第二章 實驗材料及方法 (Materials and Methods)
第二節 實驗方法
(一) 細胞培養（cell culture）
A. 培養液 DMEM
將 1 單位的DMEM powder 和3.7 g 的NaHCO3 溶於800 ml 滅菌 ddH2O，pH 值以HCl 調成7.1，再加滅菌 dd H2O 至1 liter 後，在hood 中以0.22 μm 的濾膜過濾後分裝，保存於 4℃。
B. 培養液添加物 1. Fetal bovine serum
將冷凍的血清靜置於水中，使其慢慢溶解後，於無菌操作檯 中分裝至50 ml 無菌離心管中，再用 parafilm 包覆瓶口，保存於 -20℃。
2. Penicillin-Streptomycin（10X；10000 unit/ml-10000 μg/ml）
每450 ml 的 DMEM 加 5 ml 的 Penicillin-Streptomycin。
3. L-Glutamine（10X；200 mM）
每450 ml 的 DMEM 加 5 ml 的 L-Glutamine。
C. PBS（phosphate balanced solution）
fresh medium 終止反應，上下吸、放數次，直到將細胞均勻打散，
並以1 : 2 或 1 : 3 的比例分盤培養。
2. 冷凍細胞：
培養好約八分滿的細胞，且冷凍細胞前一天需更換成新鮮的 培養液。首先將舊的培養液吸走，每次以3 ~ 5 ml 滅菌 1X PBS 沖洗細胞，共清洗三次。加入 8 ~ 10 ml 的培養液，將細胞全部沖 下來，再將細胞液吸取置於 50ml 離心管，離心（1000rpm，10
分鐘）之後將細胞沉澱下來。去除上清液之後，以 1 ml 冷凍培
養液將細胞上下吸、放數次，直到細胞被均勻打散，置於冷凍管，
先存放於 4℃冰箱 30 分鐘，再移置於 -80℃冰箱，12 小時之後 再存放於液態氮桶。
3. 解凍細胞：
由液態氮桶中取出細胞，將細胞溶於適量的DMEM 培養液，
離心2000 rpm 五分鐘。倒掉 DMEM 培養液，以 10 ml 的 DMEM 將細胞打散，隔天細胞貼附後再換培養液，約一個禮拜細胞穩定 後才可以做實驗。
(二) 收集cell lysates
A. 試劑：
主要溶液Lysis buffer（RIPA buffer），可將細胞裂解。以 4.38 g NaCl、3.0285g Tris-base、1.25g Deoxycholate、5 ml IGEPAL CA-630
（相當的粘稠，要緩慢的取）來配製。以上藥品溶於適量的二次水後，
將溶液配成500 ml pH 7.4，高溫高壓滅菌後保存於 4℃。每當要使用 前，必須將它配置成Modified RIPA buffer，若要配製成 1 ml，則需 要1 ml RIPA、10 μl 200 mM Sodium orthovannadate（final conc.= 1 mM）、5 μl 200 mM EGTA（final conc. = 1 mM）、10 μl 0.5% Aprotinin
（final conc. = 0.0025%）、4 μl 200 mM PMSF（final conc. = 1 mM）。
後面追加的是蛋白質水解酶抑制劑，包括 Sodium orthovannadate 是 phosphatase inhibitor，EGTA 是鈣離子的螯合劑， Aprotinin 是 serine protease inhibitor，PMSF 也是 serine protease inhibitor。
B. 步驟 :
1. 將 medium 吸走，每次以 1ml 1X PBS 清洗細胞，共兩次，之後再 將PBS 吸乾。
2. 依細胞存活量，加入適量 modified RIPA buffer（6 cm dish），利
用 刮 勺 來 回 將 細 胞 刮 下 （ 置 於 冰 上 操 作 ），再將細胞液置於 eppendrof，將 eppendrof 在 rack 上左右來回刮數次。
3. 以 4℃、12000 rpm，離心 10 分鐘，取上清液到新的 eppendorf，
3. 加 100 μl Protein Assay Kit（dye）到 eppendorfs，以 vortex 混合 均勻。
4. 在 sample 的測定上，取 5 μl cell lysates，395 μl d.d H2O，100 μl dye，混合均勻。
5. 採用 Bradford Protein Assay，測各種不同量之 BSA 在波長 595 nm
的吸光值，畫出標準曲線。再測樣本蛋白的O.D.值，求出 sample 的蛋白質濃度。
(四) 蛋白質電泳（SDS-PAGE）
A. 試劑 :
1. Acryamide 150 g N’N’-Methylene bisacryamide 4 g 將所需之化學藥品溶於350 ml d.d H2O
再加d.d H2O 至 500 ml，保存於 4℃。
2. Tris-HCl (2 M，pH 8.8) 500 ml Tris-HCl 121.14g 將Tris-HCl 溶於 350 ml d.d H2O，pH 調成 8.8
再加d.d H2O 至 500 ml。
3. Tris-HCl (2 M，pH 6.8) 500 ml Tris-HCl 121.14g 將Tris-HCl 溶於 350 ml d.d H2O，pH 調成 6.8
再加d.d H2O 至 500 ml。
4. 10% APS 10 ml
SDS 5 g
running buffer。
6. 將 sample 和 10X sample buffer （10 : 1）混和均勻，稍微 spin 一 下，然後煮沸5 分鐘。
7. 利用 micropipette，將 sample 加到 well 內，進行膠體電泳法 （50 V、20 mA，時間 18 小時；200 V、30 mA，時間 5 小時）。
(五) Western blot analysis
A. 試劑 :
再加d.d H2O 至 500 ml，保存於室溫。
1. 剪取適當大小的 PVDF transfer membrane，以 methanol 浸泡約 30 秒後，再以 d.d H2O 浸泡。
2. 利用 semi-phor transblotter 將電泳膠中的蛋白質 transfer 到 PVDF transfer membrane（25V、300 mA，1.5 小時）。
3. 將 PVDF transfer membrane 取出，浸泡於 30 ml blotting buffer
中，在室溫下置於 shaker 上 preblotting 1 小時（shaker 擺動速 度：5rpm）。
4. 將 blotting buffer 倒掉，加入 10 ml 含有 primary antibody （1：
1000）的 blotting buffer，置於 4℃作用 12 小時。
5. 隔天取出之後，在室溫下先置於 shaker 上作用 30 分鐘（shaker 擺動速度：5rpm），再以 washing buffer 清洗 membrane 三次，50 ml、5 分鐘；50 ml、5 分鐘；50 ml、10 分鐘（shaker 擺動速度:
50 rpm）。
6. 加入 10 ml 含 secondary antibody 的 blotting buffer（1:2000），室 溫 blotting 1.5 小時（shaker 擺動速度: 5 rpm）。
7. 再以 washing buffer 清洗 membrane 五次，50 ml、5 分鐘；50 ml、
5 分鐘；50 ml、10 分鐘；50 ml、15 分鐘；50 ml、15 分鐘（shaker 擺動速度: 50 rpm）。
8. 依 membrane 大小（0.125 ml/cm2），加入適量的 ECL kit solution I 與 II 等比例的均勻混和液。在 membrane 與之作用 5 分鐘後，
以 X-ray film 感光。