第一章 緒論
1.4 表皮葡萄球菌的抗藥性島嶼 (resistance island；RI)
1.4 表皮葡萄球菌的抗藥性島嶼 (resistance island；RI)
抗藥性島嶼是帶有抗藥基因的基因島嶼，含有 fusB 的抗藥性島嶼 SaRIfusB在 epidemic European fusidic acid-resistant impetigo clone (EEEFIC)中被發現(38)。表皮 葡萄球菌的 fusB 在 PI-like 的基因序列，在已發表的 4 株帶有 fusB 的表皮葡萄球菌
中發現 fusB 皆位在 phage-related resistance island，這些抗藥性島嶼中，依據不同的 aj1 長度，至少可分成 3 種 aj1-leader peptide (LP)-fusB，第一型 aj1-LP-fusB 具有全 長的 aj1，第二型 aj1-LP-fusB 的 aj1 的 93-421 核苷酸被 truncated 掉，第三型 aj1-LP-fusB 只剩下游 37 核苷酸 (圖一) (11)。
表皮葡萄球菌的抗藥性島嶼全長大小約為15 kb～17.5 kb，G＋C content 約為 29.3％～30.2％，在抗藥性島嶼的兩側含有 direct repeat (DR)並且帶有 conserved core gene，包含 integrase 和其他葡萄球菌抗藥性島嶼相關的蛋白質(11)，Mobile genetic element (MEGs)被認為是抗藥性或毒力基因 mobile carrier，因此表皮葡萄球 菌中夫西地酸的抗藥性島嶼可能在葡萄球菌屬或是其他菌種間抗藥性的傳播扮演 重要角色。
第二章 實驗目的及實驗設計
2.1 實驗目的
夫西地酸 (fusidic acid)在臨床上主要用於治療葡萄球菌引起的皮膚感染和較 為嚴重的全身性症狀，夫西地酸抗藥菌株的產生會限制其在臨床的使用。
分析臺大醫院夫西地酸抗藥性菌株，表皮葡萄球菌的盛行率，每年約為 39％
～46％，高於金黃色葡萄球盛行率 3％～6％(10)，Chen 等人於 2011 年發表之報 告中表皮葡萄球菌為隨機選自臺大醫院 2003~2007 年菌株，菌株數較為不足，因 此本實驗室已針對 2008 年菌株做一較完整分析(54)。為長期追蹤菌株有無差異，
繼續分析臺大醫院2009 年所有表皮葡萄球菌夫西地酸抗藥菌株
2.2 實驗設計
本實驗主要分析 2009 年臺大醫院表皮葡萄球菌夫西地酸抗藥基因分布，首先 利用特異性PCR、PCR-RFLP、16S rRNA 定序、瓊脂圓盤擴散法 (disk diffusion test) 和瓊脂稀釋法 (agar dilution method)鑑定確認夫西地酸抗藥表皮葡萄球菌，接著以 PCR 分析 fusB、fusC、fusD 基因；定序分析 fusA 點突變位點，進一步對含有 fusB 基因菌株做 aj1-LP-fusB PCR 分型，南方墨點法偵測 fusB 基因，觀察 3 種 aj1-LP-fusB 亞型與未知型不同的大小片段，夫西地酸最小抑菌濃度 (Minimum Inhibitory Concentration)與抗藥基因間的關聯性。利用已知表皮葡萄菌抗藥性島嶼基因序 列，設計8 對核酸引子分析抗藥菌株 fusB 的 insertion site (groEL 或 rpsR)，最後利 用脈衝式電泳 (pulsed-field gel electrophoresis)分析夫西地酸抗藥表皮葡萄球菌菌 株間的差異，並分析 aj1-LP-fusB 未知型菌株抗藥性島嶼結構。
第三章 實驗方法與材料
3.1 菌株培養及保存 實驗所用菌株：
3.1.1 臨床菌株
臺大醫院 2009 年表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis)之臨床分離菌株 共143 株，其中 53 株經細菌室鑑定為夫西地酸抗藥，刪除 6 株重複檢體後，分離 47 株夫西地酸抗藥表皮葡萄球菌進一步利用 PCR-RFLP(18)、表皮葡萄球菌特異性 PCR 鑑定菌種(27)和藥敏試驗，確認共有 40 株 (29.4％)為對夫西地酸抗藥之表皮 葡萄球菌，其中39 株含有 fusB。
40 株夫西地酸抗藥之表皮葡萄球菌臨床菌株，其中 1 株來自腦脊髓液 (CSF)，
其餘39 株皆從血液分離出來 (表七)。
3.1.2 參考菌株
參考菌株 (ATCC, American Type Culture Collection) Staphylococcus aureus 25923
Staphylococcus aureus 29213 Staphylococcus epidermidis 35984
3.1.3 菌種培養及保存
在5％ CO2、37℃環境下，以 LB 瓊脂培養基 (BBL, Cockeysville, Maryland, USA)隔夜培養。收集純種菌株於含有 17％甘油(Glycerol, WAKO)的 BHI (Brain Heart infusion broth)中，保存於-70℃。
3.2 實驗方法
3.2.1 染色體核酸 (chromosomal DNA)萃取 1 材料
(1) 菌株：2009 年臺大醫院夫西地酸抗藥表皮葡萄球菌臨床菌株 (2) Cell suspension solution pH＝7.5, 10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA
