山胡椒抗氧化性質及其抗菌性質之研究

國立宜蘭大學食品科學系

Department of Food Science National Ilan University

碩士論文 Master Thesis

山胡椒抗氧化性質及其抗菌性質之研究

Study on Antioxidative and Antibacterial Activity of Litsea cubeba

指導教授：翁瑞光 博士

Adviser : Ray-Guang Wong , Ph. D.

研究生：謝玟珣 撰

Graduate student : Wen-Hsun Hsieh

中華民國九十六年六月

國立宜蘭大學食品科學系

Department of Food Science National Ilan University

碩士論文 Master Thesis

山胡椒抗氧化性質及其抗菌性質之研究

Study on Antioxidative and Antibacterial Activity of Litsea cubeba

指導教授：翁瑞光 博士

Adviser : Ray-Guang Wong , Ph. D.

研究生：謝玟珣 撰

Graduate student : Wen-Hsun Hsieh

中華民國九十六年六月

國立宜蘭大學學位論文授權書

本授權書所授權之論文為授權人在國立宜蘭大學 食品科學 系所

95 學年度第 二 學期取得 □博士 █碩士 學位之論文。

論文名稱：山胡椒抗氧化性質及其抗菌性質之研究

Study on Antioxidative and Antibacterial Activity of Litsea cubeba 指導教授：翁瑞光 老師

茲同意將授權人擁有著作權之上列論文全文資料，非專屬、無償授權國立宜蘭大 學及國家圖書館，不限地域、時間與次數，以光碟或其他各種數位化方式將上列 論文重製散布、發行或上載網路，提供讀者基於個人非營利性質之線上檢索、閱 覽、下載或列印。

授權選項：

□ 校內、校外公開

□ 校內公開，校外因上列論文為授權人向經濟部智慧財產局申請專利之 附件或相關文件之一 (申請專案號： )，請 於 年 月 日後再將上列論文公開或上載網路。

█ 校內公開，校外因上列論文尚未正式對外發表，請於 97 年 7 月 31 日 後再將上列論文公開或上載網路。

□ 校內公開，校外不予公開

數位化公開方式若未勾選本人同意視同授權校內、校外公開

授權人： 謝玟珣 身分證字號：

E-mail： [email protected]

簽名或蓋章： 中華民國 96 年 7 月 31 日

摘要

本研究以新鮮的山胡椒、經水蒸氣蒸餾法(steam distillation)及水蒸 汽 蒸 餾 有 機 萃 取 法 (simultaneous steam distillation-solvent extraction;

SDE)去除精油後之山胡椒等三種材料，利用甲醇、熱水以及依次利用 正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水等溶劑萃取，萃取物分別以抑制脂質過 氧化能力、還原力、捕捉自由基 DPPH 能力、螯合鐵離子能力進行抗 氧化性實驗，同時將萃取之山胡椒精油分析其組成並探討其抗菌性質。

以甲醇直接萃取三種不同處理的山胡椒，其萃取物中類黃酮與總 酚類化合物的含量，在未經處理的山胡椒甲醇萃取物中含量分別為 3.83 mg/g、56.51 mg/g；經水蒸氣蒸餾法去除精油後的山胡椒甲醇萃取 物中含量分別為 39.41 mg/g、45.15 mg/g；經水蒸氣蒸餾有機溶劑萃取 法去除精油後的山胡椒甲醇萃取物中含量分別為 19.50 mg/g、39.12 mg/g。三種不同處理的山胡椒利用不同溶劑依序萃取所得之山胡椒區 分物，其中以甲醇區分萃取物具有較佳的還原力、捕捉 DPPH 自由基 能力、螯合鐵離子能力與較高的總酚類化合物含量。三種不同處理之 山胡椒熱水萃取物，當濃度為 0.05 mg/mL 時，其抑制過氧化的效果介 於 65.74 %~87.88 %之間。

山胡椒果實精油分析上，水蒸氣蒸餾法與水蒸汽蒸餾有機溶劑萃 取法所萃取出的精油，分別鑑定出 15 與 13 個化合物，檸檬醛(citral) 為其主要成分，含量分別為 76.366 %與 66.192 %。在抗菌實驗中，實 驗 進 行 山 胡 椒 精 油 對 9 種 不 同 菌 株 (B. subtilis BCRC 10255; E.

aerogenes BCRC 10370; E. cloacae BCRC 10401; E. coli BCRC 10314; E.

coli BCRC 10675; K. oxytoca BCRC 13985; P. aeruginosa BCRC 10944; S.

aureus BCRC 10780; S. aureus BCRC 10781)的抑菌性，抑菌性以最低抑 制濃度(minimum inhibitory concentration; MIC)表示，水蒸氣蒸餾法所萃

取出的精油，對於 B. subtilis 10255 與 E. coli 10314 之 MIC 為 100 ppm；E. aerogenes 10370; E. coli 10675; S. aureus 10780 與 S. aureus 10781 為 200 ppm；E. cloacae 10401 與 K. oxytoca 13985 為 300 ppm。

關鍵詞：山胡椒、水蒸氣蒸餾法、水蒸汽蒸餾有機萃取法、抗氧化性、

抗菌性

Abstract

The objectives of this research were to study the antioxidative activies of extracts from Litsea cubeba fruits. There are three different treatments of Litsea cubeba, one is crude material (C), second is crude material after steam distillation (S) and third is after simultaneous steam distillation-solvent extraction (SDE). Those three different treatments of Litsea cubeba extracted by three solvent groups, methanol, boiling water and a series of n-hexane, ethyl acetate, methanol and water. The antioxidative activity of extracts was studied in terms of four different assay system: inhibition of peroxidation, reducing power, DPPH assay and chelating ferrous ions assay. This research were also to investigate antibacterial activities of essential oil extracts from Litsea cubeba.

This experiment shows, flavonoid and total phenolic contents of methanol extracts from Litsea cubeba of C, S and SDE method are 3.83 mg/g; 56.51 mg/g, 39.41 mg/g; 45.15 mg/g and 19.50 mg/g; 39.12 mg/g respectively. Comparing with other fraction of solvent extracts, the methanol fraction of Litsea cubeba showed the best reducing power, DPPH assay, chelating ferrous ions assay and highest phenolic contents. As the extracts concentration of boiling water was 0.05 mg/mL, the inhibition of peroxidation value is between 65.74 %~87.88 %.

The major constituents of the essential oils from Litsea cubeba is citral, 76.366% contents by S method and 66.192 % by SDE. There were fifteen and thirteen compounds identified in S and SDE method respectively.

Comparing antibacterial activity of essential oil by S and SDE method extracted from crude material. The S method is better than SDE method during the same concentration and stain. For antibacterial activity test,

there are 9 stain (B. subtilis BCRC 10255; E. aerogenes BCRC 10370; E.

cloacae BCRC 10401; E. coli BCRC 10314; E. coli BCRC 10675; K.

oxytoca BCRC 13985; P. aeruginosa BCRC 10944; S. aureus BCRC 10780;

S. aureus BCRC 10781). The MIC (minimum inhibitory concentration) value for B. subtilis 10255 and E. coli 10314 were 100 ppm, E. aerogenes 10370; E. coli 10675; S. aureus 10780 and S. aureus 10781 were 200 ppm, E. cloacae 10401 and K. oxytoca 13985 were 300 ppm for essential oil extracted by S method.

Keywords : Litsea cubeba, steam distillation, simultaneous steam distillation-solvent extraction, antioxidative activity, antibacterial activity

