第二章 文獻查證
第二節 實驗方法
標的一：SARS PLpro 重組蛋白之表現與其活性分析
Flowchart I：
Protein induction and purification Transformate to BL-21
PLP activity
Cloning：SARS-PLpro/pET 24a
1. SARS CoV PLpro 基因選殖 5 (核酸 4982-6358)用引子 SARS PLpro-4951-F 以及 SARS PLpro-5840-R 以聚合酵素連鎖反應夾出核酸序列4951-5840，再構築核酸 4951-5840 於 pET24a 中。
接著再將核酸序列 4507-5095 由 cDNA Fragment 4 (核酸 3772-5125) 中用引子SARS PLpro 4507-F 以及 SARS PLpro 5095-R 以聚合酵素連鎖 反應夾出，並利用核酸序列5090-5095 為 Hind III 切位，將
4951-5840-pET24a 及 4507-5095 片段以 Hind III 水解切割，再重新接合至 pET24a 中。
將此構築好的表現載體利用 Heat-shock 的方式轉形(transform)到 DH5α 大腸桿菌中並做篩選。經限制酶水解釋驗確定切割載體之片段大小 正確後，將載體送定序。
2. 聚合酵素連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)
在 0.5ml 微量離心管中，取 cDNA 2ul 作為模版(template)，依序加入 ddH2O 38.5ul，10x pfx amplication buffer 5ul， dNTP 1ul， MgSO4 1ul，
primer F 與 primer R(10mM)各 1ul，最後加入 pfx 0.5ul，總體積 50ul。混 合均勻後加入約 20ul 礦物油再置於聚合酵素連鎖反應器(Thermohybrid)
的反應槽中。先以 94℃作用十分鐘，再以每個週期，94℃作用一分鐘的
DNA 變性反應，58℃作用一分鐘的 DNA 鏈合反應，72℃作用一分鐘二 十秒的DNA 合成反應。進行 40 個反應週期，再用 68℃作用十五分鐘將 DNA 片段補齊。最後設定 4℃保存。將 PCR DNA 產物跑 2% 瓊酯凝膠 (1% agarose gel)進行電泳分析。確定 PCR 產物片段大小正確，以 Spin PCR Clean-Up system 試劑套組(Viogene)將 DNA 純化。
3. 質體純化(plasmid purification)
含有質體的單一菌落，以 3ml LB 在 37℃培養箱搖隔夜後取用出，以
Kit 試劑組(Protech technology)來純化質體。
以 Solution I 溶液 200ul resuspend pellet，加入 Solution II 溶液 200ul 上 下倒置數次後，再加入 Solution III 溶液 200Uul 上下倒置數次，以 12,000rpm 離心 10 分鐘。將 Spin column 插入ㄧ收集管(collection tube)中，
離心後的上清液移至spin column 中，離心一分鐘，移除下層濾液後，加 入700ul Washing solution，離心一分鐘，再移除下層濾液，離心一分鐘。
再將收集管以1.5ml 微量離心管置換，加入 20ul ddH2O 回收質體。
4. 限制酵素水解試驗
PCR 得到的產物，以 Spin PCR Clean-Up system 試劑套組(Viogene) 將 DNA 純化後，以 40ul ddH2O 將 DNA 溶出，加入 10X Reaction buffer(Fermentas) 5ul 及切位的限制酵素 KpnI 與 XhoI 各 2.5ul，使總體積 為 50ul，以 37℃作用 3-5 小時。相對應的質體載體也以同樣的方式進行 限制酵素的水解，來構築實驗所需的表現載體。
將作用 3-5 小時的 DNA 產物跑 1% agarose gel，染 EtBr 十分鐘，在 UV 燈下將正確位置的 DNA 切下，以 Gel Extraction System 試劑套組 (Viogene)將 DNA 純化。
5. 質體構築：DNA 接合(DNA ligation)
質體載體 1ul，加上欲接合的 DNA 7ul，10x ligation buffer 1ul，T4 DNA ligase (Fermentas) 1ul，以 16℃作用至隔夜。