(3) Cell lysis solution pH＝8.5, 200 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 35 mM SDS (4) Protein precipitation solution 10 mM NH4OAC
(5) Lysozyme (Bio Basic Inc., Markham Ontario, Canada)：100 mg/ml (6) Lysostaphin (Sigma, Deisenhofen, Germany)：5 mg/ml
(7) RNase A solution (Clontech, Palo Alto, CA, USA)：1 mg/ml (8) 100％ isopropanol (Echo Chem. Co., Miaoli, Taiwan) (9) 70％ cold ethanol (JT Baker, Phillipsburg, NJ, USA) 2 設備
(1) 冷凍乾燥機 (Heto Drywinner, Copenhagen, Denmark) (2) 離心機 (Kubota 1920 centrifuge, Kubota, Tokyo, Japan) .3 方法
吸取1.5 ml 隔夜培養之細菌懸浮液至 1.7 ml eppendorf，14000 rpm 離心 2 分 鐘；去除上清液後加入600 μl cell suspension solution，vortex 震盪使其懸浮均勻，
並加入10 μl lysozyme 和 0.5 μl lysostaphin，上下搖晃使之混勻，置於 37℃反應 1.5 小時後，14000 rpm 離心 2 分鐘，去除上清液並加入 600 μl cell lysis solution，置於 80℃反應 20 分鐘，降至室溫後加入 5 μl RNase A 於 37℃反應 30 分鐘，再加入 200 μl protein precipitation solution，混勻後離心 14000 rpm 20 分鐘；吸取上清液至另一 eppendorf 並加入 600 μl isopropanol，於-20℃反應 1 小時，以 14000 rpm 離心 10 分 鐘；去上清液，加入600 μl 70％ cold ethanol，14000 rpm 離心 1 分鐘，最後以冷 凍乾燥機離心抽乾，加入30 μl ddH20 於室溫隔夜回溶，保存於 4℃。
3.2.2 聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction；PCR) 1 材料
(1) 菌株：表皮葡萄球菌 DNA
(2) Recombinant TaqDNA polymerase (TakaRa, Tokyo, Japan) (3) LE agarose (Seakem, FMC Bioproducts Rockland, ME, USA) (4) DNA marker：100 bp ladder (Invitrogen, Paisley, UK)
(5) 0.5× TBE buffer (Amereso Inc., Solon, Ohio, USA) (6) Loading dye (MBI fermentas)
(7) Ethidium bromide (Amresco Inc.,Solon, Ohio, USA) (8) Primers (Mission Biotech) (表八)
2 設備
(1) PCR 反應機器：PTC-100TM programmable Thermal Controller (MJ Research, Watertown, MA, USA)
(2) 電泳裝置：Mupid-2 plus submarine electrophoresis system (Advance, Tokyo, Japan)
(3) 電泳膠影像分析系統：UV-transilluminator (Vilber Lourmat, Marne La Vallee, France)
3 方法
(1)混合下列試劑於無菌 0.2 ml 試管
項目 總體積(μl)
無菌二次水 20.5
10× PCR buffer 2.5
dNTP 混合液 0.5
Primer (F) 0.5
Primer (R) Taq DNA polymerase
0.5 0.1
Template DNA 0.5
總體積 25
(2) 將 0.2 ml 試管置於 PCR 機器中進行反應 94℃ 30 秒
94℃ 7 分鐘 → a50℃ 30 秒 30 次循環 → 72℃ 10 分鐘 →4℃保存 72℃ b30 秒
a根據primer 條件，annealing 溫度會有所變動
b根據PCR 產物大小，extension 時間會有所變動
(3) 反應後之 PCR 產物以 1％或 1.2％瓊脂凝膠電泳進行分析
3.2.3 純化 PCR 產物 1 材料
(1) Gel/PCR DNA fragments extraction kit (Geneaid, Taoyuan, Taiwan) 2 設備
(1) 離心機 (Kubota 1920 centrifuge, Kubota, Tokyo, Japan)
(2) 電泳膠影像分析系統：UV-transilluminator (Vilber Lourmat, Marne La Vallee, France)
(3) 乾熱器 (Gen-probe, San Diego, CA, USA) 3 方法
(1) Gene clean up