目錄

中文摘要………Ⅰ 英文摘要………Ⅲ 目錄………Ⅴ 表目錄………Ⅹ 圖目錄………ⅩⅣ

壹、 前言………..1

貳、 文獻整理.. ………..……….3

一、 山胡椒之簡介………...3

二、 精油之簡介………...13

三、 精油之萃取方法………...14

四、 自由基與脂質氧化反應………...17

五、 植物成分之抗氧化性………...20

六、 抗氧化性質及成分測定原理………...21

七、 精油之抗菌性及原理………...23

參、 材料與方法………..26

一、 實驗材料………...26

(一) 山胡椒………...26

(二) 菌種來源………...26

(三) 試藥………...26

二、 實驗方法………...28

(一) 實驗流程………...28

(二) 山胡椒樣品之製備………...29

1 水蒸氣蒸餾法萃取精油………...29

2 水蒸氣蒸餾有機溶劑萃取法萃取精油………...29

3 山胡椒粉末樣品之製備………...29

4 山胡椒甲醇萃取液之製備………...30

5 山胡椒溶劑區分萃取液之製備………..30

6 山胡椒水萃液之製備………..30

7 不同濃度之山胡椒精油製備………..30

(三) 山胡椒樣品之分析………...33

1 一般成分分析……….33

(1) 水分………...33

(2) 粗脂肪………..33

(3) 粗蛋白………..33

(4) 灰分………..34

(5) 碳水化合物………..34

2 山胡椒萃取物抗氧化性質分析………...35

(1) 硫氰酸鐵法………..35

(2) 還原力測定………..35

(3) 捕捉 DPPH 自由基能力之測定………..36

(4) 螯合鐵離子能力之測定………..36

3 山胡椒萃取物之抗氧化成分分析……….36

(1) 總酚類化合物含量測定………..………36

(2) 類黃酮含量測定………..37

(3) 抗壞血酸含量測定………..37

4 山胡椒精油組成分析……….37

5 山胡椒精油抗菌試驗………..………...38

6 統計分析………...…………..39

肆、 結果與討論………...40

一、 山胡椒一般成分之探討………...40

二、 山胡椒溶劑萃取液之分析………...40

(一) 山胡椒甲醇萃取物之收率及過氧化抑制效果探討…...40

(二) 山胡椒溶劑區分萃取物之收率探討………...41

(三) 山胡椒溶劑區分萃取物之過氧化抑制效果探討……...42

(四) 山胡椒熱水萃取物之過氧化抑制效果探討…………...45

(五) 山胡椒溶劑萃取區分物抗氧化性質探討………...46

1 還原力………46

2 捕捉 DPPH 自由基之能力………47

3 螯合鐵離子之能力………49

(六) 山胡椒熱水萃取物抗氧化性質探討………..50

1 還原力………50

2 捕捉 DPPH 自由基之能力………51

3 螯合鐵離子之能力………...52

(七) 山胡椒萃取物之抗氧化成分分析………..52

1 山胡椒萃取物之抗氧化成分分析………52

2 山胡椒溶劑區分萃取物之總酚類化合物含量及其與還原力 之相關性……...53

3 山胡椒熱水萃取物之總酚類化合物含量及其與還原力之相 關性……...54

三、 山胡椒精油之分析………...55

(一) 山胡椒精油收率及過氧化抑制效果之探討………...55

(二) 山胡椒精油組成分析之探討………...…...55

四、 山胡椒精油之抗菌性探討………..56

1 水蒸氣蒸餾法萃取精油之抗菌性…………...……...57

2 水蒸氣蒸餾有機溶劑萃取法萃取精油之抗菌性………57

伍、 結論……….60

陸、 參考文獻……….62

柒、 表……….74

捌、 圖……….107

表目錄

表一：中國不同產地所產山胡椒果實之精油組成………6

表二：山胡椒精油各主要成分的特性、用途………8

表三：具有抗菌活性之揮發性化合物………25

表四：山胡椒之ㄧ般成分………74

表五：不同處理之山胡椒甲醇萃取物收率及抗氧化性………75

表六：不同處理之山胡椒依序以不同溶劑萃取之收率………76

表七：不同處理之山胡椒於不同濃度下正己烷區分萃取液之抗氧化 性………...77

表八：不同處理之山胡椒於不同濃度下乙酸乙酯區分萃取液之抗氧化 性………...78

表九：不同處理之山胡椒於不同濃度下甲醇區分萃取液之抗氧化 性………...79

表十：不同處理之山胡椒於不同濃度下水區分萃取液之抗氧化 性………...80

表十一：不同處理之山胡椒於不同加熱時間下之熱水萃取液抗氧化 性………...81

表十二：不同處理之山胡椒於不同濃度下正己烷區分萃取液對還原力 之影響………...82

表十三：不同處理之山胡椒於不同濃度下乙酸乙酯區分萃取液對還原 力之影響………...83 表十四：不同處理之山胡椒於不同濃度下甲醇區分萃取液對還原力之

影響………...84 表十五：不同處理之山胡椒於不同濃度下水區分萃取液對還原力之影

響………...85 表十六：不同處理之山胡椒於不同濃度下正己烷區分萃取液對捕捉

DPPH 自由基之能力………86 表十七：不同處理之山胡椒於不同濃度下乙酸乙酯區分萃取液對捕捉

DPPH 自由基之能力………...87 表十八：不同處理之山胡椒於不同濃度下甲醇區分萃取液對捕捉 DPPH

自由基之能力………...88 表十九：不同處理之山胡椒於不同濃度下水區分萃取液對捕捉 DPPH

自由基之能力………...89 表二十：不同處理之山胡椒於不同濃度下正己烷區分萃取液對螯合鐵

離子之能力………...90 表二十一：不同處理之山胡椒於不同濃度下乙酸乙酯區分萃取液對螯

合鐵離子之能力………...91 表二十二：不同處理之山胡椒於不同濃度下甲醇區分萃取液對螯合鐵

離子之能力………...92 表二十三：不同處理之山胡椒於不同濃度下水區分萃取液對螯合鐵離

子之能力………...93 表二十四：不同處理之山胡椒於不同加熱時間下熱水萃取液對還原力

之影響……….………..94 表二十五：不同處理之山胡椒於不同加熱時間下熱水萃取液對捕捉

DPPH 自由基之能力……….………...95 表二十六：不同處理之山胡椒於不同加熱時間下熱水萃取液對螯合鐵

離子之能力………….………..96 表二十七：不同處理之山胡椒抗壞血酸、類黃酮及總酚類化合物之含

量………….………..97 表二十八：不同處理之山胡椒正己烷、乙酸乙酯、甲醇與水區分萃取

液之總酚類化合物測定………...98 表二十九：不同處理之山胡椒正己烷、乙酸乙酯、甲醇與水區分萃取

液之類黃酮含量測定...99 表三十：不同處理之山胡椒於不同加熱時間下之熱水萃取液之總酚類

化合物測定...100 表三十一：不同水蒸氣蒸餾法萃取之山胡椒精油收率及抗氧化

性………..101

表三十二：水蒸氣蒸餾法與水蒸氣蒸餾有機溶劑萃取法萃取之山胡椒 精油組成………..102 表三十三：水蒸氣蒸餾法萃取之山胡椒精油對 E. coli 與 S. aureus 之抗

菌影響…...103 表三十四：水蒸氣蒸餾法萃取之山胡椒精油對不同菌株之抗菌影

響………..104 表三十五：水蒸氣蒸餾有機溶劑萃取法萃取之山胡椒精油對 E. coli 與

S. aureus 之抗菌影響………...105

表三十六：水蒸氣蒸餾有機溶劑萃取法萃取之山胡椒精油對不同菌株 之抗菌影響………...106

圖目錄

圖一：水蒸氣蒸餾法萃取裝置……….30 圖二：水蒸氣蒸餾有機溶劑萃取法裝置……….31 圖三：水蒸氣蒸餾法萃取之山胡椒精油 GC 層析圖……….107 圖四：水蒸氣蒸餾有機溶劑萃取法萃取之山胡椒精油 GC 層析

圖………....107 圖五：不同處理之山胡椒正己烷萃取物總酚類化合物與還原力之相關 性………...108 圖六：不同處理之山胡椒乙酸乙酯萃取物總酚類化合物與還原力之相 關性……...109 圖七：不同處理之山胡椒甲醇萃取物總酚類化合物與還原力之相關

性……...110 圖八：不同處理之山胡椒水萃取物總酚類化合物與還原力之相關

性………...111 圖九：不同處理之山胡椒熱水萃取物總酚類化合物與還原力之相關

性…...112

壹、前言

植物精油當中常可發現一些抗菌性物質(Valero et al. 2003)，而 植物本身當中也可發現一些抗氧化的成分存在(Kaur et al. 2001)，在健 康飲食的觀念盛行之下，許多自然界天然性的有效成分被人們研究、

熱烈的探討。1957 年 Denham Harman 提出自由基對人體造成的影響 論，並推測過多的自由基可進而誘導疾病的發生，引發自由基與疾病 間關係的研究熱潮(Harman1956; Harman 1994)。

山胡椒(Litsea cubeba)屬於樟科(Lauraceae)；木薑子屬(Litsea)；

常綠落葉灌木或小喬木，廣泛的生長於台灣海拔300~2200 公尺的山坡 地。屬於樟科植物的山胡椒其花、果、葉均富含精油，山胡椒在中國 林產工業上屬於傳統產業，現今的山胡椒利用，不論是在對於食品、

香皂、牙膏、香煙等用途上被作為香料使用以外，山胡椒也被作為傳 統用藥(Kala 2005; Duke et al. 1985)；對於類風濕性關節炎也有一定的 抗發炎效果(張等 1998；劉 1994)。山胡椒抗氧化與抗菌、抗蟲等的研 究分析也顯示山胡椒萃取物有一定之抗氧化性與抗菌、抗蟲效果存 在，Hwang et al. (2005)初步探討了山胡椒樹皮萃取物之抗氧化性，研 究顯示山胡椒甲醇萃取物對捕捉DPPH自由基與H2O2之能力皆高於α -tocophenol；在TBA的實驗中，山胡椒樹皮的甲醇萃取物與三氯甲烷及 正丁醇的區分萃取物都具有抑制脂質過氧化的能力。