6. 適應性細胞(competent cell)製備：
培養隔夜的 E.coli cell(Top 10、BL21) 2ml，倒入 200ml LB 中，以 37℃
培養箱震盪培養2-3 小時達到 Log-phase，取出後置於冰上 10 分鐘，再以 3000rpm、4℃離心 15 分鐘，倒掉上清液，以 0.1M CaCl2 resuspending pellet。於冰上靜置 30 分鐘後，再以 700 G、4℃離心 15 分鐘，小心倒掉 上清液，再以0.1M CaCl2 1.6ml，glycerol 0.4ml (20%)將 pellet resuspend，
然後靜置於冰上2 小時後，分裝置 1.5ml 離心管中，每管約 200ul 左右。
7. 大腸桿菌之轉形(transformation)
將構築好的質體加入適應性細胞中，混合後置於冰上 30 分鐘。再經 42℃反應 90 秒後，迅速置於冰上 3 分鐘。再加入 800ul 不含抗生素之 LB 培養液，在 37℃培養箱培養 1 小時後，離心去除上清液，將 pellet 均
勻塗抹在含抗生素的LB 培養基上。
8. 重組 SARS PLpro 蛋白之表現與純化
將已選殖到的 SARS PLpro 基因架接到 pET-24a(+)上的 KpnI 及 XhoI 限制酶切位上。再將此構築好的表現載體利用 Heat-shock 的方式轉型 (transform) 到 BL21(DE3)pLysS 大 腸 桿 菌 並 做 篩 選 。 將 篩 選 到 含 有 pET-PLpro 載體的大腸桿菌，培養在 10ml 含 Ampicillin 之 Luria-Bertani broth(LB broth)中經 37℃，250rpm 震盪培養隔夜後，以 1：50 的比例接 種到500ml 含 Ampicillin 之 LB broth 中，至於 37℃，250rpm 震盪 2 小時 後 ， 加 入 IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) ， 使 最 終 達 到 0.1mM，以誘導 T7 RNA 聚合酶表現，促使 pET 載體上基因表現。再經 過16℃，250rpm 震盪培養 5 小時後，將菌液於 4℃、8000rpm 離心 5 分 鐘，以收集細菌。之後加入20ml 的 10mM imidazole，再以超音波擊碎機 (sonicator)將細胞打碎。
利 用 LC 純 化 蛋 白 ， 在 column 中 裝 填 10ml 的 Chelating SepharoseTM(Amersham Biosciences)，將已打碎的細菌溶液離心，上清液 流過鎳離子親和性層析凝膠，先用沖洗緩衝液(100 mM imidazole)沖洗，
再用析出緩衝液(400mM imidazole)將蛋白質析出。再以 12% SDS-PAGE 檢測蛋白質純度。
9. 蛋白質濃度測定
純化後的蛋白質濃度用 Bio-Rad protein assay 染劑(取 1ml，以二次水 稀 釋 到 5ml) 進 行 測 試 。 用 牛 血 清 白 蛋 白 (bovine serum albumin, BSA)1mg/ml 為標準樣品，分別配成濃度為 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml 各20ul，各別加入 1ml 染劑中，算出線性迴歸公式，作出標準曲線。再 取蛋白質樣本 20ul 加入 1ml 染劑，測 OD595nm的吸光值，並分析蛋白質 濃度。
10. 蛋白質之電泳分析(SDS-PAGE)：
實驗所使用的電泳裝置為 Bio-Rad 蛋白質電泳槽。待鑄膠裝置組合
後，先加入分離膠體溶液(Separating gel)，再加入二次水將膠體水平壓 平。待凝固後倒掉二次水並擦拭乾後，加入集膠溶液(Stacking gel)，插上 齒模，膠體凝固後放置於電泳槽中，注入電泳緩衝液(Running buffer)。
將蛋白質樣本與2x Sample loading buffer 以 1：1 比例混合均勻，以 100℃加熱五分鐘後，置於冰上冷卻。待冷卻後取 15ul 注入樣本槽，並注
入蛋白值標準溶液以對照蛋白質分子大小。先以 80V 進行電泳，待藍色
染劑跑到分離膠體時，調整電壓至110V 繼續電泳，直到藍色染劑跑到膠
體底部，關閉電源取出膠體，以Commassie brilliant blue 染色五至十分鐘
