4.1 夫西地酸抗藥表皮葡萄球菌盛行率
臺大醫院 2009 年表皮葡萄球菌臨床菌株共 143 株，其中 53 株經細菌室鑑定 為夫西地酸抗藥。刪除6 株重複檢體後，進一步利用 PCR-RFLP(18, 44)、表皮葡 萄球菌特異性PCR (27)和 16S rRNA 定序(47)鑑定菌種，其中 1 株為 S. capitis subsp.
urealyticus，接著利用藥敏試驗：瓊脂圓盤擴散法 (disk diffusion test)及瓊脂稀釋法 (agar dilution method)，確認共有 40 株 (40/136, 29.4％)對夫西地酸抗藥之表皮葡萄 球菌。
4.2 夫西地酸抗藥菌株 mecA 和 icaAB 分析
研究不同檢體來源 (contaminating strains、sepsis-related strains、catheter strains 和saprophytic strains) 的表皮葡萄球菌毒力基因，發現來自手部和健康自願者的表 皮葡萄球菌 (contaminating strains)和其他具有臨床意義的檢體來源菌株相比，含有 毒力基因 (mecA 和 icaAB)的比率較小(14)，mecA 基因和 methicillin 抗藥性的產生 有關(31)，而 icaAB 基因則會影響細菌形成生物膜，細胞聚集的能力(19)。利用毒 力基因：mecA 和 icaAB 可用來區分菌株為較具侵略性 (invasive)的菌株或是汙染 (contaminating)的菌株。分析 2009 年臺大醫院 40 株夫西地酸抗藥臨床菌株 mecA 和 icaAB 基因，含有 mecA 基因 (40/40，100％)及 icaAB 基因 (34/40，85％)，而 來自健康者手部表皮葡萄球菌株 mecA 基因 (5/16，12.5％)及 icaAB 基因 (2/16，
31.25％) (表三)，顯示本實驗操作之臨床菌株是具有臨床意義的表皮葡萄球菌。
4.3 夫西地酸抗藥基因分布 (fusA、fusB、fusC、fusD)
40 株夫西地酸抗藥表皮葡萄球菌株，利用 PCR 及定序分析其抗藥基因，表皮 葡萄球菌抗藥基因主要以 fusB 為主，39 株含有 fusB (97.5％)，1 株含有 fusA (2.5
％)點突變 P404L (表一)，無菌株含 fusC 或 fusD。
4.4 分析 fusB 抗藥基因
1. aj1-LP-fusB PCR 分型 (type I、type II、type III)
表皮葡萄球菌 fusB 旁基因序列可依照不同的 aj1 片段大小分成 3 種亞型，第 一型 aj1-LP-fusB 為全長的 aj1，第二型 aj1-LP-fusB 為 aj1 93 到 421 核苷酸 truncated 掉，但是能夠轉譯較小的蛋白質，第三型 aj1-LP-fusB 的 aj1 只剩下游的 37 個核苷 酸(11) (圖一)。39 株含有 fusB 基因之表皮葡萄球菌株，其中 2 株為第一型 aj1-LP-fusB (5.1 ％ ) ， 18 株 為 第 二 型 aj1-LP-fusB (46.1 ％ ) ， 15 株 為 第 三 型 aj1-LP-fusB (38.5％)，4 株為未知型 (10.3％) (表一)。
2. 南方墨點法偵測 fusB 基因
為確認含有 fusB 基因的表皮葡萄球菌菌株是否含有類似結構，因此利用限制 酵素 (HindIII)切割，fusB 基因作為探針來偵測。2 株第一型 aj1-LP-fusB 的片段大 小分布大約2～4 kb；18 株第二型 aj1-LP-fusB 的片段大小約為 4 kb 左右；15 株第 三型 aj1-LP-fusB 的片段大小＞23 kb；4 株 aj1-LP-fusB 未知型的片段大小分布在 6
～23 kb 之間，其中 1 株介於 9～23 kb，其餘 3 株介於 6～9 kb (圖二)。
3. fusB 的 insertion site (groEL 或 rpsR)
利用已知表皮葡萄球菌之抗藥性島嶼序列，設計 8 對核酸引子 (表八)，分別 設計引子黏接RI 上游基因 groEL 或 rpsR 與嵌和酶 int (upstream PCR)、嵌合酶基 因 (integrase PCR) 、 fusB 和 下 游 基 因 (downstream PCR) 和 上 游 和 下 游 基 因 (chromosome PCR)，以 PCR 偵測 fusB 基因的 insertion site(11)，39 株含有 fusB 基 因的表皮葡萄球菌，fusB 基因大部分位於 groEL 下游 (33/39，84.6％)，有 1 株第 二型 aj1-LP-fusB 表皮葡萄球菌位於 rpsR 下游 (1/39，2.6％)，剩下 5 株表皮葡萄 球菌的insertion site 未知，其中 1 株為第一型 aj1-LP-fusB，4 株為 aj1-LP-fusB 未 知型菌株 (表二)。
4.5 夫西地酸最小抑菌濃度 (Minimum Inhibitory Concentration)
利用瓊脂稀釋法 (agar dilution method)分析 40 株夫西地酸抗藥菌株的最小抑
菌濃度，其中帶有 fusB 基因的菌株 MIC 範圍介於 2～16 μg/ml 之間，帶有 fusA 點 突變的菌株MIC 為 16 μg/ml。
分析 aj1-LP-fusB 亞型和 MIC 之間的關連性，第一型 aj1-LP-fusB MIC 主要為 8 μg/ml (2/2，100％)；第二型 aj1-LP-fusB MIC 介於 8～16 μg/ml ，其中 5 株為 8 μg/ml (6/19，31.6％)，13 株為 16 μg/ml (13/19，68.4％)；第三型 aj1-LP-fusB MIC 介於 2