山胡椒先前的研究主要針對果實精油的成分分析與樹皮的抗氧 化性及其中的生物鹼鑑定。本研究採用山胡椒之果實，分別利用水蒸 氣蒸餾法與水蒸汽蒸餾有機溶劑萃取法，萃取出山胡椒的精油進行精 油成分分析與其抗菌的情形，並以不同溶劑萃取所得之山胡椒萃取物 分析其抗氧化性。實驗利用硫氰酸鐵法測定山胡椒的抑制脂質過氧化 能力，並測定山胡椒萃取物的還原力、捕捉 DPPH 自由基的能力、螯

合鐵離子之能力，更進一步探討山胡椒之抗氧化性質及總酚類化合 物、類黃酮與抗壞血酸的含量。

本論文探討重點

一、 山胡椒果實溶劑萃取物抗氧化性質及抗氧化成分分析 二、 山胡椒果實精油的抗菌性及組成分析

三、 去除精油後的山胡椒殘渣之抗氧化性及抗氧化成分分析

貳、文獻整理

一.山胡椒之簡介 (一)一般特性

山胡椒(Litsea cubeba)，屬於樟科(Lauraceae)；木薑子屬(Litsea)，

在台灣泰雅原住民稱其為 ”馬告”(Maao, Makao) (Kafuku et al. 1938)。

山胡椒的果實與胡椒很像，故在台灣稱其為山胡椒。本植物別名有台 灣釣樟、香樟、木薑子(樹)、山雞椒、山蒼子(樹)、野胡椒、香葉、畢(土) 澄茄(Cubeb)等多種別名，在中國大陸則泛稱其為山蒼子。

山胡椒為本省固有之野生樹種，分布範圍廣大，生長於台灣海 拔300~2200 公尺之山坡地皆有生長的落葉灌木或小喬木(林 1983; Au et al. 2006)，其全株富有香氣，高約 4~10 m，樹徑約在 3~18 cm 之間，

尤其以5~10 cm 者為多(林等 1995)。山胡椒喜愛光照，生長於陽光充 足的地帶，萌芽力強，在陽光充足的地方砍伐後會迅速萌芽生長，但 若生於陽光不足的地方，則不會萌芽再生。山胡椒的枝及葉都具有芳 香，葉片呈披針或長橢圓披針型，表面綠色，背面綠白色，漿果球形，

成熟後轉為黑色。屬於野生樹種的山胡椒Mao et al. (2000)研究將其以 無性生殖的方式來增加產量以供開採，在中國大陸，山胡椒為林產工 業傳統重要產物；為山胡椒精油的重要出口國。

山胡椒的花期在每年2~4 月；果期為每年 6~8 月。11 月底時花 蕾形成，在光合作用之下，山胡椒果實中大量累積醣類及蛋白質，果 期時的山胡椒，果實中的物質轉化遞增，精油的生成量增加，此期植 株生長處於活耀階段，果實粒重持續增加，水分含量則保持恆定狀態，

當到了 7 月上旬至 8 月下旬，果實粒重穩定，水分含量開始下降，檸 檬醛(Citral)的含量則漸增至最高(龍等 1993)。山胡椒屬於淺根性樹 種，光照下萌芽生長力較無日照的強，栽種條件與地點及環境會直接

影響到果實的產量(陳等 2003)。

樟科中的木薑子屬(Litsea)約有 400 餘種；大部份存在亞洲，而 中國大陸則約有46 種(Mabberley 1990)，在台灣地區山胡椒維管束植物 編號為333009050。在中國大陸，山胡椒生長地區為長江以南，廣泛的 分布於中國大陸之南方各省，主產於四川、雲南、貴州、廣東、廣西、

湖南、福建、貴州、江西、安徽、湖北、江蘇等省(區)，其中以湖南的 產量最高，每年約為 400 噸；其次為雲南 150 噸。山胡椒在中國大陸 年產量高達 2000 噸，其中的 1500 噸出口外銷英、美、法、西德、瑞 士、荷蘭等國(陳 2003；鮑 1995)。山胡椒果實之精油液體為淺黃色，

帶有強烈的檸檬香氣，精油的香氣、色澤、檸檬醛含量及其他物理常 數與產地、採集季節、加工方法、儲存方法及儲存時間有關聯。

山 胡 椒 精 油 在 國 際 化 妝 品 材 料 命 名 法 (International Nomenclature of Cosmetic Ingredients)當中未被命名(Groot et al. 1997)，

大部分都使用俗名代稱，其精油大致組成份為：α(β)-檸檬醛、α-松 油醇、甲基庚烯酮、芳樟醇、黃樟油樹、香茅醛、香葉醇、乙酸香葉 酯、月桂烯、蒎烯等其它類化合物(周等 2001；張等 2003)。山胡椒之 精油通常以水蒸氣蒸餾法製得，得到的精油收率約 3 %~4 % (鍾 1995)。山胡椒果實的精油，其主要成分為檸檬醛(龍等 1993; Lalko et al., 2006; Liu et al. 2001)，檸檬醛可做為多種香精的合成主要原料，可用於 食品、香皂、牙膏、香菸等，也用於各種果香及日常化妝用品香精的 調配，還可合成紫羅蘭酮等高級香料及其它化合物，為重要的天然香 料之ㄧ(Hori 2003)。

周等(2003)、陳等(1999)研究山胡椒果實的精油組成分及其理化 性質(表一、表二)，由表一、表二可看出，山胡椒精油是由多種天然物 所混合在一起的，其包含了醛類、烯類及酮類，在常壓下具有較高的

沸點。山胡椒除了中國大陸以及台灣外，亞洲其它地區如東南亞區域 之印度、馬來西亞等國也都有山胡椒的生產(Kriangsak et al. 2003)。

表一、中國不同產地所產山胡椒果實之精油組成(周等 2003)

Table 1. Percentage composition of the oil of Litsea cubeba from different areas of China

山胡椒精油各成分的相對含量 (%)

化合物 分子式 分子量

廣西 湖南 貴州 2-甲基-3-丁烯-2-醇

2-methyl-3-butylene-2-ol

C5H10O 86 ＜0.100 - -

α-蒎烯 α-pinene C10H16 136 1.010 2.200 1.100 莰烯 Camphene C10H16 136 0.240 1.100 0.375 6-甲基-5-庚烯-2-酮

6-methyl-5-heptene-2-one

C8H14O 126 4.310 7.120 -

檜烯 Sabinene C10H16 136 0.490 - 0.151 β-蒎烯 β-piene C10H16 136 0.950 1.500 0.733 6-甲基-5-庚烯-2-醇

6-methyl-5-heptene-2-ol

C8H16O 128 0.170 - -

β-月桂烯 β-myrcene C10H16 136 1.660 - 2.201 檸檬烯 Limonene C10H16 136 11.040 14.040 8.476 γ-松油烯 γ-terpinene C10H16 136 ＜0.100 - - 異松油烯 Terpinolene C10H16 136 ＜0.100 - - β-芳樟醇 β-linalool C10H18O 154 2.900 3.450 2.378 順-1,2-環氧檸檬烯

cis-1,2-epoxylimonene

C10H16O 152 ＜0.100 - -

2,6-二甲基-2,6-辛二烯 2,6-dimethyl-2,6-octadiene

C10H18 138 0.620 - -

β-香茅醛 β-citronellal C10H18O 154 1.230 1.700 1.052 龍腦 Borneol C10H18O 154 0.140 - - 水楊酸甲酯

Methyl salicylate

C8H8O3 152 ＜0.100 - -

α-松油醇 α-terpineol C10H18O 154 0.810 1.600 0.423 β-檸檬醛 β-citral C10H16O 152 31.580 24.000 31.455 胡椒酮 Piperitone C10H16O 152 ＜0.100 ＜0.100 -

α-檸檬醛 α-citral C10H16O 152 35.220 37.800 37.328 對甲氧基苯丙烯

p-methoxy-phenyl propene

C10H12O 158 0.250 - -

2,7-二甲基-2,7-辛二醇 2,7-dimethyl-2,7-octanediol

C10H22O2 174 0.190 - -

α-松油醇乙酸酯 α-terpineol acetate

C12H20O2 196 ＜0.100 - -

香葉酸 Geranic acid C10H16O2 168 0.240 - - 香葉醇乙酸酯

Geranyl acetate

C12H20O2 196 ＜0.100 - -

β-欖香烯 β-elemene C15H24 204 0.120 - - β-石竹烯

β-caryophyllene

C15H24 204 0.340 - 0.396

α-蛇麻烯 α-humulene C15H24 204 ＜0.10 0.400 - β-金合歡烯 β-farnesene C15H24 204 ＜0.10 - - α-金合歡烯 α-farnesene C15H24 204 ＜0.10 - -

