山胡椒果實(Litsea cubeba (Lour.) Pers.)
果實 35℃熱風乾燥 24 hrs
n-hexane (FHELC) Ethyl acetate (FEELC)
Methanol (FMELC) Water (FWELC)
熱水萃取
Steam distillation
水蒸氣蒸餾有機溶劑萃取法(SDE)
Simultaneous steam distillation-solvent extraction
一般成分分析
(二)山胡椒樣品之製備
1 水蒸氣蒸餾法(Steam distillation)萃取精油
取 250g 山胡椒全果置於水蒸氣蒸餾裝置(圖一)中，以水蒸氣作 為熱源，維持加熱 4 小時，當水蒸氣通過樣品時，揮發性成分與精油 即被水蒸氣帶出，最後冷凝則可得精油與水層，將精油與水的混合物 靜置分離後，精油再添加無水硫酸鈉去除多餘之水分，得到的精油保 存備用(Guenther 1952; Babu et al. 2005)。
2 水 蒸 氣 蒸 餾 有 機 溶 劑 萃 取 法 (Simultaneous steam distillation-solvent extraction)萃取精油
參考文獻之條件修飾後，取250g 山胡椒全果並加蒸餾水定量至 1000mL 後置入 Simultaneous steam distillation-solvent extraction (SDE) 裝置中(圖二)，溶劑瓶中則放入乙醚與正戊烷混合液 50mL(1：1，v/v)，
溶劑瓶以 40℃水浴進行加熱，當樣品之水蒸氣與溶劑瓶中溶劑混合，
使蒸氣中揮發性物質因極性關係而溶入溶劑中，冷凝後由於溶劑之比 重較輕，故迴流濃縮瓶中；而水則迴流至圓底燒瓶中，如此進行 2 小 時的萃取。最後將溶劑瓶取下後以蒸餾塔進行濃縮再加入無水硫酸鈉 去除多餘的水份後，得到的精油保存備用(Lee et al. 2004; Paramita et al.
2005)。
3 山胡椒粉末樣品之製備
將 新 鮮 未 經 處 理 之 山 胡 椒 與 經 水 蒸 氣 蒸 餾 法 (Steam distillation) 、 水 蒸 氣 蒸 餾 有 機 溶 劑 萃 取 法 (Simultaneous steam distillation-solvent extraction SDE)去除精油後之山胡椒，以 35℃熱風乾 燥24 hrs，磨粉過篩(20 mesh)，保存備用。
4 山胡椒甲醇萃取液之製備
取山胡椒粉末，以 1：10(w/v)之甲醇震盪萃取 12 小時後，收集 第一次萃取液，重複以上實驗，連續萃取 2 次，將所得萃取液合併過 濾後，保存備用。
5 山胡椒溶劑區分萃取液之製備
取山胡椒粉末，以 1：10(w/v)之溶劑量，依序以正己烷、乙酸 乙酯及甲醇等三種溶劑分別萃取12 hrs，連續萃取 2 次，將所得三種萃 取液過濾後，於40℃下減壓濃縮至乾，所得之濃縮物，將其定量至 100 mL 之甲醇中。另將經過有機溶劑萃取後之山胡椒殘渣分別以水(水：
乙醇(v/v)=4：1)常溫萃取 12 hrs，連續萃取 2 次，將所得萃取液合併過 濾後保存備用。
6 山胡椒熱水萃取液之製備
取 50 g 山胡椒粉末，加水定量至 1000 mL，加熱保持溫度在 100
℃，分別煮沸 3、5、10、20、30 min，所得萃取液經濾紙過濾後，得 到的濾液保存備用。
7 山胡椒抗菌實驗之精油製備
取 95%之乙醇，以無菌水稀釋使酒精濃度為 5%，最後以 5%酒 精將精油原液稀釋，分別稀釋為100 ppm、200 ppm、300 ppm、400 ppm、
500 ppm、600 ppm、700 ppm、800 ppm、900 ppm、1000 ppm 與 3000ppm 等不同濃度的精油抗菌液後進行抑菌試驗。
圖一、水蒸氣蒸餾法萃取裝置 Figure 1. Steam distillation instrument
圖二、水蒸氣蒸餾有機溶劑萃取法裝置
Figure 2. Simultaneous steam distillation-solvent extraction instrument