加入 DF buffer (PCR 產物五倍體積)至 PCR 產物中，混合均勻後，加入已架置 collection tube 上的 DF column 中，14000 rpm 離心 2 分鐘，去除廢液，加入 600 μl wash buffer 至 DF column 中，14000 rpm 離心 1 分鐘，去除廢液；再以 14000 rpm 離心10 分鐘，去除殘餘酒精，之後將 DF column 移置新的 1.5 ml 微量離心管中，
加入50℃預熱過之 20 μl 二次水。室溫靜置 10 分鐘後，14000 rpm 離心 10 分鐘，
純化後產物保存於2-8℃。
(2) Gel extraction
在電泳膠影像分析系統以刀片切下特定大小片段的 DNA 片段，放入 1.5 ml
微量離心管中，加入500 μl DF buffer 至於 65℃乾熱器上，每隔 2 分鐘上下反轉使 其均勻混合，待電泳膠完全溶解後，加入已架置collection tube 上的 DF column 中，
14000 rpm 離心 2 分鐘，去除廢液，加入 600 μl wash buffer 至 DF column 中，14000 rpm 離心 1 分鐘，去除廢液；再以 14000 rpm 離心 10 分鐘，去除殘餘酒精，之後 將DF column 移置新的 1.5 ml 微量離心管中，加入 50℃預熱過之 20 μl 二次水。室 溫靜置10 分鐘後，14000 rpm 離心 10 分鐘，純化後產物保存於 2-8℃。
3.2.4 核酸定序
將PCR 純化後產物溶於 ddH2O，濃度約為 1~2 ng/100bp，置於 200 ul 微量離 心管中，分別加入1 μl forward 或 reverse primer (10 pmol)，送至臺大醫院醫學研究 部第二共同研究室定序。定序結果再以DNAMAN、SeqSanner 軟體進行分析。
3.2.5 PCR-RFLP 1 材料
(1) 菌株：表皮葡萄球菌 DNA
(2) Recombinant TaqDNA polymerase (TakaRa, Tokyo, Japan)：TaqDNA polymerase, 10× PCR buffer, dNTP mixture
(3) LE agarose (Seakem, FMC Bioproducts Rockland, ME, USA) (4) DNA marker：100 bp ladder (Invitrogen, Paisley, UK)
(5) 0.5× TBE buffer (Amereso Inc., Solon, Ohio, USA) (6) Loading dye (MBI fermentas)
(7) Ethidium bromide (Amresco Inc., Solon, Ohio, USA) (8) Primers (Mission Biotech) (表八)
(9) 限制酵素 ApaI (New England BioLabs, Beverly, MA, USA) 2 設備
(1) PCR 反應機器：PTC-100TM programmable Thermal Controller (MJ Research,
Watertown, MA, USA)
(2) 電泳裝置：Mupid-2 plus submarine electrophoresis system (Advance, Tokyo, Japan)
(3) 電泳膠影像分析系統：UV-transilluminator (Vilber Lourmat, Marne La Vallee, France)
3 方法
(1)混合下列試劑於無菌 0.2 ml 試管
項目 總體積(μl)
無菌二次水 20.5
10× PCR buffer 2.5
dNTP 混合液 0.5
Primer (F) 0.5
Primer (R) Taq DNA polymerase
0.5 0.1
Template DNA 0.5
總體積 25
(2) 將 0.2 ml 試管置於 PCR 機器中進行反應
94℃ 30 秒 94℃ 30 秒
94℃ 3 分鐘 → 45℃ 30 秒 5 次循環 → 50℃ 30 秒 30 次循環 72℃ 60 秒 72℃ 60 秒
→72℃ 3 分鐘 →4℃保存 1% 瓊脂凝膠電泳確認結果 (3) 限制酵素切割作用
混合下列試劑於1.7 ml 離心管：
項目 總體積 (μl)
PCR 產物 8
ApaI 1
10× buffer 1
總體積 10
置於50℃反應 3 小時，最後以 2％ 瓊脂凝膠電泳確認限制酵素作用切割的不同片 段。
3.2.6 瓊脂圓盤擴散法 (disk diffusion test) 1 材料
(1) 菌株：2009 年臺大醫院表皮葡萄球菌臨床菌株 (2) 標準菌株：Staphylococcus aureus ATCC 25923 (3) BHI broth (Brain heart infusion, Difco)
(4) MHA (Mueller-Hinton agar, Difco) (5) Fusidic acid disc
2 方法
將表皮葡萄球菌接種於LB 瓊脂培養基 (BBL, Cockeysville, Maryland, USA)，
37℃ CO2隔夜培養，隔日以棉棒挑取適當菌落懸浮於BHI (Brain heart infusion)，
濃度調整至0.5 McFarland 後，以三向畫法均勻塗抹菌液於 MHA 上，以滅菌後的 鎳子將藥錠平貼於塗抹菌液後的MHA 上。35℃培養 16-18 小時後，測量抑制圈大 小。