表二. 山胡椒精油各主要成分的特性、用途(陳等 1999) Table 2.Character of the oil from Litsea cubeba

名稱 分子式 分子量

Bp (℃)

特徵、主要用途

α-Pinene α-蒎烯

C10H16

136.24

156 無色油狀液體，具特殊松木香氣，用於塗料、

樹脂中，可作為合成各種香料的起始原料 Camphene

莰烯

C10H16

136.24

160 常溫下為無色結晶，類樟腦香氣和昇華性，

用於薰衣草油化妝品、香皂、除臭劑中及水 果型食品香精中，也是合成的重要原料 β-Pinene

β-蒎烯

C10H16

136.24

165 無色油狀液體，可作為萜烯類合成香料的起 始原料和其他精細化工原料

β-Marcene β-月桂烯

C10H16

136.24

167 無色至淡黃色液體，具香脂香氣，可用於柑 桔型的古龍香水和除臭劑中可用於合成芳樟 醇、香葉醇、香茅醇、紫羅蘭酮等名貴香料 Methyl

Heptenone 甲基庚烯酮

C8H14O 126.19

173 無色至淡黃色液體，近似乙酸異戊酯強烈柑 桔香氣，用於花香型香水、皂用、化妝品中，

是合成檸檬醛等萜類含氧香料的重要原料 p-Cymene

對-傘花烴

C10H14

134.21

175 無色液體，有強烈類似胡蘿蔔香氣，少量用 於日用和實用香精，是合成粉檀麝香、傘花 麝香的主要原料，可用於驅風油類藥品 Limonene

檸檬烯

C10H16

16.24

177 無色淡黃色液體，具令人愉快的檸檬香氣、

似香橙，用於花香型水果香氣化妝品和食用 香料中，也是合成香芹酮等香料的重要原料 Linalool

芳樟醇

C10H18O 154.24

198 無色油狀液體，廣泛用於各類化妝品和水果 食品香精中，也是合成名貴香料的重要原料 Citronell

香茅醇

C10H18O 154.24

205 無色油狀液體，強烈香茅-玫瑰香氣，少量用 於紫丁香、檸檬、玉蘭、古龍香精，並可用 於合成萜醇類香料

α-Terpineol C10H18O 219 無色，黏稠液體，似紫丁香香氣，在紫丁香

α-松油醇 154.24 等日常香料中起主香劑作用，一般作合成香 料原料

Nerol 橙花醇

C10H18O 154.24

226 無色液體，清甜的橙花-玫瑰香，是配置香精 的主香劑和協調劑，也可用於合成名貴香料 αorβ-Citral

αorβ-檸檬醛

C10H16O 152.24

α 227

β 228

αβ體雖分離，實為順式橙花醛和反式香葉 醇的混合體。淡黃色液體，具有濃烈的檸檬 香氣，除了用於日用香精和食用香精外，是 合成紫羅蘭酮、鳶尾酮系列名貴香料和葉綠 醇、維生素A、維生素 E 的中要精細化工原 料

Geraniol 香葉醇

C15H24

204.36

230 無色液體，似玫瑰花香，主要為玫瑰系列香 精的主香劑，在茉莉、橙花、紫羅蘭等日常 香精中也常用

Caryophllene 石竹烯

C15H24

204.36

256 無色油狀液體，具香丁-松香香氣，少量用於 日用和食用香精，是合成石竹醇的重要原料

(二)相關研究

1 山胡椒精油之分析

山 胡 椒 在 精 油 方 面 的 相 關 研 究 很 多(林 1983； 周 等 2003;

Bighelli et al. 2005; Cheng et al. 1983; Choudhury et al. 1998)，檸檬醛 (citral)為山胡椒精油中主要的化合物，檸檬醛化學名稱為 3,7-二甲基 -2,6-辛二烯醛(3,7-dimethyl- 2,6-octadienal)，分子式C10H16O，分子量 152.24，對於強酸及鹼不穩定，容易產生氧化與聚合，對人體也有過敏 性，但可用來合成維生素A、維生素E、維生素K等，或其他高級香料(張 等 2003)，近年來在國際上的應用更將檸檬醛進一步加工成香氣純正的 檸檬腈(Hydroxycitronellal)，該香料性能穩定，香味較為持久，使檸檬 醛的應用範圍擴大(周等 2005)。

實驗以山胡椒精油進行其對於皮膚刺激性之研究，以小鼠實驗 精油的刺激性，山胡椒精油對於皮膚有明顯的刺激性，可以導致豚鼠 皮膚表面色澤加深、變粗糙、引起皮膚組織的無細菌性發炎反應，故 臨床上如果要使用精油，以減少用藥時間或延長用藥時間的間隔來改 善刺激性的發炎情形(塗等 1995)。Luo et al. (2005)針對山胡椒精油的 毒性作為探討，以山胡椒精油進行小鼠實驗，分別進行小鼠的口服性 實驗、皮膚塗抹與精油吸入體內的LD₅₀進行分析，結果顯示山胡椒精 油對於小鼠的LD₅₀在口服性實驗、皮膚塗抹與精油吸入體內各別為 4000 mg/Kg、5000 mg/Kg 與 12500 mg/Kg，毒性輕微。

2 山胡椒抗菌與抗蟲性質之分析

山胡椒精油及所提取出之檸檬醛有明顯的抗真菌作用，根據報 告顯示，200 ppm 的山胡椒精油對部份實驗菌株，如: Vertieillium alboatrun; Fusarium oxysporum; Fusarium graminaerum 與 Rhizoclonia solani 具有抑制的作用；而當濃度高達 400 ppm 以上時則對其他實驗菌

株，如: Drechslera graminea; Piricularia oryzae 與 Sclerotium rolfsii 也都 有不同的抑制效果(高等 1989)。另一篇報告也指出山胡椒精油 4 %即 可抑制細菌生長，若將山胡椒精油與苯甲酸鈉比較後顯示，此兩者化 合 物 在 抑 制 混 合 孢 子 懸 浮 液(Aspergilius flavus; Rhizopus nigricans;

Mucor plumbeus; Penicillium sp.; Aspergilius niger; Aspergilius ochraceus;

Penicillium oxalicum; Aspergilius terreus)的抗菌實驗當中，山胡椒精油 的效果較佳，又報告顯示山胡椒精油濃度對金黃色葡萄球菌在2 %時；

大腸桿菌、白色念珠菌在1 %時具有殺菌的作用，可知山胡椒除了可廣 泛應用於食品及日常用化妝品、香料以外，在醫藥衛生方面也可利用(袁 等 2001; Long et al. 2003)。研究報告比較山梨醇、苯甲酸鈉與山胡椒 的抑菌性，實驗以最低抑制濃度(minimum inhibitory concentration; MIC) 測試山胡椒的抗菌性，MIC 越低則表示抗菌效果越佳，結果顯示山梨 醇、苯甲酸鈉與山胡椒的抑菌性當中以山梨醇的效果最佳(1.33 mg/mL) 優於山胡椒(1.77 mg/mL)；而山胡椒則優於苯甲酸鈉(2.21 mg/mL)的效 果。

山胡椒具有抗菌性質，但由於山胡椒含有特殊風味使其無法廣 泛利用在每個食品的天然防腐上，但其可利用於部分食品，對於抗黴 菌及抗黃麴黴菌毒素的產生皆有抑制效果，可利用於花生、玉米等食 品的保存上(余 1998)。若以山胡椒精油個別化合物來看，在 pH 值 4.5 時山胡椒精油的化合物之抗黴效力由強到弱分別為檸檬醛、香茅醛、

山胡椒油、香葉醇、芳樟醇、甲基庚烯酮；同時檸檬醛對於抗霉菌毒 素的效果為最佳(余等 2002)。李 (1994)研究報告進行金黃色葡萄球 菌、綠膿桿菌及白色念珠菌經過山胡椒精油作用後，結構皆受到損壞，

DNA、RNA、蛋白質、細胞壁及細胞膜等生物合成均受到抑制，推測 山胡椒精油可能通過抑制白色念珠菌的 DNA 與 RNA 合成和抑制細胞 壁中多醣成分的合成而發揮抗菌作用(夏等 1995)。

山胡椒除了對於細菌與黴菌具有抑制性外，也可應用於抗蟲方 面，實驗報告，山胡椒混合液具有驅除蚊子的效果(Amer et al. 2006 a;

Amer et al. 2006 b; Trongtokit et al. 2005)。在山胡椒抑制害蟲的研究 上，如：紅蜘蛛、蚜蟲、鳳蝶、附生性綠球藻和烟蝶病與其它蚧殼類，

山胡椒也同樣具有殺蟲的效果 (陳等 1995)；此外山胡椒對於破壞建築 物、林木、家具、圖畫、布匹的害蟲白蟻也有抑制效果，以山胡椒提 取液探討提取液對白蟻的影響，結果顯示山胡椒石油醚提取液可抑制 白蟻的接近，石油醚提取液可在24 小時內有效抑制白蟻，避免白蟻進 入含有提取液的範圍(伊等 2005); Hori (2003)也研究山胡椒對於煙甲 蟲具有抑制的效果，可減少菸葉的傷害。顯示山胡椒對於抗菌及抗蟲 性都具有一定的效果。

Anderson et al. (2000)研究，若將山胡椒精油與芳香療法一同治 療異位性濕疹，結果顯示，山胡椒精油可降低異位性濕疹的情形。

3 山胡椒抗氧化性質之分析

針對山胡椒的抗氧化研究當中，山胡椒樹皮中的生物鹼被研究 的較為透徹，其中所含的生物鹼具有抗氧化抗發炎的作用。Cheng et al.