(三)山胡椒樣品之分析 1 一般成分分析
(1)水分(AOAC 1995)
精稱 3~5 g 之山胡椒，放置於恆重之秤量瓶中(W)，其總重為 W1。以烘箱進行熱風乾燥，將樣品置於 105 ℃之烘箱反覆乾燥、冷卻 至恆重(W2)。
水分含量(%)=[(W1-W2)/(W1-W)]×100
(2)粗脂肪(AOAC 1995)
將山胡椒以磨粉機磨碎，精稱 1~3 g(Ws)於秤量紙上，包起後放 入圓筒濾紙中，圓筒濾紙以脫脂棉塞住筒口，最後放入索氏萃取器中
（磨砂圓底燒瓶於 110℃中烘乾至恆重，並秤重(Wo)）。圓底燒瓶中加 入約2/3 的乙醚，組裝索氏萃取裝置，將脂肪抽出裝置放置於 50~60℃
恆溫水浴中不斷迴流萃取16 小時，待最後一次的乙醚由虹吸管迴流入 圓底燒瓶中時，迅速以鑷子取出索氏萃取裝置中的圓筒濾紙，繼續回 流回收乙醚，待乙醚回收後，圓底燒瓶於110℃烘箱中，重複乾燥至恆 重(W1)。
粗脂肪(%)=（W1- W0）/Ws×100%
(3)粗蛋白(AOAC 1995)
精秤已脫脂之山胡椒0.15 g加入催化劑K2SO4：CuSO4‧5H2O＝
10：1 一同放入分解瓶中，再慢慢加入濃硫酸 15mL後，將分解瓶置於 粗蛋白分解裝置上加熱至澄清並冷卻至室溫進行蒸餾。利用凱氏氮分 析儀進行蒸餾，蒸餾時，取4 ％的硼酸吸收液 20 mL，放入 250 mL三
角瓶中連接蒸餾裝置，使冷卻器出口浸入三角瓶的硼酸溶液中，蒸餾 前，先加入鹼液(50 % NaOH)至呈黑色後開始蒸餾，當凱氏氮分析儀蒸 餾完後，將三角瓶取下並加入3~5 滴混合指示劑馬上以 0.1 N H2SO4標 準溶液滴定至呈紅色為止。
粗蛋白(%)={[(B-A)/1000×F×14/S] ×100％}×D A＝滴定空白試劑所用的 0.1N H2SO4溶液mL數 B＝滴定Sample所用的 0.1N H2SO4溶液mL數 C＝樣品重量(g)
F＝0.1N H2SO4的濃度
D＝該 Sample 所含的含氮係數，採用種子的含氮係數 6.25 S＝Sample 重(g)
(4)灰分(AOAC 1995)
精秤 2~5 g 之山胡椒粉末(W)放入坩堝中秤重(W1)，置於 105℃
烘箱中乾燥。去除水分後在將樣品放置灰化爐中灰化(550~600℃)直到 樣品粉末成灰白色，降溫後將之移至乾燥器皿中冷卻至室溫後秤重 (W2)。
灰分含量(%)=[(W2-W1)/W] ×100
(5)碳水化合物
碳水化合物的結果利用扣除法得到，將百分之ㄧ百減去實驗得 到的水分、粗脂肪、粗蛋白與灰分之百分比後，則可得到碳水化合物 含量之百分比。
2 山胡椒萃取物抗氧化性質分析 (1)硫氰酸鐵法(Mitsuda 1966)
取不同濃度 0.5 mL山胡椒萃取物，加入 2.5 mL 0.2 M linoleic acid solution與pH 7 0.2 M phosphate buffer 2 mL，混合均勻，置於 37℃
烘箱內反應，每隔一段時間取出呈色。每段時間下分別取出0.1 mL上 述混合液，加入75 %甲醇 4.7 mL、30 %硫氰化氨 0.1 mL，及 0.02 M FeCl2
0.1 mL混合均勻，反應 3 分鐘後，測 500 nm下之吸光值。實驗另以不 添加樣品之空白試驗進行測試以作為空白組，並以Ascorbic acid、
BHA、α-tocopherol等樣品作為對照組。
由吸光值判定，吸光值越低者，表示測試樣品之抗氧化能力越 強，亦可以抑制過氧化(POV)百分比表示，其 POV 百分比抑制率越高 則表示抗氧化效果越佳。
過氧化物POV 抑制率=﹛1-［ A△ 500 nm (sample)/ A△ 500 nm (control)］﹜×100
(2)還原力測定(Shon et al. 2004)