11. 西方墨點法(Western blotting)：
實驗所使用的電泳裝置為Bio-Rad 半乾式電泳轉漬槽。將 SDS-PAGE 切除集膠體的部份後，將膠片浸泡在轉漬緩衝液(Transfer buffer)中，取轉 印紙(硝化纖維紙，nitrocellulose paper)切成膠片大小後浸在轉漬緩衝液 中，先在Bio-Rad 半乾式電泳轉漬槽上鋪上三張以轉漬緩衝液浸濕的 3M 濾紙後，依序鋪上溼潤的轉印紙、濕潤的膠片後，再鋪上三張以轉漬緩 衝液浸濕的 3M 濾紙(過程中需趕走每層間的氣泡)，以 200mA 轉印一小 時。
轉印後，將轉印紙放入含有5% 脫脂牛奶的 1x TBST 中，室溫搖晃
一小時進行 Blocking，以填平轉印紙上沒有蛋白質轉印的空間。倒掉
Blocking 的牛奶後，加入第一次抗體 anti-T7 tag(1：1000 稀釋)，置於室
溫搖盪反應一至二小時或於4℃反應至隔夜。倒掉或回收第一次抗體重複
使用，以 1x TBST 清洗七分鐘三次後，加入第二次抗體 anti-mouse Co-AP(1：1000 稀釋)，置於室溫搖盪反應一至二小時。倒掉或回收第二 次抗體後，以1x TBST 清洗七分鐘三次，加入 NBT/TCIP 顯色劑，反應 至呈色(約十至二十分鐘)，加入二次水洗去顯色劑以中止反應，晾乾後保 存。
12. SARS PLpro 活性分析
利用 SARS PLpro 會辨識並切割 LNGG 片段之特性，設計出兩個活 性分析試驗。
(1) 利用 HRP(Horseradish Peroxidase)為基質(substrate)測定吸光值：
因 HRP 序列中帶有 LAGG 與 LSGG，若 SARS PLpro 具有活性，則可 將HRP 切割成不具活性之片段，以 HRP 之呈色系統反應則在 O.D405nm 時其吸光下降，可作為判讀SARS PLpro 是否具有活性。
¾ ELISA：HRP substrate + PLpro → Incubate at 37 , 1hr℃
→ ABTS/H2O2
→ O.D.405nm
(2) SARS PLpro 切割 HRP 活性試驗
利用 HRP(Horseradish Peroxidase)作為 substrate，取 5 μg 與不同濃度 之 PLP(0、0.02、0.04、0.06 μg)混合，於 37℃下反應 6 小時，將蛋白樣 本與不含SDS 之 2X Sample loading dye 混合，取 5ul 注入 12% Native gel
樣本槽，並將電泳槽置於冰上。先以 80V 進行電泳，待藍色染劑跑到分
離膠體時，調整電壓至110V 繼續電泳，直到藍色染劑跑到膠體底部，關
→TMB menbrane peroxidase substrate 閉電源取出膠體，再加入HRP 呈色劑 TMB membrane peroxidase substrate 產生藍色區域。 當藍色區域變小變淡，則表示具活性之 HRP 較少，即 被SARS PLpro 切割，可判讀 SARS PLpro 是否具有活性。
¾ Native gel：HRP substrate + PLpro
標的二：構築 SARS PLpro 表現細胞
Flowchart II：
Cloning：SARS-PLpro-HSV tag/pcDNA3.1 His C
Western blotting Transfect to HL-CZ
Immuno-fluorescence staining
1. 構築 SARS PLpro 之細胞內表現載體 將 cDNA 與設計的引子 SARS PLpro-F
5′- CTC CGA ATT CAA CTC TCT AAA TGA GCC GCT TGT C -3′ 以及 SARS PLpro-R
5′- GAG GCT CGA GAT CCT CTG GGT CTT CAG GAG CGA GTT CTG GCT GTA CGA CAC AGG CTT GAT GGT TGT AGT G - 3′，利用聚合酶連 鎖反應(PCR)將SARS PLpro基因從cDNA選殖出來。其中Reverse之引子帶 有HSV-tag(畫底線處)。
將已選殖到的 SARS PLpro 基因架接到 pcDNA3.1 His C(+)上的 Eco RI 及 XhoI 限制酶切位上。再將此構築好的表現載體利用 Heat-shock 的方 式轉型(transform)到 DH5α 大腸桿菌中並做篩選。經限制酶水解釋驗確定 切割載體之片段大小正確後，將載體素定序。