(1983); Chiou et al. (1998); Lee et al. (1996); Lee et al. (1992); Lee et al.

(1993); Lee et al. (1992); Wu et al. (1991)等學者分別鑑定出許多山胡椒 樹皮中的生物鹼。在中國大陸山胡椒可做為傳統用藥來使用(Kala 2005;

Duke et al. 1985)，此外山胡椒萃取物對於類風濕性關節炎也有一定的 抗 發 炎 效 果( 張 等 1998 ； 劉 1994) ； 若 以 細 胞 進 行 抗 發 炎 (anti-inflammatory)的實驗，山胡椒樹皮萃取物具有抗發炎的效果(Choi et al. 2004)。

自然界植物所能提供的天然抗氧化物質漸漸被大家廣泛討論及 重視。利用Fenton反應生成羥自由基，其容易與甲基紫上的共軛雙鍵結

合後褪色，通過加入山胡椒萃取物與甲基紫競爭結合羥自由基，來測 出其油脂清除羥自由基之能力；另以鄰苯酚三酚自氧化法產生超氧陰 離子自由基來測定，其結果顯示山胡椒清除羥自由基及超氧陰離子自 由的能力可分別高達 76.15%和 57.60%(程 2005 a；程 2005 b)；利用 Schaal oven test使用有空氣循環的烘箱進行實驗，測定山胡椒萃取物之 抗氧化活性，結果顯示，山胡椒的抗氧化能力為1.2 是BHA (2.0)之 60

%(李等 1982)；以烘箱儲藏法測定山胡椒抗氧化活性，結果顯示山胡 椒具有良好之抗氧化性，效果為BHA的兩倍；與BHT相當，若萃取成 為精油後，精油的抗氧化效果也有BHA的 75%(余 1998)。除了先前的 學者研究山胡椒樹皮中的生物鹼之外，Hwang et al. (2005)初步探討了 山胡椒樹皮萃取物的抗氧化性，效果顯示山胡椒甲醇萃取物捕捉DPPH 自由基之能力(90.57%±0.07)高於α-tocophenol (60.11%±14.47)；對於 H₂O₂之捕捉力山胡椒萃取物的效果(46.20±0.72)也高於α-tocophenol (5.04±0.72)；在TBA實驗中山胡椒萃取物的抑制過氧化效果則與α -tocophenol相當(甲醇萃取物 88.94±0.27; α-tocophenol 91.54±0.17)。

二.精油之簡介

地球上的植物種類估計約在50 萬種以上，根據民俗植物學家的 統計數據顯示，全世界各民族使用的藥草種類大約在五千到七萬種 間，常用的藥草種類也有一萬種左右，但到現在為止經過藥理分析和 評估的植物種類，大概只有五千種左右。植物除了我們一般所熟悉的 光合作用副產物之外還有一些物質具殺菌作用、提神、鎮靜神經等功 效，這些成分總稱為芬多精(Pytoncides)，其中有些揮發性成分可以藉 由水蒸氣蒸餾法獲得，當水蒸氣將植物中的揮發性物質帶出分離後，

則可得到日常生活中所用的精油(吳 1999)。精油的成分以單萜類 (monoterpene)、倍半萜類(sesquiterpene)與其他芳香族化合物及其衍生

物所組成，萜類化合物以異戊二烯(isoprene)連結所形成，其已被列為 Generally Recognized as Safe (GRAS)的化合物(Kim et al. 1995)。

植物的鮮花、葉片等部位會帶有特殊的氣味，為了方便使用，

人們將之製成不同的製品以供使用，其中精油又稱為揮發油、芳香油，

是從植物體含有香味的成分部位，採用物理方法(如水蒸氣蒸餾、萃取、

壓榨、吸收等)從原料中分離出具有一定特徵香氣的油狀物。不同品種 的精油各有其特點，但都具有揮發性、不穩定性、可燃性且具有一定 香氣等共同特徵(毛等 2006)。

(一)揮發性：通過水蒸氣蒸餾的方法製成的精油中，沸點超過 300

℃的成分很少，多數成份的沸點皆在100~280℃之間。也因精油具有揮 發性故可以通過評香來確定油脂的好壞，現代化的評估方式更以 GC 作為香氣的鑑別。

(二)不穩定性：多數精油都會有不穩定的化合物，如異戊二烯結構 的萜類化合物遇到光照、酸鹼等條件會產生異構化或聚合等化學反 應；而醛酚等官能基團的香氣成分在接觸空氣後會產生氧化反應，有 些酯類化合物遇水後還會發生水解反應。因此，多數精油都應避光、

減少容器中空氣量來保存。

(三)香氣：精油的主要成分可分為烴類化合物和氧、氮、硫雜原子 的化合物，不論兩者含量比例為何，決定精油的香氣成分主要來自後 者。

三.精油之萃取方法

(一)水蒸餾法(Water distillation)

水蒸餾法為香料工業取得精油最常使用的方法，此法是將植物 體與水混合加熱，植物體中的精油隨著水蒸氣一起被蒸餾出，精油和 水蒸氣冷卻後，精油和水最後由於比重之關係，靜置後則可將兩者分

離得到精油(Guenther 1952; Babu et al. 2005)。

(二)水蒸氣蒸餾法(Steam distillation)

水蒸氣蒸餾法是將植物體與水分開，利用蒸餾時水蒸氣直接通 過植物體而將精油帶出，冷却後即可得到精油。上述兩者，因為在高 溫下萃取精油，容易使精油產生變質，產生異構化(Isomerization)、皂 化(Saponification)及重組(Rearrangement)等反應。其中重組的反應與 pH 值等有直接的關係，且反應時間、萃取時間越短越不容易發生變化 (Guenther 1952; Babu et al. 2005)。

(三)有機溶劑萃取法(Organic solvent extraction)

使用有機溶劑萃取之溫度不可超過40℃，故精油不容易受到高 溫產生變質。至於溶劑的選擇則考慮其極性大小、沸點高低、安全性 等問題來做選擇，此法利用有機溶劑萃取，故所萃得精油對於應用在 香水製造上較為適合(Pallado et al. 1997)。

( 四 ) 水 蒸 氣 蒸 餾 有 機 溶 劑 萃 取 法 (Simultaneous steam distillation-solvent extraction; SDE)

水蒸氣蒸餾有機溶劑萃取法為分離出樣品中香氣的方式，在 1964 年 由 Likens 與 Nickerson 開 發 ， 通 常 所 使 用 之 裝 置 稱 為 Likens-Nickerson 裝置。水蒸氣蒸餾有機溶劑萃取法主要原理及操作先 以不含氧之氮氣把裝置內的氣體置換掉，然後將含有大量水液之樣品 及有機溶劑加入並組裝，當水蒸氣將揮發性物質帶入反應冷凝管中與 有機溶劑反應時，揮發性物質因為極性的關係則被抽入有機溶劑中，

最後因為比重的不同，水與有機溶劑則個別回到原本的容器中。溶劑 的選擇以利用低沸點之溶劑如：乙醚、正戊烷、二氯甲烷等進行萃取，

若單獨以有機溶劑萃取所得的精油，同時含有揮發性與不揮發性之成 分，易干擾GC (Gas chromatography)的分析，使用此法進行分析可避 免 此 問 題 。 但 使 用 此 方 法 萃 取 的 樣 品 成 分 容 易 產 生 再 組 合 (rearrangements)、氧化、水解及梅納反應，使用減壓蒸餾或添加抗氧化 劑可減少這類化學反應的發生(Kim et al. 2004)。

(五)冷吸法(Enfleurage)

此法是將精製過後的牛油及猪油(1：1)混合塗在冷吸設備的玻 璃上，再將植物體覆蓋，利用牛油及猪油吸收植物體香氣成分，24 小 時換一次植物體，經過幾次後再將油脂刮下，利用酒精將牛油及猪油 中所吸收的成分萃取出，最後經過過濾、濃縮成為成品(Guenther 1952;

張等 2000)。

(六)壓榨法(Expression)

