標的一：SARS PLpro 重組蛋白之表現與其活性分析 1. SARS PLpro 之質體構築
將 SARS PLpro 之序列片段以聚合酶連鎖反應夾出，得到大小約 1.3kb 之SARS PLpro 產物(圖 4-1-A )。最後以限制酵素水解試驗確定所構築之 pET24a 載體中所帶之片段大小為 1.3kb(圖 4-1-B )後，再送定序確定為 SARS PLpro 之序列。
2.SARS PLpro 之表現及純化
將帶有 SARS PLpro 片段之 pET 載體再轉型到大腸桿菌 BL21(DE3) 中，經過不同濃度IPTG 誘導後，將細菌粗萃取物利用 SDS-PAGE 分析，
得到表現在不可溶性蛋白部份的 SARS PLpro 蛋白，分子量約 55kDa(圖 4-2-A.B.)。
再將 SARS PLpro 蛋白大量表現後，利用 LC 純化並重摺疊蛋白，使 SARS PLpro 恢復到具活性的構型，並將純化到的蛋白以 SDS-PAGE 及 Western blotting 分析(圖 4-3-A.B.)，可以在分子量約 55kDa 的位置得到單 一的色帶。
3. SARS PLpro 活性分析
利用 SARS PLpro 會辨識並切割 LNGG 片段之特性，設計出兩個活 性分析試驗。
(1) 利用 HRP(Horseradish Peroxidase)做為基質(substrate)：
因 HRP 序列中帶有 LAGG 與 LSGG，若 SARS PLpro 具有活性，則可 將HRP 切割成不具活性之片段，以 HRP 之呈色系統反應則在 O.D405nm 時其吸光下降，可作為判讀SARS PLpro 是否具有活性。發現在有 SARS PLpro 蛋白存在下，隨著 SARS PLpro 濃度上升，HRP 在 O.D405nm 吸光 值亦隨之下降，可得知SARS PLpro 具有活性(圖 4-4)。
(2) SARS PLpro 切割 HRP 活性試驗
利用 HRP(Horseradish Peroxidase)作為 substrate，取 5 μg 與不同濃度 之PLP(0、2、4、6 μg/ml)混合，於 37℃下反應 6 小時，以 12% Native gel 將蛋白展開後，再加入HRP 呈色劑 TMB membrane peroxidase substrate 產生藍色區域。當SARS PLpro 濃度上升，藍色區域則隨之變小變淡，表 示具活性之HRP 較少，即被 SARS PLpro 切割，可得知 SARS PLpro 具 有活性。(圖 4-5)
標的二：構築SARS PLpro 表現細胞 1. SARS PLpro 之細胞表現質體構築
以設計帶有 HSV tag 之反股引子將 SARS PLpro 以 PCR 方式夾出，
得到大小約 1.3kb 之片段(圖 4-6-A)，最後再以限制酵素水解試驗確定所 構築之pcDNA3.1 載體中所帶之片段大小為 1.3kb，(圖 4-6-B )，再送定序 確定為SARS PLpro 之序列。
2.以免疫螢光染色做細胞內蛋白表現之確認
(1) 利用 Anti-His tag 作為質體是否送入細胞內之確認：
將細胞以福馬林固定、甲醇打洞後，以 anti-His tag 作為一抗，在室溫 反應一小時後，加入anti-mouse Rhodamin 作二抗，室溫避光反應一小時 後 ， 以 螢 光 顯 微 鏡 觀 察( 圖 4-7) ， 可 發 現 到 不 論 是 Mock 細 胞 (HL-CZ-pEGFP+pcDNA3.1)或是 SARS PLpro 表現細胞都可以看到紅色螢 光之 Rhodamin，表示質體 pcDNA3.1 有送入細胞中，另外，可以看到 pEGFP 所呈現之綠光，可知 pEGFP 亦有在細胞中表現。
(2) 利用 Anti-HSV tag 作為質體是否送入細胞內之確認：
將細胞以福馬林固定、甲醇打洞後，以 anti-HSV tag 作為一抗，在室 溫反應一小時後，，加入anti-mouse Rhodamin 作二抗，室溫避光反應一
可以看到紅色螢光之Rhodamin，表示 SARS PLpro 之 HSV tag 被染色，
即SARS PLpro 有送入細胞內表現。
3. 西方墨點法確認細胞內表現 PLpro
將構築之 SARS PLpro 細胞株收下部份細胞，以 12% SDS-PAGE 將 蛋白展開。再將SDS-PAGE 轉印到 NC PAPER 上後，以 anti-HSV tag 做 一抗室溫反應2 小時後，加入二抗 anti-mouse Co-AP 室溫反應 2 小時，
加入NBT/TCIP 顯色劑，反應至呈色(約十至二十分鐘)，加入二次水洗去 顯色劑以中止反應，晾乾後保存。
可以發現 SARS PLpro 表現細胞在 52kDa 位置有表現，而 Mock 細胞 (HL-CZ-pEGFP+pcDNA3.1)則無(圖 4-9-A )，可以得知 SARS PLpro 細胞 確實有表現SARS PLpro 蛋白。
同樣以西方墨點法確認細胞是否表現 SARS PLpro 蛋白，將帶有 Anti-His tag 之奈米金抗體與 NC PAPER 結合反應，可以在 SARS PLpro 表現細胞之52kDa 位置有 SARS PLpro 蛋白色帶可觀察到，而 Mock 細胞 (HL-CZ-pEGFP+pcDNA3.1)則無(圖 4-9-B )。
另外以 β-actin 為一抗反應，以 anti-mouse Co-AP 為二抗呈色，作為 西方墨點法之Internal control。
標的三：SARS PLpro 表現細胞經干擾素刺激前後之訊息分析 1. 細胞內訊息傳遞之分析