取 2.5 mL 各種山胡椒萃取物，加入 2.5 mL 0.2 M pH 6.6 phosphate buffer 及 2.5 mL 1 %赤血鹽(Potassium hexacyano-ferrate (III))，於 50℃水浴下反應 20 分鐘立即快速冷卻。冷卻後再加入 2.5 mL 10 % trichloroacetic acid (TCA)溶液混合後，以 3000 rpm 離心 10 min 取 上層澄清液5 mL，並加入 5 mL 蒸餾水及 1 mL 0.1 % ferric chloride 溶 液混合均勻，反應10min 後，以分光光度計測定 700 nm 下之吸光值，
並以Ascorbic acid、BHA、α-tocopherol 作為樣品的對照組。
吸光值越高者，表示測試樣品之還原能力越強
(3)捕捉 DPPH 自由基能力之測定(Shimada 1992)
取4 mL 山胡椒萃取物，加入 1 mL 新鮮配製之 DPPH-MeOH 溶 液，DPPH-MeOH 溶液之濃度為 1 mM 或 3 mM，依樣品捕捉 DPPH 自 由基的效果進行DPPH-MeOH 濃度的調整，樣品與 DPPH-MeOH 溶液 均勻混合反應30min 後，以分光光度計測定 517 nm 下之吸光值，並以 Ascorbic acid、BHA、α-tocopherol 作為樣品的對照組比較。
Scavenging effect (％)=［(A517 nm of control)-(A517 nm of sample) / (A517 nm of control)］×100
(4)螯合鐵離子能力之測定(Shimada 1992)
取 4 mL山胡椒萃取物，加入 0.2 mL 2 mM的FeCl2及 0.4 mL 5 mM 的ferrozine，於室溫下反應 10 min後，立即以分光光度計測定 562 nm下之吸光值，並以EDTA作為樣品的對照組。
Chelating effect (％)=［(A562 nm of control)-(A562nm of sample) / (A562 nm of control)］×100
3 山胡椒萃取物之抗氧化成分分析
(1)總酚類化合物含量測定(Chu et al. 2002; Yang et al. 2004) 參考文獻的方法做些許的修正後進行實驗。實驗取0.5 mL山胡 椒萃取液並添加 2.5 mL的蒸餾水後，加入 0.5 mL之Folin-Clocalteu’s phenol reagent，均勻混合 3 分鐘後，再加入 20 % Na2CO3 2 mL反應，
靜置90 分鐘後以分光光度計於 760 nm測定吸光值，並配合gallic acid 的標準曲線(0.0~600.0μm/mL gallic)計算萃取物中的總酚類化合物含
量。
(2)類黃酮含量測定(Jia 1999 )
將文獻方法修飾以後進行實驗。實驗取 0.5 mL的山胡椒萃取 液，加入1.5 mL的蒸餾水與 0.1 mL 10 %的Al(NO3)3，再加入0.1 mL 1 M 的CH3COOK與 2.8 mL的蒸餾水，於暗室下靜置反應 40 分鐘後，測於 415 nm下，並利用Quercrtin-MeOH作為標準曲線對照樣品中類黃酮之 含量。
(3)抗壞血酸含量測定(Klein et al. 1982, Mau et al. 2004)
抗壞血酸的測定可利用染色劑 2,6-dichloroidophenol 被抗壞血 酸作用後由紅色轉為無色的方法測定。取100 mg 山胡椒粉末，以 10 mL, 1 %偏磷酸(metaphosphoric acid)萃取 45 分鐘，取 1 mL 萃取液加入 9 mL 2,6-dichloroidophenol 反應，於 15 秒內以分光光度計測定 515 nm 下的 吸光值。並以不同濃度的抗壞血酸計算出標準曲線後，對照計算樣品 中抗壞血酸的含量。
4 山胡椒精油組成分析
實驗利用水蒸氣蒸餾法與水蒸汽蒸餾有機溶劑萃取法萃取精 油，所收集到的精油，利用氣相層析儀(GC)及氣相層析質譜儀(GC/MC) 參考周永紅等 (2003)的精油成分分析條件加以修改後進行山胡椒果實 精油的組成分析。
氣相層析儀(Gas chromatograph, GC)條件如下 GC: Varian 3400
Column: SPB-1TM fused silica capillary 30 m 0.25 mm 0.25μm Carrier: N2