壓榨法採用物理方式獲得精油，一些果皮富含精油的水果，常 用壓榨法來製備精油，目前商業上也常用此方法(Minh Tu et al. 2002)。

(七)超臨界二氧化碳萃取法(Supercritical fluid extraction; SFE) 物質有固相、液相與氣相三相存在，物質在臨界點之下密度接 近於液體；黏度接近氣體；擴散性介於液體與氣體之間，如此的特性 使得對於目標物之溶解力較氣體為高，更重要的是，利用此法可以利 用溫度及壓力控制溶劑的選擇性以區分溶質。此方法的優點也在於萃 取時快速、時間短、且適用含有熱不穩定成分的精油，與水蒸氣蒸餾 所得的精油近似，但各成分的百分率則不同(Taniguchi et al. 1985)。

(八)微波抽取法(Microwave oven extraction)

利用微波抽取法萃取精油所需時間少且僅需少量試樣，與水蒸 氣蒸餾蒸餾所得精油成分相近，但百分率不完全相同。適用於應用在 分析不同部位及不同採收季節精油成分的分析(張等 2000)。

四.自由基與脂質氧化反應 (一)自由基傷害與人體防禦

含有油脂的食品類，隨著氧化產生油耗味，造成食品產生不良 氣味，且進入人體後對人體的健康亦有影響(Thomas 1995)。氧氣對於 生物而言是一不可缺乏之物質，但當氧氣進入人體後，體內會有可代 謝產生自由基的促進因子，如：細菌、黴菌、病毒或異物等入侵體內 後，體內的防禦系統就會產生含氧自由基，以保護身體的正常機能，

然而在某些情形之下，產生的這些分子，其對於生物體具有傷害性(施 等 1989; Martinez 1995)。

自由基一般指含有不成對電子之電子，由於不穩定，故容易與 其它物質進行氧化還原反應(Martinez 1995)。大氣中的氧氣主要是以穩 定的三重態氧存在，其經過了能量轉移或電子轉移形成較高活性的活 性氧Activated oxygen又稱為Reactive oxygen species (ROS)，體內在偶發 中會產生這樣的物質，進而攻擊人體(Martinez 1995)，此外其他產生的 自由基，如：(1)超氧陰離子自由基O₂‧^-；(2)過氧化氫H₂O₂；(3)氫氧自 由基OH‧；(4)單重態氧(single oxygen)；(5)脂質過氧化自由基ROO‧

等，也都會誘導疾病的生成。為了降低自由基的傷害，細胞有許多抗 氧化之防禦系統，包括非酵素性的抗氧化劑(non-enzymatic antioxidants) 如：維生素C、維生素E、麩胱甘肽(glutathione；GSH)等，及酵素性的 抗 氧 化 劑 (enzymatic antioxidants) 如 ： 超 氧 歧 化 酶 (superoxide dismutase ； SOD) 、 觸 酶 (catalase) 及 麩 胱 甘 肽 過 氧 化 酶 (glutathione peroxidase)等(Bast et al. 2002)。

(二)脂質之氧化原理

脂質為食品重要成分之ㄧ，常因為脂質的氧化而造成食品的 rancidity 及 deterioration。脂質在氧化的過程中，這些過程除了對於食 品帶來不良的氣味，食入人體後，也對人體產生傷害(Fang, 2002;

Parkinson 1995)。

脂質之氧化原理可分為以下幾種，整個反應可分為三大階段 (Fennema 1985)

1.熱引發的氧化作用(thermal oxidation)

熱引發的氧化作用，起因於高溫的作用，於此條件下，分子間 的鍵結較為脆弱，而易產生分解和重組。

2.自氧化作用(autoxidation)

自氧化作用是由於三重氧所發生的，其也為一般大氣中含量最 多的氧，所引起的為一自由基連鎖反應(free radical chain reaction)，其 可分為initiation、propagation 與 termination 等步驟。

(1).起始期(initiation stage)

其為不飽和雙鍵上的碳氫化合物受到作用，移去氫原子而形成 一自由基，此階段通常較慢，但是此步驟為此類反應的決定步驟。

RH→R‧+H‧

(2).增值期(propagation stage)

此階段的反應包含一系列過氧化基及新的自由基生成。

R‧+O₂→ROO‧

ROO‧+RH→ROOH+ R‧

(3).終止期(termination stage)

此反應階段中，為兩個自由基相互作用產生非游離基的產物，

使反應終止。

R‧+R‧→RR

R‧+ROO‧→ROOR

ROO‧+ ROO‧→ROOR+O2

其中，RH 表示不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid)；R‧與 ROO‧則表示反應所生成的自由基，自由基隨著雙鍵與活性甲烯基之 增加而增加。

在這些氧化後所生成的氫過氧化物，會進一步的繼續氧化裂解 而產生一些酮、醛、醇、酸類等低分子量的化合物，使油脂產生令人 不愉悅的氣味，降低感官知覺與價值。

3.光感應的氧化作用(photosensitized oxidation)

光所引起的油脂氧化作用主要是經由光感介質(photosensitizer) 的作用。其介質可吸收可見光而成為激發狀態，在激發狀態的感光介 質，經過inter-system crossing 的作用可轉變成為 triplestate sensitizer，

而此物質可直接吸引不飽和脂肪酸的氫原子，而將其轉變為自由基型 式的脂肪酸，在氧的作用之下形成過氧化物。

4.酵素催化的氧化作用(enzymatic oxidation)

對油脂氧化作用有影響的酵素，主要是一些參與氧化還原作用 的酵素。這些酵素所催化之反應的進行，需要過渡金屬的輔助，例如：

銅和鐵離子，特別是鐵離子。

(三)抗氧化之作用機制

抗氧化劑依功能可分為自由基終止者(Free radical terminator)、s

還 原 劑 或 氧 捕 捉 劑(Reducing agent or oxygen scavenger) 及 螯 合 劑 (Chelating agent)三大類(Dziezak 1986)。

第一類自由基終止者其結構多具苯環，本身穩定，可藉由提供 電子或氫離子以穩定自由基，此類化合物如 BHA, BHT 與 TBHQ 等。第二類為還原劑或氧捕捉劑可提供還原的狀態以減少自由基的生 成。第三大類螯合劑其可將促進氧化的離子螯合以減少氧化，如 citric acid and EDTA etc.。

(四)天然抗氧化物質

補充體內的抗氧化物質漸漸受到人們的重視(Morrissey et al.

1998; Nicholas et al. 1996)。自然界含有許多抗氧化物質，在藥補不如食 補及預防疾病的觀念盛行下，含有生理活性的機能性食品倍受重視，

也因為其含有可補充體內抗氧化系統的不足物質及安定自由基且無藥 物副作用等問題，故在攝取天然性抗氧化物質以預防或減緩疾病的發 生被大家所認同(Kaeuga 1988)。

五.植物成分之抗氧化性

植物中具有許多具抗氧化性之成分(Kaur et al. 2001; Maria et al.

2002)。月桂與山胡椒都可作為特殊辛香料，Simic et al. (2003)與Kosar et al. (2005)研究月桂的抗氧化性，而在Longo et al. (2005)也探討月桂中的 花青素含量；Diego et al. (2004)與Demo et al. (1998)則探討了月桂中的 tocopherol的含量，tocopherol為脂溶性抗氧化物，以α-tocopherol探討 的話，新鮮的月桂裡132.2 mg/100g的α-tocopherol。Lee et al. (2006)研 究樟樹(Cinnamomum camphora)乙酸乙酯與正丁醇萃取物的抗氧化性 實驗中，實驗顯示，樟樹萃取物(50μg/mL)捕捉自由基DPPH (20μg/mL) 的能力與抑制黃嘌呤氧化(Xanthine oxide)的IC50分別為 14μM與 15μ

M。另有學者研究中國傳統五香粉(cinnamon, cloves, fennel, pepper and star anise)在烹煮Ground Beef時的抗氧化性及官能品評，實驗以TBA (thiobarbituric acid)測定抗氧化性，以 1 %的五香粉樣品TBA與對照組 TBA比較後，1 %的五香粉樣品可以降低氧化程度由 3.41 ppm MAD降 至1.00 ppm MAD；若以個別辛香料比較下，當濃度為 1 %時，辛香料 cinnamon, cloves, fennel, pepper 與 star anise可分別降TBA至 0.78 ppm MAD、0.88 ppm MAD、0.99 ppm MAD、1.26 ppm MAD與 0.71 ppm MAD (Dwuvedi et al. 2006)。Natarajain et al. (2005)研究黑胡椒(Piper nigrum)、印度胡椒(Piper longum)與辛香料薑(Zingiber officinale)的抗氧 化性，實驗以ABTS測定抗氧化性，實驗結果顯示抗氧化效果以黑胡椒 萃取物的效果大於印度胡椒萃取物；印度胡椒萃取物的抗氧化效果則 大於薑的萃取物，研究顯示，辛香料做為調味所用之外，其也具有一 定的抗氧化效果。