2. DNA 轉染(DNA transfection)
細胞的轉染是利用 lipofection 技術，Arrest-In transfection reagent 試 劑(Open BIOSYSTEM)，利用 Direct Hydrophilic Conjugation(DHC)技術來 提高在細胞株達到最佳的轉殖效率。DHC 技術合成的多種修飾後的 polymer 所組成。可提供 DNA /Arrest-InTM complexes 做最有效的結合，也 可以降低cytotoxicity，提高轉殖的結果。
懸浮細胞轉染實驗當天將 3ug SARS PLpro 細胞內表現質體與 pEGFP 以 9：1 比例混合，以 500ul 不含胎牛血清的培養液稀釋；將 15ul Transfection Reagent 以 500ul 不含胎牛血清的培養液稀釋，再將以上兩者 混合均勻靜置於室溫20-30 分鐘，使得 DNA /Arrest InTM complexes 形成。
將要轉染的細胞移去舊的培養液，以 PBS 清洗，將 DNA /Arrest InTM complexes 加入，於 37℃，5% CO2 下培養 4-5 小時後，再更換含有胎牛 血清的培養液繼續培養48-72 小時。
3. 細胞內分子之螢光 IF (Intracelluar fluorescence staining)
收集HL-CZ細胞培養液以1500 rpm離心5分鐘，沉降之細胞以PBS
（Phosphate buffer saline）溶液清洗後再離心，將細胞以10 % methanol 浸 泡並置於-20°C 固定l 小時，再以PBS 清洗離心，倒掉上清液，在PBS 中加入anti-His tag (1:5000)或anti-HSV tag(1：5000)，在室溫下反應60分鐘 後重複清洗離心的步驟。再加入anti-Rhodamin (1:5000) 避光60分鐘，最 後經兩次以上的清洗去除多餘的染劑後加入少許PBS 使細胞懸浮其中，
將懸浮液倒在培養盤中於螢光顯微鏡下觀察、拍照。
4. 西方墨點法(Western blotting)：
將 Mock cell(HL-CZ-pEGFP)與 SARS PLpro 表現細胞離心、收集下 來，以 PBS 清洗後，100℃加熱 5 分鐘後，以 SDS-PAGE 膠體電泳分離 但白後，再將SDS-PAGE 轉印到轉印紙後，以 anti-HSV tag(1：1000 稀釋)
為第一次抗體，置於室溫搖晃反應一至二小時或於4℃反應至隔夜，再以
anti-mouse Co-AP(1：1000 稀釋)為第二次抗體，置於室溫搖盪反應一至 二小時後，加入NBT/TCIP 顯色劑，反應至呈色(約十至二十分鐘)，加入 二次水洗去顯色劑以中止反應，晾乾後保存。
標的三：SARS PLpro 表現細胞經干擾素刺激前後之訊息分析
Flowchart III：
Signal pathway assay：cis-acting plasmid
Real-time PCR： PKR mRNA
ELISA：Interferon α expression
1. 細胞內訊息傳遞之分析
利 用 Luciferase 報 告 基 因 質 體 pISRE(interferon-stimulated response element)-Luc，pNF-κB-Luc等，接受訊號傳遞所活化的轉錄 因子結合後，即可表現Luciferase。依Luciferase活性，可快速檢測及 定量（圖3-1）。各種Enhancers的活化可以顯示何訊息傳遞途徑與細胞 激素或細胞凋亡反應，如NF-κB enhancer可檢測經IKK/NF-κB途徑，
引發Stress及Cell cycle的反應；而ISRE可檢測經JAK/STAT途徑，引發 Inflammation及 cell cycle的 反 應 。 而 共 同 轉 染 所 送 入 細 胞 之 質 體 pRenilla-Luc則作為Internal control以比對出Luciferase之表現程度。
引發Stress及Cell cycle的反應；而ISRE可檢測經JAK/STAT途徑，引發 Inflammation及 cell cycle的 反 應 。 而 共 同 轉 染 所 送 入 細 胞 之 質 體 pRenilla-Luc則作為Internal control以比對出Luciferase之表現程度。