～16 μg/ml，其中 1 株為 2 μg/ml (1/14，7.1％)，1 株為 4 μg/ml (1/14，7.1％)，8 株 為8 μg/ml (7/14，50％)，5 株為 16 μg/ml (5/14，35.7％) (表一)。
4.6 脈衝式電泳分型
利用脈衝式電泳 (pulsed-field gel electrophoresis)分析臺大醫院 2009 年表皮葡 萄球菌夫西地酸抗藥菌株的菌株間差異，並以 BioNumerics software 分析菌株的 pulsotypes，以 UPGMA 演算法 (based on Dice similarity index)，在＞80％相似性的 情形下，40 株菌株可以分成 18 群集 (clusters)，結果顯示，沒有最主要的一種 pulsotype，且不同的 aj1-LP-fusB 亞型和 insertion site 皆在不同的 pulsotypes，顯示 表皮葡萄球菌的感染並非單一菌株傳播 (圖三)。
4.7 aj1-LP-fusB 未知型 NTUH857 fusB 旁基因結構
在 40 株夫西地酸抗藥表皮葡萄球菌中，有 4 株為 aj1-LP-fusB 未知型，同時 其insertion site 也未知，顯示 aj1-LP-fusB 未知型抗藥性島嶼基因結構可能和已發 表的4 株表皮葡萄球菌抗藥性島嶼不相似，利用 LA PCR 及 inverse PCR 分析其中 一株未知型菌株NTUH857 fusB 旁基因序列。
Composite SeRIfusB-857 (S. epidermidis resistance island carrying fusB in NTUH857) 全長為21609 bp，由 28 個 putative ORFs 和△aj3 組成，G+C content 為 30.48％，
位於 smpB 下游，smpB 會轉譯出 SsrA-binding protein，是 RNA-binding protein，在 SsrA quality-control system 中和 tmRNA (SsrA)結合，對 SsrA 的結構穩定性和活性 扮演重要角色(1, 43)，另一端染色體上的基因為 Na+-transporting ATP synthase。嵌
和酶 (integrase)會辨認細菌染色體上的特定的 attc site 使致病性島嶼 (PIs)插入染 色體中，Composite SeRIfusB-857 的 attc site 為 TCCCGCCGTCTCCAT，位在金黃色葡 萄球菌全部基因序列18 分鐘的位置 (圖六)。
Composite SeRIfusB-857的基因結構主要可以分成兩個區域 (圖四)：(i) SeRIfusB-857
是由integrase 嵌入的基因序列，兩端為 15 bp 的 attc site，SeRIfusB-857長度約為15 kb，
包含 19 個 ORFs 和 1 個△aj3，其中致病性島嶼常見基因結構，由左至右為 integrase、2 個 transcriptional regulators、primase、terminase small subunit。此外
SeRIfusB-857 上帶有毒力因子 virulence-associated protein E 和抗藥基因 fusB。 (ii)
SeCI857 (S. epidermidis chromosomal insertion in NTUH857)是指在 transposase 後的基 因序列，SeCI857 前有 37 bp 的 invert repeat (IR)：CATACTAAGATTAGCTATG AAGAAATCTATGACGATA，SeCI857長度約為5 kb，共有 8 個 ORFs，包含 terminase small subunit 及 7 個 hypothetical proteins。Composite SeRIfusB-857帶有 attc site 和 trasposase，顯示其經過不只一次的 DNA insertion，形成複合式基因島嶼 (composite genomic island)。
和已發表的 4 株 SeRIfusB相比，SeRIfusB-857缺少 ri17、ri18 及 aj1 基因，其中
SeRIfusB-857的LP-fusB-aj2-△aj3 區域和 SeRIfusB-704較為相似，LP 與 aj2 基因序列和
SeRIfusB-704 100％相同，△aj3 基因序列相似程度約 76％，除了 LP-fusB-aj2-△aj3
區域相似程度較高外，其他區域的基因相似程度小於50％ (圖五)。和其他已發表
的 SePI 相比，SeRIfusB-857 的 fusB 上游和 Staphylococcus epidermidis 14.1.R1.SE ctg1131387704528 (GeneBank accession no. AGUC01000114) 相似程度較高，基因結 構皆有integrase、2 個 replication regulators、primase 和 terminase，此外也都含有 virulence-associated protein E (圖五)。SeCI857和 Staphylococcus epidermidis FRI909 (GeneBank accession no. AENR01000001 & no. AENR01000008) 較相似，帶有 terminase 和數個 hypothetical proteins，但 SeCI857的基因長度較短，和 Staphylococcus epidermidis FRI909 相比基因長度大約少 3kb，Staphylococcus epidermidis FRI909 帶 有2 個 transposase 及其相對應的 direct repeat，可能經過不只一次的 insertion。