六.抗氧化性質及成分測定原理 (一)硫氰酸鐵法

脂質氧化生成的氫過氧化物(hydroperoxides)會隨氧化反應進行 而增加，當其生成後即會開始裂解，若分解率大於生成率則氫過氧化 物則開始減少(Perkins 1967)。硫氰酸鐵法主要利用亞麻油酸的氧化程 度作為樣品抑制脂質氧化程度的指標。硫氰酸鐵法利用亞麻油酸的不 飽和鍵容易產生氧化，若樣品能提供減緩或抑制油脂氧化的程度，則 可使亞麻油酸的氧化程度下降。實驗以硫氰化氨及FeCl₂會產生呈色所 測定，若樣品氧化程度越高，顏色越深。(Milaeva 2006; Shahidi 2000)。

(二)還原力測定

參考Oyaizu (1986)測定普魯士藍(Prussian blue；Fe4【Fe(CN)6】

3)的生成量為指標，其原理藉由樣品將赤血鹽(potassium ferricyanide；

PFC；K3Fe(CN)6))還原成黃血鹽(K4Fe(CN)6))，黃血鹽再和三價鐵離子 作用形成魯士藍，在700 nm下偵測已得知樣品的還原力，吸光值越高 則表示還原力越強，則抗氧化效果越佳(Blazovics et al. 2003)。

(三)捕捉 DPPH 自由基能力之測定

捕捉 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH) radical，參考 Shimada et al. (1992) 的方法，DPPH-MeOH 在 517nm 下有強吸光值，若 DPPH-MeOH 被抗氧化劑還原或與另一個自由基結合時其吸光值就會 下 降 ， 故 以 新 鮮 配 置 的 DPPH-MeOH 測 定 樣 品 對 於 捕 捉 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl 自由基的能力，吸光值越低表示樣品捕捉 DPPH 自由基之能力愈強。

(四)螯合鐵離子能力之測定

參考Shimada et al. (1992)的方法。金屬離子，低濃度下也具有促 進脂質氧化的能力，尤其以亞鐵及銅離子最具效果，少量的金屬離子 便能產生大量的自由基，加速脂質的氧化反應，在整個脂質過氧化反 應 中 扮 演 著 十 分 重 要 的 角 色 ， 其 至 少 參 予 了 三 個 反 應 的 步 驟 。 一.Superoxide radical 及 H2O2的 產 生 ； 二.hydroxyl radical 的 產 生 ； 三.hydroperoxide的分解，因此若是能管制亞鐵離子的利用，即能控制 整個反應的發生(Dziezak 1986; Water 1971)。

(五)總酚類化合物含量測定

自然界中的總酚類化合物包含很多種，其由於具有OH基與提供 電子之能力，穩定自由基，故具有抗氧化之功效(Shan et al. 2005;

Catherine 1996; Gil et al. 2002; Sherwin et al. 1978; Yang et al. 2004)。測

定樣品中所含之總酚類主要利用Folin- Clocalteu’s phenol reagent與樣品 中的酚類作用後再與Na2CO3產生呈色，在最大吸收波下測定其吸光值 (760 nm)，並以標準品做比較後，換算得樣品中的酚類化合物含量(Folin et al. 1915; Singleton et al. 1965)。

(六)類黃酮含量測定

不同結構的類黃酮有不同之抗氧化力，學者推測類黃酮對於抑 制脂質氧化主要是因為類黃酮具有減少氫自由基與超氧陰離子等自由 基的傷害，故具有抗氧化的作用，實驗測定類黃酮的含量，測於415 nm 下的吸光值，測定標準曲線 Quercetin-MeOH，計算樣品中類黃酮的含 量(Husain et al. 1987, Jia et al. 1999)。

(七)抗壞血酸含量測定

抗壞血酸為食品中代表的 synergist，synergist 本身不與促氧化 因子直接作用，抗壞血酸作為 synergist 存在下，可以幫助生育醇減少 脂質氧化，也可以增加酚型抗氧化劑的抗氧化能力(Niki 1991)，因此，

抗壞血酸的存在之下，可提高抗氧化的效果。

七.精油之抗菌性及原理

Ozcan et al. (2001)以月桂萃取的精油實驗其對於不同菌株的抑 制情形，實驗顯示，月桂萃取的精油在1 %時對 B. cereus 與 E. faecalis 有抑制情形；10 %時對 E. coli, S. typhimurium, S. aureus, Y. enterocolitica 有抑制情形。植物中一些主要的精油抗菌物質已被證實，如丁香中的 eugenol；大蒜中的 allicin；肉桂中的 cinnamic、aldehyde、eugenol；牛 至與百里香的carvacrol、thymol；以及香草蘭豆中的 vanillin (Arfa et al.

2006; Chang et al. 2001; Dorman et al. 2000; Nostro et al 2004)，皆被證實

具有抑菌的效果，近年來植物中的萃取物也常被用於食品或用在抗菌 上(Valero et al. 2003)。實驗測定月桂、肉桂、丁香與百里香植物精油對 於 Listeria monocytogenes 與 Salmonella enteritidis 的抑菌性，實驗添加 月桂、肉桂、丁香與百里香植物精油在對低脂乳酪與高脂乳酪對於 Listeria monocytogenes 與 Salmonella enteritidis 在 4℃與 10℃的影響，

結果顯示，低脂乳酪添加1 %月桂、肉桂、丁香與百里香油皆對 Listeria monocytogenes 都有影響；相對的高脂乳酪則只有在添加 1 %丁香油時 對於 Listeria monocytogenes 具有抑制作用。在對於 Salmonella enteritidis 中 1 %的百里香植物精油在低脂乳酪比高脂乳酪中，有較佳的抑菌效 果；0.5 %的月桂、肉桂、丁香精油則對 Salmonella enteritidis 在低脂乳 酪中有抑制性，實驗結果顯示，月桂、肉桂、丁香與百里香植物精油 對食品有保存的作用(Smith et al. 2001)。

研究顯示，精油當中含有的萜類化合具有抗菌的作用，萜類化 合物以異戊二烯為單體形成，大部分精油中的萜類化合物以單萜類 (monoterpenoids)與倍半萜類(sesquiterpenoids)為主，主要抑菌機制由於 萜類化合物可抑制細胞壁合成、DNA 合成、造成細胞破壞等原因造成 細胞的死亡，達到抑菌的情形(Arfa et al. 2006; Bennis et al. 2004; Chang et al. 2001; Dorman et al. 2000; Nostro et al. 2004)。

表三、具有抗菌活性之揮發性化合物

Table 3.Antibacterial activity for volatile oil components

borneol Geranyl acetate β-pinene

δ-3-carene cis-hex-3-an-1-ol (+)-sabinene carvacrol R(+)-limonene α-terpinene

Carvacrol methyl ester (±)-linalool terpinen-4-ol cis/trans citral menthone α-terpineol

eugenol nerol (-)-thujone

geraniol α-pinene thymol

(Arfa et al. 2006; Chang et al. 2001;

Dorman et al. 2000; Nostro et al. 2004)

参、材料與方法

一.實驗材料 (一)山胡椒

實驗所使用之山胡椒果實取自花蓮卓溪鄉山區摘採，果實於 2006 年 6 月採集，新鮮採摘分裝後放置-20℃下保存備用。

(二)菌種來源

Bacillus subtilis BCRC 10255; Enterbacter aerogenes BCRC 10370; Enterbacter cloacae BCRC 10401; Escherichia coli BCRC 10314;

Escherichia coli BCRC 10675; Klensiella oxytoca BCRC 13985;

Pseudomonas aeruginosa BCRC 10944; Staphylococcus aureus BCRC 10780; Staphylococcus aureus BCRC 10781

(食品工業研究所菌種保存及研究中心)

(三)試藥

Aluminum nitrate nonahydrate (ACS), L-Ascorbic acid, 1-Butanol (ACS), Butylated hydroxyanisole, Citric acid monohydrate powder, 2,6-dichlorophenolindophenol sodium salt hydrate, Diethyl ether anhydrous bar (ACS), 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl, Ether anhydrous (ACS), Ethyl acetate (ACS), Ethylenediaminetetracetic acid disodium salt, Folin-Ciocalteu’s phenol reagent, Gallic acid monohydrate, Hexanes (ACS), Iron (Π) chloride tetrahydrate, Iron (Ⅲ) chloride tetrahydrate minimum 98%, Linoleic acid free acid approx. 99%, Methyl alcohol anhydrous, n-Pentane (ACS), meta-phosphoric acid, 3-(2-Phyridyl)-5,6-bis (4-phenyl-sulfonic acid)-1,2,4-triazine (ferrozine), Polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate, Potassium acetate (ACS), Quercetin dehydrate minimum 98 %, Solfuric acid, Potassium hexacyano-ferrate ( Ⅲ )

approx.99%, Potassium sulfate, Sodium carbonate (GR), Sodium carbonate (GR), di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate (GR), di-Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (GR), Sodium Hydroxide, Sodium sulfate anhydrous, α-tocophenol 及 Trichloroacetic acid (TCA)購自美國 Sigma 公司台灣分公司。

Ammonium thiocyanate (GR), Boric acid, Ferric chloride hexahydrate 及 Hydrochloric acid 購自德國 Merck 公司台灣分公司。

Ethyl alcohol (95%)購自台灣菸酒公司

二.實驗方法 (一)實驗流程

山胡椒果實(Litsea cubeba (Lour.) Pers.)