3.2.7 瓊脂稀釋法 (agar dilution method) 1 材料
(1) 菌株：2009 年臺大醫院表皮葡萄球菌臨床菌株 (2) 標準菌株：Staphylococcus aureus ATCC 29213 (3) BHI broth (Brain heart infusion, Difco)
(4) MHA (Mueller-Hinton agar, Difco)
(5) Fusidic acid (Leo Pharmaceutical Products, Ballerup, Denmark) 2 設備
(1) 36 孔蓋菌盤
(2) 自動多點接種機 (AQS Manufacturing, West Sussex, UK) 3 方法
(1) 藥物 stock 稀釋：
夫西地酸粉末（10240 μg/ml, purity：99.7％），秤取0.05135 g Fusidic acid 粉末 溶解在5 ml 95％酒精，混勻後用 0.2 μm 過濾器過濾，分裝儲存在-20℃。
(2) 培養基
配置Mueller-Hinton agar (MHA)，滅菌後放置 50℃水浴槽。
(3) 夫西地酸溶液序列稀釋與培養基製備
空管滅菌烘乾後，將 10240 μg/ml 的夫西地酸 stock 溶液在空管中兩倍序列稀 成0.3-1280 μg/ml。取 1.5 ml 不同濃度夫西地酸溶液至培養皿中，加入 13.5 ml 的 MHA 混合均勻。
(4) 接種
細菌經 37℃ 5％ CO2隔夜培養後，隔日以棉棒挑取適當菌落懸浮於BHI (Brain heart infusion)，濃度調整至 0.5 McFarland (菌量約 1.5×108 CFU/ml)。36 孔蓋菌盤 (接種針接種體積約 0.3 μl；菌量約 1.55×104/SPOT) 烘乾後，用 dropper 將調好的 0.5 McFarland 菌液吸到接種盤中。接種順序為：生長對照組 (不含抗生素)；13 片 抗生素濃度由低而高的 MHA 培養基，待培養基上菌液乾後倒置，在無 CO2培養 箱35℃培養 16-20 小時。
3.2.8 南方墨點法 (southern blot) 1 材料
(1) 細菌染色體核酸 DNA
(2) 限制酵素 BamHI、EcoRI、HindIII、SalI、PstI、XbaI (New England BioLabs, Beverly, MA, USA)
(3) 瓊脂凝膠：LE agarose (Seakem, FMC Bioproducts Rockland, ME, USA) (4) 0.5× TBE buffer (Amereso Inc., Solon, Ohio, USA)
(5) DIG Molecular Weight Marker II, DIG-labeled (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany)
(6) 6× loading dye (MBI fermentas)
(7) Ethidium bromide (Amresco Inc.,Solon, Ohio, USA)
(8) 尼 龍 膜 Nylon membrane ： HyboundTM-N+ (Amershamm, Buckinghamshire, English)
(9) Depurination solution：0.25 M HCl
(10) Denaturation solution：1.5 M NaCl, 0.5M NaOH
(11) Neutralizing solution：pH＝7.5, 1.0 M Tris, 1.5 M NaCl (11) 20× SSC：3.0 M NaCl, 0.5 M Sodium citrate
(12) DIG Easy Hyb (Rhche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany)
(13) PCR Dig Labeling Mix (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany) (14) Primers (Mission Biotech) (表八)
(15) Recombinant TaqDNA polymerase (TakaRa, Tokyo, Japan)：TaqDNA polymerase, 10× PCR buffer, dNTP mixture
(16) 100 bp ladder (Invitrogen, Paisley, UK)
(17) Gel/PCR DNA fragment extraction kit (Geneaid, Taoyuan, Taiwan) (18) High salt solution：2× SSC, 0.1％ SDS
(19) Low salt solution：0.1× SSC, 0.1％ SDS
(20) Maleic acid buffer：pH＝7.5, 0.1 M meleic acid, 0.15 M NaCl (21) Blocking solution (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany)
(22)Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany)：用 1× blocking solution 以 1：10000 稀釋