Temp. program: 70℃ 1 min 3℃/180℃
Injector/Detector(FID): 250℃
氣相層析質譜儀(GC/MC)條件如下 GC/MS: Varian 3800 /Varian 2200
Column: CP-sil 5 CB low BLEED/MS 60m 0.32mm 0.25μm Carrier: He 1.0 mL/min
Temp. program: 70℃ 1min 3℃/180℃
Injection volume: 1.0 microliters Split ratio: 40:1
Mas Quad: 150℃
Electron impact valtage: 70eV electron impact ionization Scan parameters: 30 amu~550 amu
5 山胡椒精油抗菌試驗
實驗採 B. subtilis (BCRC 10255)、E. aerogenes (BCRC 10370)、
E. cloacae (BCRC 10401)、E. coli (BCRC 10314、BCRC 10675)、K.
oxytoca (BCRC 13985)、P. aeruginosa (BCRC 10944)、S. aureus (BCRC 10780、 BCRC 10781)與等不同菌株分別進行抗菌實驗。利用 96 孔微 量盤進行實驗，將原精油分別稀釋為0~3000 ppm 等不同濃度測定，測 定方式參考陳 2006 與 Wilson et al. 1997 之方法，測定樣品與菌株混合 液在590 nm 下的吸光值，吸光值越高則表示抗菌效果越差，實驗測定 0~54 小 時 間 的 吸 光 值 ， 最 後 決 定 最 小 抑 制 濃 度 (MIC ； minimum
inhibitory concentration)與 IT (inhibitory time)。
MIC(minimum inhibitory concentration)定義：抑菌分子將受測菌體限制 在遲滯期(lag phase)至少 48 小時以上所需的最低濃度。
IT 定義(inhibitory time)：菌株生長在遲滯期(lag phase)所延長的時間。
6 統計分析
實驗數據使用 SPSSwin 10.0 軟體進行統計分析，以 Duncan 判 定其差異顯著性。
肆、結果與討論
先前已有許多學者研究山胡椒，但其主要在果實之精油與樹皮 成分分析的研究上，山胡椒果實的研究尚未有完整之報告。因此本研 究以新鮮山胡椒果實，進行一般成分分析，再利用不同溶劑萃取山胡 椒，所得山胡椒萃取液探討其抗氧化性，此外，利用水蒸氣蒸餾法(steam distillation) 與 水 蒸 汽 蒸 餾 有 機 溶 劑 萃 取 法 (simultaneous steam distillation-solvent extraction)萃取山胡椒果實的精油，所萃取之精油分 析其成分及抗菌性，以期能提供有用的資訊，進一步運用於食品及相 關領域上。
一.山胡椒一般成分之探討
表四為山胡椒的一般組成，新鮮山胡椒果實之水分含量為13.54
%，而山胡椒的粗脂肪、粗蛋白、灰份與總碳水化合物含量分別為 25.48
%、6.62 %、0.97 %與 53.38 %。
二.山胡椒溶劑萃取液之分析
(一)山胡椒甲醇萃取物之收率及過氧化抑制效果探討
研究將山胡椒以水蒸氣蒸餾法(steam distillation)、水蒸氣蒸餾有 機溶劑萃取法(simultaneous steam distillation-solvent extraction; SDE)萃 取精油後之殘渣以及未經處理的新鮮山胡椒乾燥後，將三種處理方式 的山胡椒以甲醇萃取，所萃取之甲醇萃取物以硫氰酸鐵法進行抗氧化 性分析。
表五為未經處理之山胡椒與經兩種萃取精油方法去除精油後的 山胡椒等共三種處理的山胡椒經由甲醇萃取，所得甲醇萃取物測定收 率及抑制脂質過氧化的效果。未經處理之山胡椒甲醇萃取物以CMELC