果實 35℃熱風乾燥 24 hrs 磨粉過篩(20 mesh)

硫氰酸鐵法 還原力測定

捕捉DPPH 自由基能力之測定 依序以溶劑萃取

n-hexane (FHELC) Ethyl acetate (FEELC)

Methanol (FMELC) Water (FWELC)

熱水萃取 (BWELC) 煮沸3 min 煮沸5 min 煮沸10 min 煮沸20 min 煮沸30 min 精油(E. oils)

Essential oils 甲醇萃取 (MELC) 水蒸氣蒸餾法(S)

Steam distillation

水蒸氣蒸餾有機溶劑萃取法(SDE)

Simultaneous steam distillation-solvent extraction

一般成分分析

抗 菌 性 質 之 測 定

揮 發 性 成 分 分 析

螯合鐵離子能力之測定 總酚類化合物測定 類黃酮含量測定 抗壞血酸含量測定

(二)山胡椒樣品之製備

1 水蒸氣蒸餾法(Steam distillation)萃取精油

取 250g 山胡椒全果置於水蒸氣蒸餾裝置(圖一)中，以水蒸氣作 為熱源，維持加熱 4 小時，當水蒸氣通過樣品時，揮發性成分與精油 即被水蒸氣帶出，最後冷凝則可得精油與水層，將精油與水的混合物 靜置分離後，精油再添加無水硫酸鈉去除多餘之水分，得到的精油保 存備用(Guenther 1952; Babu et al. 2005)。

2 水 蒸 氣 蒸 餾 有 機 溶 劑 萃 取 法 (Simultaneous steam distillation-solvent extraction)萃取精油

參考文獻之條件修飾後，取250g 山胡椒全果並加蒸餾水定量至 1000mL 後置入 Simultaneous steam distillation-solvent extraction (SDE) 裝置中(圖二)，溶劑瓶中則放入乙醚與正戊烷混合液 50mL(1：1，v/v)，

溶劑瓶以 40℃水浴進行加熱，當樣品之水蒸氣與溶劑瓶中溶劑混合，

使蒸氣中揮發性物質因極性關係而溶入溶劑中，冷凝後由於溶劑之比 重較輕，故迴流濃縮瓶中；而水則迴流至圓底燒瓶中，如此進行 2 小 時的萃取。最後將溶劑瓶取下後以蒸餾塔進行濃縮再加入無水硫酸鈉 去除多餘的水份後，得到的精油保存備用(Lee et al. 2004; Paramita et al.

2005)。

3 山胡椒粉末樣品之製備

將 新 鮮 未 經 處 理 之 山 胡 椒 與 經 水 蒸 氣 蒸 餾 法 (Steam distillation) 、 水 蒸 氣 蒸 餾 有 機 溶 劑 萃 取 法 (Simultaneous steam distillation-solvent extraction SDE)去除精油後之山胡椒，以 35℃熱風乾 燥24 hrs，磨粉過篩(20 mesh)，保存備用。

4 山胡椒甲醇萃取液之製備

取山胡椒粉末，以 1：10(w/v)之甲醇震盪萃取 12 小時後，收集 第一次萃取液，重複以上實驗，連續萃取 2 次，將所得萃取液合併過 濾後，保存備用。

5 山胡椒溶劑區分萃取液之製備

取山胡椒粉末，以 1：10(w/v)之溶劑量，依序以正己烷、乙酸 乙酯及甲醇等三種溶劑分別萃取12 hrs，連續萃取 2 次，將所得三種萃 取液過濾後，於40℃下減壓濃縮至乾，所得之濃縮物，將其定量至 100 mL 之甲醇中。另將經過有機溶劑萃取後之山胡椒殘渣分別以水(水：

乙醇(v/v)=4：1)常溫萃取 12 hrs，連續萃取 2 次，將所得萃取液合併過 濾後保存備用。

6 山胡椒熱水萃取液之製備

取 50 g 山胡椒粉末，加水定量至 1000 mL，加熱保持溫度在 100

℃，分別煮沸 3、5、10、20、30 min，所得萃取液經濾紙過濾後，得 到的濾液保存備用。

7 山胡椒抗菌實驗之精油製備

取 95%之乙醇，以無菌水稀釋使酒精濃度為 5%，最後以 5%酒 精將精油原液稀釋，分別稀釋為100 ppm、200 ppm、300 ppm、400 ppm、

500 ppm、600 ppm、700 ppm、800 ppm、900 ppm、1000 ppm 與 3000ppm 等不同濃度的精油抗菌液後進行抑菌試驗。

圖一、水蒸氣蒸餾法萃取裝置 Figure 1. Steam distillation instrument

圖二、水蒸氣蒸餾有機溶劑萃取法裝置

Figure 2. Simultaneous steam distillation-solvent extraction instrument

(三)山胡椒樣品之分析 1 一般成分分析

(1)水分(AOAC 1995)

精稱 3~5 g 之山胡椒，放置於恆重之秤量瓶中(W)，其總重為 W1。以烘箱進行熱風乾燥，將樣品置於 105 ℃之烘箱反覆乾燥、冷卻 至恆重(W2)。

水分含量(%)=[(W1-W2)/(W1-W)]×100

(2)粗脂肪(AOAC 1995)

將山胡椒以磨粉機磨碎，精稱 1~3 g(Ws)於秤量紙上，包起後放 入圓筒濾紙中，圓筒濾紙以脫脂棉塞住筒口，最後放入索氏萃取器中

（磨砂圓底燒瓶於 110℃中烘乾至恆重，並秤重(Wo)）。圓底燒瓶中加 入約2/3 的乙醚，組裝索氏萃取裝置，將脂肪抽出裝置放置於 50~60℃

恆溫水浴中不斷迴流萃取16 小時，待最後一次的乙醚由虹吸管迴流入 圓底燒瓶中時，迅速以鑷子取出索氏萃取裝置中的圓筒濾紙，繼續回 流回收乙醚，待乙醚回收後，圓底燒瓶於110℃烘箱中，重複乾燥至恆 重(W1)。

粗脂肪(%)=（W1- W0）/Ws×100%

(3)粗蛋白(AOAC 1995)

精秤已脫脂之山胡椒0.15 g加入催化劑K₂SO₄：CuSO₄‧5H₂O＝

10：1 一同放入分解瓶中，再慢慢加入濃硫酸 15mL後，將分解瓶置於 粗蛋白分解裝置上加熱至澄清並冷卻至室溫進行蒸餾。利用凱氏氮分 析儀進行蒸餾，蒸餾時，取4 ％的硼酸吸收液 20 mL，放入 250 mL三

角瓶中連接蒸餾裝置，使冷卻器出口浸入三角瓶的硼酸溶液中，蒸餾 前，先加入鹼液(50 % NaOH)至呈黑色後開始蒸餾，當凱氏氮分析儀蒸 餾完後，將三角瓶取下並加入3~5 滴混合指示劑馬上以 0.1 N H2SO4標 準溶液滴定至呈紅色為止。

粗蛋白(%)={[(B-A)/1000×F×14/S] ×100％}×D A＝滴定空白試劑所用的 0.1N H2SO4溶液mL數 B＝滴定Sample所用的 0.1N H2SO4溶液mL數 C＝樣品重量(g)

F＝0.1N H2SO4的濃度

D＝該 Sample 所含的含氮係數，採用種子的含氮係數 6.25 S＝Sample 重(g)

(4)灰分(AOAC 1995)

精秤 2~5 g 之山胡椒粉末(W)放入坩堝中秤重(W1)，置於 105℃

烘箱中乾燥。去除水分後在將樣品放置灰化爐中灰化(550~600℃)直到 樣品粉末成灰白色，降溫後將之移至乾燥器皿中冷卻至室溫後秤重 (W2)。

灰分含量(%)=[(W2-W1)/W] ×100

(5)碳水化合物

碳水化合物的結果利用扣除法得到，將百分之ㄧ百減去實驗得 到的水分、粗脂肪、粗蛋白與灰分之百分比後，則可得到碳水化合物 含量之百分比。