將 Mock 細胞(HL-CZ-pEGFP+pcDNA3.1)與 SARS PLpro 表現細胞分 別再以9：1 Co-transfection 帶有 reporter gene 之質體(如：ISRE、NFκB) 與帶有Renilla 之質體。
(1) 分析 Interferon α 反應前後之 ISRE 表現程度
將已 Co-transfection ISRE 之 Mock 細胞與 SARS PLpro 表現細胞分別 分為兩組，一組加入 interferon α，另一組則維持不變，反應四小時後，
測其Luciferase 表現量。
結果發現 Mock 細胞在加入 interferon α 前後其 ISRE 表現量上升 66 倍，SARS PLpro 表現細胞在加入 interferon α 前後其 ISRE 表現量上升 31 倍，mock cell 與 HL-CZ-SARS-PLpro 在經過 interferon α treat 後，
HL-CZ-SARS-PLpro 只有 mock cell 的 39 %，即 SARS PLpro 有抑制 interferon α 刺激 ISRE 之表現(圖 4-10)。
(2) 分析 LPS 反應前後之 NFκB 表現程度
將已 Co-transfection NFκB 之 Mock 細胞與 SARS PLpro 表現細胞分
別分為兩組，一組加入 LPS，另一組則維持不變，反映四小時後，測其
Luciferase 表現量。
結果發現 Mock cell 在 treat LPS 前後 NFκB 訊號有約 1.3 倍的上升，
HL-CZ-SARS-PLpro 在 treat LPS 前後 NFκB 訊號約下降成為 0.8 倍，而 mock cell 與 HL-CZ-SARS-PLpro 在經過 LPS treat 後，HL-CZ-SARS-PLpro 只有mock cell 的 33 %，即 SARS PLpro 有抑制 LPS 刺激 NFκB 之表現(圖 4-11)。
2. 即時定量聚合酶連鎖反應（real-time polymerase chain reaction）
由數據分析發現，Mock cell 經過 Interferon α 反應四小時後之 PKR 訊息較未以Interferon α 反應之數值上升約 3500 倍，但 SARS PLpro 表現 細胞在經過Interferon α 反應後僅較未加入 Interferon α 反應之數值上升約 500 倍，即 SARS PLpro 表現細胞能較 Moce cell 抑制 Interferon α 誘導之 下游基因PKR 約 7 倍之表現程度(圖 4-12)。
3. 酵素連結免疫吸附分析法分析 interferon α 表現程度
將等量之 Mock 細胞與 SARS PLpro 細胞培養至 96 孔盤上，各別加 入interferon β 反應兩天後，將 96 孔盤之細胞固定並打洞，以 anti-interferin α 作為一抗，再以 anti-mouse Co-AP 做為二抗，最後以 p-Nitrophenyl phosphate liquid substrate 呈色，測其 O.D405nm 之吸光值。
Mock cell 在加入 interferon β 反應後，其 interferon α 表現量都有逐步
量約為Mock 細胞之 57%，在處理 interferon β 1000U/ml 後，SARS PLpro 表現細胞之interferon α 表現量約為 Mock 細胞之 50%，在處理 interferon β 3000U/ml 後，SARS PLpro 表現細胞之 interferon α 表現量約為 Mock 細 胞之45%(圖 4-13)，表示 SARS PLpro 表現細胞其受到 interferon β 反應後 不如Mock 細胞會有 interferon α 表現增加的現象，即 SARS PLpro 細胞 有抑制type I interferon 之刺激、生成之現象。
PART IV：2D electrophoresis profile 1.二維電泳分析
以二維電泳分析之差異 (圖 4-14-1) ，結果發現，在 Mock cell 共分離 出約364 個蛋白質點，在經過 Interferon α 刺激過後約有 366 個蛋白質點，
兩者間蛋白質點位置表現一致之比例達99.17%，在 SARS PLpro 表現細 胞則分離出405 個蛋白質點，經過 Interferon α 刺激過後約有 398 個蛋白 質點，兩者間蛋白質點位置一致之比例達96.39%。
而兩兩比對 Mock cell 與 SARS PLpro 表現細胞之蛋白質點，則有約 80.36%蛋白質點位置一致，經過 Interferon α 刺激過後約 79.32%蛋白質點 位置一致(表 4-1-1)。並以 Mock cell+IFN 為 Reference Gel，將表現量有差 異之蛋白質點列出圖(圖 4-14-2)，其餘尚在分析中。
發現同種細胞在加入 Interferon 前後之蛋白質點表現位置之相同比例 皆達到90%以上，即其同種細胞之電泳再現性存在。而在加入 Interferon 後會造成其蛋白質表現量之上升或下降之差異。
PART V：Identified MASS profile
將以 Mock cell+IFN 為 Reference Gel 比對，表現量有差異之蛋白質 點以質譜儀分析，並以其數值比對出可能之蛋白質點為何種蛋白(表 4-2)。
其餘差異之蛋白質點尚在分析中。