(23) Wash buffer：pH＝7.5, 0.1 M Maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.3％ Tween 20 (24) Detection buffer：pH＝9.5, 0.1 M Tris, 0.1 M NaCl
(25) CSPD (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany)：用 1× detection buffer 以
1：100 稀釋 2 設備
(1) 水浴槽 (shaking bath, TKS, Taipei, Taiwan)
(2) 電泳裝置 Mupid-2 plus submarine electrophoresis system (Advance, Tokyo, Japan)
(3) Vacuum Blotting System (VacuGene XL, Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) (4) UV crosslinker (UVC500, Hoefer, San Francisco, CA, USA)
(5) PCR machine：PTC-100TM Programmable Thermal Controller (MJ Research, Watertown, MA, USA)
(6) UV-transilluminator (Vilber Lourmat, ,Marne La Vallee, France) (7) Centrifuge (Kubota 1920 centrifuge, Kubota, Tokyo, Japan) (8) Cassette (Kodak, New York, USA)
(9) Falcon tube (greiner bio-one, Frickenhausen, Germany)
(10) Hybridization incubator model 1000 (Robbins Scientific, Sunnyvale, CA, USA) (11) 冷光偵測儀
3 方法
(1) 限制酵素切割反應 (restriction enzyme digestion)
用分光光度計定量染色體核酸 DNA 濃度，並將下列試劑混合於無菌 1.7 ml 離 心管，混合均勻後置於37℃反應 1.5 小時。
項目 體積量(μl)
染色體核酸DNA 1 μg
限制酵素 1
10× 限制酵素緩衝液 2
二次水 0-16
總體積 20
(2) 瓊脂凝膠電泳 (agarose gel electrophoresis)
製備兩片 1％ 瓊脂凝膠，將限制酵素反應完後的產物與 loading dye 混合均
勻，分別取15 μl 與 5 μl 置於瓊脂凝膠上，以 100 伏特電壓分離染色體核酸 DNA。
將含有5 μl 限制酵素產物之 1％ 瓊脂凝膠以 Ethidium bromide 染色，確認限制酵
素切割完全，之後將含有15 μl 限制酵素切割後產物之瓊脂凝膠製備雜交轉移膜。
(3) 置備雜交轉移膜 (hybridization transfer membrane)
將電泳完之瓊脂凝膠至於保鮮盒中，加入 Depurination solution 反應作用至 dye
的顏色從藍色變黃色，約5 分鐘，此步驟使染色體核酸 DNA 更易於瓊脂凝膠轉移
至尼龍膜上，倒掉Depurination solution 後，加入 Denaturation solution，使染色體 核酸DNA 雙股打開成單股，反應作用至 dye 的顏色從黃色變藍色，約 15 分鐘，
倒掉Denaturation solution 後，加入 Neutralizing solution，作用 15 分鐘。利用 Vacuum Blotting System 抽氣一小時，將瓊脂凝膠上的染色體核酸 DNA 轉移至尼龍膜，接 著進行UV crosslinkage。將 UV crosslink 完的尼龍膜放入含有 5 ml DIG Hyb Falcon tube 中，於 Hybridization incubator 42℃隔夜反應。
(4) 探針置備與純化 (probe)
將下列試劑混合於無菌0.2 ml 薄壁試管
項目 體積量(μl)
二次水 38
10× PCR buffer 5
PCR DIG-dNTP 混合液 3
Primer (F) 1.5
Primer (R) 1.5
Taq DNA polymerase 0.2
Template DNA 1.5
總體積 50
將試管置於PCR 機器，進行反應：
94℃ 30 秒
94℃ 7 分鐘 → 50℃ 30 秒 30 次循環 → 72℃ 10 分鐘 →4℃保存 72℃ b30 秒
反應後之PCR 產物以 1.2％瓊脂凝膠電泳分析，之後將 PCR 產物進行純化。
(5) 南方雜交 (southern hybridization)
PCR 純化後產物，以 94℃反應 10 分鐘，使探針成單股狀態，之後置於冰上 10 分鐘，避免探針回復成雙股，將純化處理好之 probe 加入 DIG Easy Hyb 混合均 勻，和尼龍膜42℃隔夜反應。
PCR 純化後產物，以 94℃反應 10 分鐘，使探針成單股狀態，之後置於冰上 10 分鐘，避免探針回復成雙股，將純化處理好之 probe 加入 DIG Easy Hyb 混合均 勻，和尼龍膜42℃隔夜反應。