC AAA AGG 下游2
fusB 437-467F GAG AAA TTT CTA ATC AGG TTG TAA AGG GG 下游1
fusB 531-559F CGG ATG GTC AAT ATG TAA AAA AAG GTG AC 下游2 第二次PCR 反應
引子名稱 序列 (5’→3’) 位置
fusB 554-581F GGT GAC TAT ATA TGT CGA GAT AGC ATT C 上游
fusB 222-193R GCT TCA ATT TCT TTG TTT GAT AAT CTG ATG 下游 (6) LA PCR in vitro Cloning Kit (Takara, Shuzo Co. Ltd, Japan)
(7) 瓊脂凝膠：LE agarose (Seakem, FMC Bioproducts Rockland, ME, USA) (8) 0.5× TBE buffer (Amereso Inc., Solon, Ohio, USA)
(4) 1000 bp ladder (Invitrogen, Paisley, UK) (5) 6× loading dye (MBI fermentas)
(6) Ethidium bromide (Amresco Inc.,Solon, Ohio, USA) 2 設備
(1) Digital cooler (Genepure technology, Taipei, Taiwan)
(2)PCR mahine ： PTC-100TM Programmable Thermal Controller (MJ Research, Watertown, MA, USA)
(3) 電泳裝置：Mupid-2 plus submarine electrophoresis system (Advance, Tokyo, Japan)
(4) 電泳膠影像分析系統：UV-transilluminator (Vilber Lourmat, Marne La Vallee, France)
(5) Centrifuge (Kubota 1920 centrifuge, Kubota, Tokyo, Japan) 3 方法
(1) 限制酵素切割
以分光光度計定量染色體核酸 DNA 吸光值，計算其濃度及所需加入的量，混 合下列試劑於1.7 ml 離心管：
項目 體積量 (μl)
二次水 至體積50 μl
10 × buffer 5
Restriction enzyme (50U) 2.5 μl
Chromosomal DNA 5 μg
總體積 50
37℃作用 1.5 小時後，加入 2.5 倍體積 (125 μl) 99％無水酒精，混合均勻後放 置-20℃ 1 小時，再以 14000 rpm 離心 10 分鐘，去除上清液後，加入 125 μl 70％酒 精，以14000 rpm 離心 1 分鐘，接著以冷凍乾燥機離心抽乾，加入 10 μl ddH2O，
放置室溫回溶。
(2) 接合反應 (ligation reaction) 混合下列試劑於0.2 ml 離心管中
項目 體積量 (μl)
經限制酵素切割後樣品 5
cassatte 2.5 Ligation solution I 15
Ligation solution II 7.5
總體積 30
置於16℃，隔夜進行接合反應。隔天加入 2.5 倍體積 (75 μl) 99％無水酒精，
置於-20℃ 1 小時後，以 14000 rpm 離心 10 分鐘，去除上清液後，加入 75 μl 70％
酒精，以14000 rpm 離心 1 分鐘，接著以冷凍乾燥機離心抽乾，加入 5 μl ddH2O，
放置室溫回溶，以此樣品進行第一次PCR 反應。
放置室溫回溶，以此樣品進行第一次PCR 反應。